李 強(qiáng) 李媛媛* 朱 楠 高柱仙 李添君 周 彤 馬玉龍

1(寧夏大學(xué)省部共建煤炭高效利用與綠色化工國家重點實驗室， 銀川 750021)2(寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 銀川 750021)

1 引 言

手性藥物對映體通常在藥理活性、代謝、穩(wěn)定性和毒性等方面具有顯著性差異，當(dāng)手性藥物作為外消旋混合物給藥時，一種對映體具有治療所需的藥理學(xué)作用，而另一種對映異構(gòu)體不具有作用甚至有害[1]。由于手性藥物對于生物體的強(qiáng)烈作用以及防止手性藥物作為外消旋混合物直接銷售，手性藥物的有害對映體部分必須被徹底分離[2]。因此對映體分離在制藥領(lǐng)域具有重要意義[3,4]，是分析化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。液相色譜是最常用的對映體拆分方法之一，目前手性色譜固定相根據(jù)其化學(xué)類型主要包括刷型[5]、環(huán)糊精(CD)及其衍生物[6,7]、大環(huán)抗生素[8]、纖維素[9]、蛋白質(zhì)[10]和金屬有機(jī)骨架(MOF)[11,12]等。

石墨烯(G)由于具有超高的比表面積和高度離域π電子共軛體系，對芳香族化合物以及其它具有共軛結(jié)構(gòu)的化合物表現(xiàn)出較強(qiáng)的吸附作用和較高的吸附容量[13～16]。氧化石墨烯(GO)不僅含有豐富的含氧官能團(tuán)，而且它的大離域電子系統(tǒng)可以為碳環(huán)結(jié)構(gòu)提供強(qiáng)大的親和力，碳環(huán)結(jié)構(gòu)在藥物、污染物和生物分子中的應(yīng)用廣泛。通過共價鍵合的方式制備GO修飾的色譜柱中，GO極大地提高了固定相的比表面積、改善了所制備色譜柱的分離性能，π-π堆積作用、疏水作用和氫鍵作用等使得烷基苯、中性多環(huán)芳烴、苯酚類化合物、苯胺類化合物以及核酸堿基等均得到良好分離效果[17,18]。β-環(huán)糊精(β-CD)是具有獨特疏水性空腔的環(huán)狀低聚糖，具有大量分子的穩(wěn)定包合物的優(yōu)異能力[19,20]。β-CD進(jìn)行手性拆分主要依賴于內(nèi)部空腔對分析物的包合作用和功能基團(tuán)與分析物之間的相互作用。β-CD的包合作用、空腔大小和分析物結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，當(dāng)分析物的疏水基團(tuán)與空腔匹配較好時，對映體選擇性較好，手性識別能力也較高[21～23]。將(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷-β-環(huán)糊精(SH-β-CD)作為手性選擇劑共價鍵合到SiO2@Au表面，制備基于SiO2@Au-SH-β-CD的色譜柱用于手性分離，實現(xiàn)了多種結(jié)構(gòu)不同對映體的分離[24]。

親水作用色譜(HILIC)是一種以極性固定相(如硅膠、氨基鍵合硅膠等)及含高濃度極性有機(jī)溶劑和低濃度水溶液為流動相的色譜模式。作為對反相色譜的補(bǔ)充和正相色譜的替代，HILIC已經(jīng)顯示出巨大的優(yōu)勢和潛力，成為分析極性和親水性化合物的一種強(qiáng)有力的色譜技術(shù)[25～28]。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

TENSOR-27型傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀(德國布魯克公司); HT7700型透射電子顯微鏡(TEM，日本日立高新技術(shù)公司); Vario EL cube型元素分析儀(德國Elementar公司); SETARAM SETSYS16型綜合熱分析儀(法國塞塔拉姆公司)，以10℃/min的升溫速度從室溫至700℃; JSM-7500F型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM， 日本電子株式會社); FL2200-2型高效液相色譜儀(浙江福立分析儀器有限公司)。

硅膠(日本富士硅化學(xué)株式會社, 5 μm, 孔徑120?); GO(湖南豐化材料發(fā)展有限公司); 甲醇(色譜級)、乙腈(色譜級)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯亞砜(SOCl2)、甲苯、乙醇、丙酮、苯甲酸和苯甲醇(天津大茂化學(xué)試劑廠);β-CD、3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(阿法埃莎(中國)有限公司); 1-苯基乙醇、鹽酸普萘洛爾、安息香、布洛芬、吡喹酮、R,S-雌馬酚、酪氨酸、胸腺嘧啶、肌苷、鳥苷和腺苷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。除特殊標(biāo)明外，其它試劑均為分析純。

2.2 實驗方法

2.2.3β-CD-GO@SiO2的制備將2.38 g GO@SiO2和20 mL SOCl2混合, 75℃下加熱回流10 h，加入2.00 gβ-CD和30 mL DMF，在N2保護(hù)下加熱回流40 h。用DMF、蒸餾水洗滌3次后，干燥，得到手性固定相。β-CD-GO@SiO2固定相制備示意圖如圖1所示。

圖1 β-CD-GO@SiO2固定相制備流程圖Fig.1 Schematic diagram for preparation of β-CD-GO@SiO2 stationary phase. β-CD, β-Cyclodextrin; GO, graphene oxide; APTMS, aminopropyltrimethoxysilane; DCC, dicyclohexylcarbodiimide

2.3 色譜條件

將β-CD-GO@SiO2在60 MPa壓力下用純甲醇作為勻漿液和頂替液裝入不銹鋼管(150 mm×4.6 mm i.d.)中。所有色譜分離均在配有UV-vis檢測器的FL2200-2型HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行。流動相流速為1 mL/min， 柱溫為25℃。 根據(jù)公式(1)計算保留因子(k′)。

(1)

其中，t0是1,3,5-三叔丁基苯在β-CD-GO@SiO2柱上的保留時間(2.024 min)，t是柱上對映體的保留時間。

根據(jù)公式(2)計算選擇性因子(α)。

(2)

3 結(jié)果與討論

3.1 β-CD- GO@SiO2材料表征

表1 元素分析結(jié)果

Table 1 Elemental analysis results

化合物Compound元素含量 Element content (%)NCHNH2SiO22.347.062.58GO@SiO22.149.112.20β-CD- GO@SiO23.0822.583.28

圖2 紅外光譜圖: (a) NH2-SiO2，(b)GO，(c) GO@SiO2，(d)β-CD和(e) β-CD-GO@SiO2Fig.2 Fourier transform-infrared (FT-IR) spectra of (a), (b) GO, (c) GO@SiO2, (d) β-CD and (e) β-CD-GO@SiO2

圖3 GO@SiO2的掃描電鏡圖(A)和透射電鏡圖(C); β-CD-GO@SiO2的掃描電鏡圖(B)和透射電鏡圖(D)Fig.3 Scanning electron microscopy (SEM) (A) and transmission electron microscopy (TEM) (C) images of GO@SiO2; SEM (B) and TEM (D) images of β-CD-GO@SiO2

圖4 (a) GO@SiO2 和 (b) β-CD- GO@SiO2的熱重曲線Fig.4 Thermogravity curve of (a) GO@SiO2 and (b) β-CD-GO@SiO2

3.2 β-CD-GO@SiO2固定相在手性分離中的應(yīng)用

3.2.17種手性對映體物質(zhì)的分離β-CD-GO@SiO2色譜柱分離4種典型對映體的色譜圖如圖5所示。用k2、α和分離度(Rs)作為參數(shù)來評價該固定相的分離情況，如表2所示。由分離數(shù)據(jù)可知，7種手性物質(zhì)得到不同程度的分離，并且對映體在固定相上的保留強(qiáng)，分離度未必高，對映體的結(jié)構(gòu)對手性分離有很大影響。1-苯基乙醇的Rs>2，可能是因為1-苯基乙醇空間位阻較小。含苯環(huán)部分相對疏水容易進(jìn)入空腔內(nèi)部而極性較大的含手性部分處于空腔兩側(cè)[4,30]，手性中心與β-CD匹配較好，分離效果更為明顯。安息香、R,S-雌馬酚和普萘洛爾在固定相上的Rs>1.5，從結(jié)構(gòu)上看，它們都有多個苯環(huán)和羥基，一方面可增強(qiáng)GO上共軛體系與苯環(huán)化合物的π-π堆積作用，有利于靠近β-CD，并容易進(jìn)入β-CD內(nèi)腔產(chǎn)生包合作用，促進(jìn)分離; 另一方面，GO和β-CD上的羧基與羥基可與分析物形成氫鍵作用，使得Rs增加。與未鍵合GO的固定相研究相比[31,32],鍵合GO在一定程度上能提高對映體分離能力，GO參與并促進(jìn)了手性分離。

圖5 4種典型手性化合物的色譜圖：(A)1-苯基乙醇，(B)普萘洛爾，(C)安息香，(D)酪氨酸。流動相比例及檢測波長同表2Fig.5 Chromatograms of four typical chiral compounds: (A) 1-phenylethanol, (B) propranolol, (C) benzoin and (D) tyrosine. The mobile phase and detection wavelength are the same as in Table 2

表2 手性化合物分離數(shù)據(jù)

Table 2 Separation data for chiral compounds

分析物Analyte檢測波長Detection wavelength(nm)流動相比例Mobile phase(%) β-CD-GO@SiO2k2αRs安息香 Benzoin254甲醇-乙腈-水 Methanol-acetonitrile-water,(30∶30∶40, V/V)20.932.101.87酪氨酸 Tyrosine278甲醇-乙腈-水 Methanol-acetonitrile-water(0.1% TEAAa), (40∶40∶20, V/V)7.202.641.29R,S-雌馬酚R,S-equol209乙腈-異丙醇Acetonitrile-isopropanol (60∶40, V/V)1.9438.81.59布洛芬 Ibuprofen254甲醇-水(0.1% 乙酸銨)Methanol-water (0.1% ammonium acetate)(56∶44,V/V)1.011.800.93普萘洛爾 Propranolol254甲醇-水(0.1%乙酸銨) Methanol-water(0.1% ammonium acetate) (64∶36, V/V)1.082.161.56吡喹酮 Praziquantel254甲醇-乙腈-水 Methanol-acetonitrile-water(40∶40∶20, V/V)2.921.811.291-苯基乙醇1-Phenylethanol254甲醇-乙腈-水 Methanol-acetonitrile-water(25∶25∶50,V/V)3.192.442.17a: TEAA, 乙酸三乙胺緩沖液(Triethylamine acetate duffer).

3.2.2溫度對手性分離的影響對映體拆分熱力學(xué)行為的研究是深入了解手性識別機(jī)理和色譜柱穩(wěn)定性的有效手段。如下Van′t Hoff equation公式[33]顯示了分析物從流動相轉(zhuǎn)移到固定相的焓變(ΔH)和熵變(ΔS)。其中R，T和Ф分別是氣體常數(shù)、絕對溫度和相比。

(3)

在采用高效液相色譜分離對映體的研究中，大多數(shù)分析物在填充柱上的保留和選擇性受柱溫影響，且溶質(zhì)與β-CD的結(jié)合常數(shù)受溫度的影響也很大。在低溫下，結(jié)合常數(shù)增大，但是傳質(zhì)遞變會變差，所以降低柱溫可使β-CD鍵合相的選擇性增大，同時也可能使分離度改善。在20.0～60.0℃的溫度范圍內(nèi)對1-苯基乙醇在手性柱上的拆分情況進(jìn)行探究，分離色譜圖如圖6A所示。隨著柱溫升高，兩種1-苯基乙醇對映異構(gòu)體的保留時間減少，導(dǎo)致k′、α和Rs值降低， 說明1-苯基乙醇的分離過程是放熱的。圖6B中的對映體Van′t Hoff equation曲線表明，1-苯基乙醇分離線性關(guān)系良好(R2>0.996)，說明手性柱的構(gòu)象和對映選擇性機(jī)制與溫度無關(guān)。從lnk′-1/T直線的斜率和截距得到ΔH和ΔS(表3)。隨溫度升高，1-苯基乙醇保留時間減小，說明溫度對兩個對映體的作用機(jī)理相似，都是焓值驅(qū)動原理。

圖6 (A) 1-苯基乙醇在β-CD-GO@SiO2上的色譜分離圖，使用甲醇-乙腈-水(27.5∶27.5∶45, V/V)作為流動相，在紫外波長254 nm處檢測; (B) 在β-CD-GO@SiO2上分離1-苯基乙醇的lnk′-1/T圖Fig.6 (A) Separation chromatograms of 1-phenylethanol on β-CD-GO@SiO2, methanol-acetonitrile-water (27.5∶27.5∶45, V/V) as the mobile phase with UV detection at 254 nm; (B) lnk′-1/T plot for separation of 1-phenylethanol on β-CD-GO@SiO2

3.3 β-CD-GO@SiO2固定相在親水色譜中的應(yīng)用

3.3.1流動相和柱溫對分析物保留的影響在HILIC中，流動相是影響極性及親水性分析物保留的最主要的因素。分別選擇乙腈和乙腈/甲醇作為有機(jī)相考察流動相對4種核苷小分子保留的影響。如圖7A和7C所示，當(dāng)有機(jī)相含量從50%增加到80%時，4種分析物的保留逐漸增加，當(dāng)有機(jī)相含量增加至90%或以上時， 分析物保留急劇增加，這是典型的HILIC保留特征。對比圖7A和7C發(fā)現(xiàn)，隨著有機(jī)改性劑甲醇的加入，4種分析物的保留顯著減弱，這是由于有機(jī)改性劑甲醇是質(zhì)子化溶劑，與溶質(zhì)分子相互競爭與β-CD和GO作用，使分析物與固定相之間的作用減弱，洗脫能力增強(qiáng)。但有機(jī)改性劑甲醇的加入，使得材料的親水作用增強(qiáng)，對于4種分析物的分離具有明顯的促進(jìn)作用。

表3 ΔH, ΔS, ΔG(25℃), andR2的值

Table 3 Values of ΔH, ΔS, ΔG(25℃) andR2

圖7 不同流動相和溫度對分析物保留的影響：(A)流動相為乙腈-水; (B)流動相為乙腈-水(90∶10, V/V)； (C)流動相為乙腈-甲醇-水; (D)流動相為乙腈-甲醇-水(45∶45∶10, V/V)Fig.7 Effect of different mobile phase and temperature on the retention: (A) acetonitrile-water; (B)acetonitrile-water (90∶10, V/V); (C) acetonitrile-methanol-water; (D) acetonitrile-methanol-water (45∶45∶10, V/V)

在HILIC中，柱溫的改變可以影響擴(kuò)散系數(shù)、流動相的粘度和分析物在流動相和固定相之間的轉(zhuǎn)移焓變，從而影響分析物的保留。以上述4種核苷分子為分析物，分別以乙腈-水(90∶10,V/V)和乙腈-甲醇-水(45∶45∶10,V/V)為流動相，通過改變溫度(20～60℃)研究溫度對核苷類物質(zhì)保留的影響。如圖7B和7D所示，所有分析物的保留時間均隨著柱溫增加而減小。由于保留時間在很大程度上取決于柱溫，當(dāng)柱溫增加時，分析物在流動相和固定相表面富集水層之間的分配系數(shù)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致保留時間減小，說明分析物在色譜柱的保留行為是放熱過程。

3.3.2流動相pH值對分析物保留的影響流動相pH值也是影響分析物保留的因素之一。選擇苯甲酸、布洛芬、腺苷、胞嘧啶、苯甲醇作為目標(biāo)分析物，考察它們在pH為2.8～6.3之間的保留情況。如圖8A所示， pH值在2.8～5.3時，苯甲酸和布洛芬的保留值隨著流動相pH值的增大而增大，由于它們的pKa分別為4.2和4.6，當(dāng)pH值從2.8增加到5.3時，苯甲酸和布洛芬由分子狀態(tài)逐漸離解，與固定相之間的靜電作用增強(qiáng)，導(dǎo)致保留增加，當(dāng)pH值繼續(xù)增加到6.3時，苯甲酸和布洛芬完全離解，離子狀態(tài)不發(fā)生變化，故而保留值不發(fā)生顯著變化。胞嘧啶和腺苷在研究的pH值范圍內(nèi)，保留值隨著流動相pH值的減小而增大。這是由于腺苷和胞嘧啶是堿性物質(zhì)，當(dāng)pH值從6.3降低到2.8時，它們逐漸質(zhì)子化，與固定相之間靜電吸引作用增強(qiáng)導(dǎo)致保留增強(qiáng)。pH值的變化對苯甲醇的保留影響不大。

圖8 (A) 流動相pH對分析物保留的影響; (B) 4種極性生物分子在HILIC模式下的色譜分離圖Fig.8 (A) Effect of mobile phase pH on the retention; (B)Separation chromatogram of four polar biomolecules on hydrophilic interaction chromatography (HILIC)

3.3.34種核苷小分子的分離圖8B是流動相為甲醇-乙腈-水 (45∶45∶10,V/V)、溫度為25℃時，4種生物分子的色譜分離圖，在此條件下，4種分析物實現(xiàn)了基線分離。由分子式可知，胞嘧啶和胸腺嘧啶分子結(jié)構(gòu)相似，但胞嘧啶多1個氨基，與β-CD形成氫鍵作用，因此吸附作用增強(qiáng)但解析時間增加，導(dǎo)致保留時間變長且峰形變寬; 而胸腺嘧啶相對于胞嘧啶，與β-CD結(jié)合力弱，容易被洗脫，因而保留時間短而峰形窄。肌苷與鳥苷的分子式結(jié)構(gòu)相似，而鳥苷多1個氨基，因而肌苷更容易洗脫。分析物按照胸腺嘧啶、肌苷、鳥苷、胞嘧啶的順序依次被洗脫，按照HILIC機(jī)理，溶質(zhì)按極性增大的次序依此被洗脫。由于溶質(zhì)在色譜上的保留是十分復(fù)雜的過程，既有在有機(jī)相和富水層之間的分配，也有氫鍵、偶極作用和靜電作用等一些復(fù)雜作用。因此，分析物的洗脫順序與其分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究成功制備了β-CD-GO@SiO2型固定相并應(yīng)用于7種手性對映體的拆分，結(jié)果表明，GO和β-CD在手性識別過程中具有協(xié)同作用，氫鍵、π-π堆積作用在手性識別中具有改善分離的作用。此外，此固定相還可以作為親水色譜固定相，用于極性和親水性小分子的分離。這種固定相實現(xiàn)了一根柱子兩種分離模式，使用靈活，并且可以擴(kuò)大分析樣品的范圍，具有良好的應(yīng)用潛力。