李德文 楊 超 付金穎 劉 英 于莉莉 付玉杰

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室， 哈爾濱 150040)

1 引 言

紫杉醇(Taxol)是從紅豆杉屬(TaxusLinn.)植物中分離出的一種二萜類生物堿，因具有廣譜的抗癌活性和獨特的抗癌機(jī)制而備受青睞。研究者通過研究紫杉醇生物合成過程的某些關(guān)鍵性酶的發(fā)現(xiàn)、克隆和高效表達(dá)，實現(xiàn)紫杉醇高效、穩(wěn)定生產(chǎn)[1]。近年來，研究者已從紅豆杉(Taxuschinensis(Pilger) Rehd.)愈傷組織、懸浮細(xì)胞和幼嫩針葉材料中克隆了紫杉醇生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因[2]，并對這些基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)與紫杉烷類化合物的合成之間的關(guān)系展開了相關(guān)研究[3]。紅豆杉分子標(biāo)記研究是以基因組DNA為基礎(chǔ)，圍繞遺傳變異與親緣關(guān)系和紫杉醇含量方面展開[4,5], 文獻(xiàn)[6,7]利用紅豆杉轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測序進(jìn)而發(fā)掘基因表達(dá)譜多態(tài)性標(biāo)記(EST-SSRs)，以及開展紅豆杉遺傳多樣性的分析、分子標(biāo)記輔助育種、遺傳圖譜構(gòu)建和功能基因的挖掘。目前在紅豆杉分子生物學(xué)研究方面已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，但是圍繞環(huán)境因子對紫杉醇合成路徑基因表達(dá)調(diào)控開展的工作較少，基于以紅豆杉成熟針葉為材料的RNA提取還比較困難，因此需要建立一種穩(wěn)定高效的成熟針葉RNA提取體系。

在RNA提取過程中首先需要加入適量蛋白質(zhì)變性劑，如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、氯仿、異硫氰酸胍、十二烷基磺酸鈉(SDS)等使蛋白質(zhì)變性與核酸分離、沉淀[8]，即TRIzol法(異硫氰酸胍)[9]、CTAB法[10]、SDS-酚法[11]等是幾種常見的RNA提取方法。影響RNA提取效果的主要因素包括多酚、多糖、蛋白及DNA的污染等，因此，RNA提取方法并不是通用的，不同植物或者同一植物不同組織RNA提取都可能需要采用不同的處理方法。由于杉科針葉中含有較多難以去除的萜烯、多糖、多酚等代謝物[12]，傳統(tǒng)的RNA提取方法從產(chǎn)量、產(chǎn)物質(zhì)量上都不能滿足目前紅豆杉研究的需要。本研究根據(jù)RNA提取要點，以紅豆杉屬代表性植物南方紅豆杉針葉為材料，提出一種改良后的成熟針葉RNA提取方法，得到的RNA不僅完整度好，而且產(chǎn)率高，有利于開展紅豆杉成熟針葉紫杉醇合成路徑基因表達(dá)分析以及轉(zhuǎn)錄組等分子生物學(xué)的研究。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Nano Photometer N60超微量紫外分光光度計、Hettich Mikro220R 低溫高速離心機(jī)(天力科技開發(fā)有限公司); 844-070-682 EasyCycler Gradient 96 PCR儀(北京元業(yè)伯樂有限公司); DYCP-31DN 水平電泳槽和核酸電泳儀(北京六一公司); Dolphin-Doc Plus凝膠成像系統(tǒng) (北京銘泰佳科技有限公司); Hirayama HVE-50高壓滅菌鍋(上海天呈科技有限公司); DFD-700 恒溫水浴鍋(邢臺潤聯(lián)科技開發(fā)有限公司)。

TRIzol(上海生工公司); 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，分析純，龍騰化工); 焦炭酸二乙酯(DEPC，純度≥97%) 、LiCl (分析純)購于納川生物公司; NaAC(分析純)、十二烷基磺酸鈉(SDS, 分析純)、乙二胺四乙酸(EDTA，分析純)、 NaCl (分析純)、KAC (分析純)、無水乙醇(分析純)、氯仿(分析純)、異戊醇(分析純)、β-巰基乙醇(β-ME，純度≥99.9%)購于天津永大化學(xué)試劑公司; 聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分析純)、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP，分析純)購于美國Simga公司; 三(羥甲基)氨基甲烷(Tris，分析純，上海研生公司)。實驗用水為超純水。

2.2 實驗前處理

RNA提取之前，所有需要使用的實驗用品在37℃下用0.01% DEPC溶液過夜處理，后在高溫高壓下滅菌(121℃，20 min)。研缽在180℃下烘烤6 h。所有溶液的配制需在37℃下用0.1% DEPC處理水過夜處理后配制，并高溫高壓滅菌處理。

2.3 實驗材料

選取紅豆杉屬代表性植物南方紅豆杉(Taxuschinensis(Pilg.)Rehd.var.mairei(LemeeetLevl.)三年生的幼苗為實驗材料，栽培于東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室溫室中，分別選取新鮮的幼嫩針葉和成熟針葉。

2.4 RNA提取方法

2.4.1TRIzol方法分別稱取新鮮嫩針葉和成熟針葉0.1 g，放于液氮中研磨。加入1 mL TRIzol試劑振蕩混勻(30～60 s)，冰上放置10 min， 4℃ 12000 r/min離心10 min。吸取上清液轉(zhuǎn)到新管中，加入200 μL氯仿，振蕩混勻(30～60 s)，室溫放置5 min， 4℃ 12000 r/min離心10 min。吸取上清液，加入預(yù)冷的異丙醇500 μL，振蕩混勻(30～60 s)，4℃放置20 min， 12000 r/min離心10 min，得到RNA白色片狀沉淀。棄去上清液，加入1 mL 75%(V/V)乙醇，顛倒并渦旋5～10 s， 4℃ 12000 r/min離心3 min，重復(fù)兩次，棄上清液，室溫干燥5～10 min。加入30 μL DEPC處理水溶解RNA，——70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2CTAB法稱取新鮮成熟針葉0.5 g，液氮研磨，加至60℃預(yù)熱的1 mL CTAB提取液中 (2% CTAB、2% PVP、100 mol/L Tris-HCl (pH=8)、25 mol/L EDTA、2 mol/L NaCl, 滅菌后加入0.1 g PVPP和67 μLβ-ME); 混勻后于60℃烘箱反應(yīng)15 min; 4℃ 12000 r/min離心10 min，取上清液，加入700 μL氯仿-異戊醇(24∶1,V/V)，劇烈振蕩混勻，重復(fù)一次; 4℃12000 r/min離心10 min，取上清液，加入600 μL異丙醇，-20℃沉淀30 min。4℃ 12000 r/min離心10 min，棄上清液，再離心2 min; 沉淀用75%乙醇洗滌兩次，真空干燥2～5 min; 加入150 μL DEPC溶解RNA，再加入50 μL 8 mol/L LiCl，4℃沉淀，過夜。次日，4℃12000 r/min離心20 min，收集沉淀。用75%乙醇洗滌2次，真空干燥5～10 min; 加入30 μL DEPC處理水，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.3SDS-酚法稱取新鮮成熟針葉0.1 g，液氮研磨，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，加入1 mL SDS提取液 (0.1 mol/L NaAC，50 mol/L EDTA (pH=8)、1 mol/L NaCl、3% PVP)，調(diào)節(jié)至pH 5.5后加3% (m/V)SDS，用前加5%(V/V)β-ME ，混合后在65℃水浴10 min，4℃ 12000 r/min離心10 min。取上清液，分別加入1/2體積的水飽和酚和氯仿，置冰上10 min，4℃ 12000 r/min離心10 min。取上清液，加入1/3體積的5 mol/L KAC (pH=4.8)和1/3體積的無水乙醇，冰上靜置30 min，4℃ 12000 r/min離心10 min。 取上清液，加2倍體積的乙醇，在冰上沉淀核酸2 h，然后4℃12000 r/min離心10 min，棄上清液。加入700 μL預(yù)冷的NaAC (3 mol/L, pH=5.2)，冰上放置5 min，4℃ 12000 r/min離心20 minn。加入75 μL DEPC溶解，再加入等體積4 mol/L LiCl，4℃沉淀過夜后，4℃12000 r/min離心30 min，棄上清液，加入70%乙醇清洗沉淀，離心，棄上清液， 干燥5～10 min，溶于50 μL DEPC處理水中。

2.4.4改良CTAB-LiCl法取新鮮紅豆杉成熟針葉液氮研磨后的樣品0.5 g，加入經(jīng)過65℃預(yù)熱的提取裂解緩沖液1 mL，RNA提取緩沖液配制: 0.1 mol /L Tris-HCl (pH= 8.0)，0.05 mol/L EDTA (pH=8.0)， 2% CTAB (W/V)，2% PVP (W/V)，2 mol /L NaCl，在使用前加入5%β-ME (V/V)，渦旋劇烈振蕩1 min，65℃ 溫育30 min，期間混勻數(shù)次。加等體積氯仿-異戊醇(24∶1，V/V)，劇烈振蕩2 min，13000 r/min 離心10 min，吸取上清液。反復(fù)抽提2次。加入1/4 體積的LiCl(6 mol/L)，混勻，-20℃放置2～3 h，13000 r/min 離心10 min，去上清液，沉淀RNA中加入1/20體積DEPC處理的無菌水，加入1/20體積NaAC (3 mol/L, pH=5.2)，再加入預(yù)冷的無水乙醇1.2 mL混勻，于——70℃放置30 min，13000 r/min離心10 min，去上清液，沉淀RNA。用70%乙醇洗滌沉淀，離心，棄上清液，并干燥5～10 min， 溶于40 μL DEPC處理水。

2.5 RNA的純度和產(chǎn)率分析

將不同方法提取的總RNA樣品稀釋50倍，用超微量紫外分光光度計檢測260 nm和280 nm 處的吸光值，用A260/A280比值衡量樣本的純度，并計算RNA的產(chǎn)率。取4 μL RNA樣品與2 μL (6 × Loading-buffer)混勻，用1×TAE電泳液和1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照成像。

2.6 cDNA的合成和PCR(RT-PCR)

cDNA的合成采用BeyoRTTMⅡ cDNA第一鏈合成試劑盒(江蘇南京碧云天生物公司)，具體步驟:3 μL RNA(100～500 ng/μL)、1 μL Oligo(dT)(0.5 μg/μL)和8 μL ddH2O混勻，65℃孵育5 min，置于冰上冷卻，再依次加入4 μL 緩沖液(5×Buffer)、1 μL RNA酶抑制劑(RNase Inhibitor，20 U/μL)、2 μL dNTP、1 μL 逆轉(zhuǎn)錄酶(RT-MLV，200 U/μL)，共20 μL，42℃反應(yīng)1 h，80℃反應(yīng)10 min，置冰上終止反應(yīng)，得到單鏈cDNA。PCR反應(yīng)總體系20 μL:模板cDNA 2 μL、引物18S各1.5 μL，PCR-Mix (Easy-LoadTMPCR Master Mix，江蘇南京碧云天生物公司) 10 μL、ddH2O 5 μL。PCR擴(kuò)增體系: 94℃ 3 min， 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30次循環(huán)，72℃ 10 min，4℃保溫。引物序列應(yīng)用報道的紅豆杉18S rRNA序列[13](18S-F:5′-GTGCACATCCCGACTCT-3′, 18S-R:5′-GCGATCCGTCGAGTTATCAT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同方法提取紅豆杉針葉總RNA的質(zhì)量分析

采用4 種方法提取紅豆杉成熟針葉的總RNA，結(jié)果表明，不同方法提取的RNA質(zhì)量差別較大。首先采用TRIzol法提取幼嫩針葉和成熟針葉的RNA，以幼嫩針葉為材料，提取產(chǎn)物電泳后28S和18S條帶清晰， RNA未降解(圖1A) ，表明簡單快捷的TRIzol法適合幼嫩針葉RNA的提取。以成熟針葉為材料，TRIzol法提取RNA電泳時僅有5S條帶出現(xiàn)(圖1B)，表明RNA發(fā)生了降解。與幼嫩針葉相比，液氮研磨后加入TRIzol試劑，緩沖液體系呈深綠色(圖2)，一方面是由于針葉中酚類物質(zhì)的干擾，酚類物質(zhì)氧化影響緩沖液的顏色，另一方面可能由于成熟針葉中代謝產(chǎn)物較幼嫩針葉含量增多，如紫杉醇、10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、巴卡亭Ⅲ等在葉中積累，含量升高[14]，其中一類或者一種產(chǎn)物明顯干擾TRIzol作用，導(dǎo)致緩沖液呈黏稠態(tài)，沒有抑制RNAase活性，導(dǎo)致提取產(chǎn)物RNA降解。說明TRIzol法只適用于紅豆杉幼嫩針葉RNA的提取，因此對成熟針葉的RNA提取方法進(jìn)行篩選和改進(jìn)。采用CTAB法提取成熟針葉的RNA，RNA產(chǎn)物電泳后條帶明顯彌散，拖尾嚴(yán)重，存在嚴(yán)重的降解現(xiàn)象，并且有明顯的DNA條帶干擾(圖3C); RNA樣品中有DNA污染時，會影響基因表達(dá)量的測定。采用SDS-酚法提取RNA，電泳后28S和18S條帶分辨不清晰(圖1D)，RNA發(fā)生降解; 采用改進(jìn)的CTAB-LiCl法提取RNA，電泳后，28S和18S條帶清晰，亮度高， DNA污染較少， RNA質(zhì)量好(圖1E)。改進(jìn)的CTAB-LiCl法綜合CTAB法和SDS-酚法，使用氯仿/異戊醇可將不穩(wěn)定的DNA及其它雜質(zhì)抽提出來，而穩(wěn)定的RNA留于上清液中，從而將RNA和DNA有效分離。耿學(xué)軍等[15]在提取沙蔥總RNA時加入250 μL 3 mol/L NaAc溶液去除DNA，提取效果良好，研究表明，在酸性條件下RNA穩(wěn)定性高于DNA，NaAc可選擇性沉淀RNA，并將DNA留在溶液中。因此，CTAB-LiCl法結(jié)合酸性條件、高鹽溶液(3 mol/L NaAc)和LiCl等減少DNA、多糖污染的步驟，最終提取的RNA質(zhì)量完整、產(chǎn)率高。

圖1 4種方法提取紅豆杉針葉中總RNA的電泳檢測結(jié)果TRIzol法提取紅豆杉的(A)幼嫩針葉和(B)成熟針葉的RNA; (C)CTAB法提取紅豆杉成熟針葉的RNA; (D)SDS酚法提取紅豆杉成熟葉的RNA; (E)改良CTAB-LiCl法提取紅豆杉成熟針葉的RNA。Fig.1 Total RNA electrophoresis results from needles by four methodsExtraction of (A) young needles and (B) mature needles of Taxus chinensis by TRIzol method; (C) Extraction of mature needles of Taxus chinensis by CTAB method; (D) Extraction of mature needles of Taxus chinensis by SDS phenol method; (E) Extraction of mature needles of Taxus chinensis by improved CTAB-LiCl method

圖2 (A) 紅豆杉針葉(a,成熟針葉; b, 為幼嫩針葉); (B) 研磨0.1 g材料中加入1 mL TRIzol試劑后的裂解液(a,成熟針葉，b,幼嫩針葉)Fig.2 (A) Taxus chinensis (Pilger) Rehd.) needles (a, mature needles; b, younger needles); (B) 1 mL TRIzol solution was added into 0.1 g of grinding material (a, mature needles, b, young needles)

3.2 不同方法提取紅豆杉針葉總RNA的純度及其產(chǎn)率

采用紫外分光光度法分析RNA的純度與產(chǎn)率，相應(yīng)的A260/A280比值常用于核酸樣品純度評價。質(zhì)量較好的核酸樣品的標(biāo)準(zhǔn)為A260/A280>1.8[16]。本研究檢測TRIzol試劑盒法提取出紅豆杉幼嫩和成熟針葉的RNA，及其余3種方法提取紅豆杉成熟針葉的RNA的質(zhì)量，結(jié)果表明，TRIzol法提取RNA的A260/A280>1.8，表明RNA中的蛋白和其它物質(zhì)干擾較少，CTAB法和SDS-酚法提取RNA的A260/A280<1.8，表明RNA中蛋白或者其它有機(jī)物的污染比較明顯，而CTAB-LiCl法提取RNA的A260/A280在1.9～2.0之間，表明RNA受污染比較少。由于LiCl是一種強(qiáng)脫水劑，可以降低RNA的溶解度，使部分多糖留在溶液中進(jìn)而選擇性地沉淀大分子RNA[17]，對于不同的植物，所用LiCl的濃度有所不同，在提取白木香RNA中選用4 mol/L LiCl選擇性沉淀RNA[18]，在紫藤種子RNA提取中選擇8 mol/L LiCl沉淀[19]。本研究中采用的CTAB-LiCl法，通過優(yōu)化后，選擇在提取上清液中加入6 mol/L LiCl，適合于除去多糖等一些物質(zhì)的干擾，提高RNA的質(zhì)量。

RNA濃度分析表明，TRIzol法提取紅豆杉幼嫩針葉RNA濃度為135 μg/mL (表1)，成熟針葉中提取RNA不完整，未測出RNA濃度; 應(yīng)用CTAB法、SDS-酚法、CTAB-LiCl法提取的紅豆杉成熟針葉RNA濃度分別為269、205和428 μg/mL。

將不同方法提取的總RNA樣品稀釋50倍，用超微量紫外分光光度計檢測在波長260 nm和280 nm 處的吸光值，用A260/A280值衡量樣本的純度，并計算RNA的產(chǎn)率(yield):

RNA yield (μg/g)=A260N40(μg/mL)V/W

(1)

式中，N為稀釋倍數(shù)， 40 μg/mL相當(dāng)于1個A260單位的RNA含量，V為體積，W為樣品重量(g)。 取4 μL RNA樣品與2 μL (6 × Loading-buffer)混勻，用1×TAE電泳液和1.2%的瓊脂糖凝膠分離，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照成像。RNA產(chǎn)率分析結(jié)果表明，CTAB-LiCl法提取RNA的產(chǎn)率最高，分別為CTAB法和SDS-酚法提取的RNA產(chǎn)率的1.37和1.24倍(表1)。針葉植物中多酚含量比較高，氧化后的多酚物質(zhì)會結(jié)合于RNA上，通過離心將其一并去除，降低了RNA的產(chǎn)率[12]。王玉成等[8]研究發(fā)現(xiàn)，RNA提取過程中加入適量β-ME強(qiáng)還原劑，可避免多酚物質(zhì)被氧化。伍艷芳等[20]和張燕梅等[21]分別在提取樟樹葉片、劍麻組織的總RNA時，均在預(yù)處理液中加入2%β-ME，抑制酚類物質(zhì)的干擾，而劉潔等[12]研究改良云杉針葉總RNA時，加入5%β-ME。本實驗經(jīng)過優(yōu)化選擇加入5%β-ME，有效抑制了酚類物質(zhì)對RNA的影響，提高了RNA的產(chǎn)率。

表1 4種方法提取紅豆杉針葉RNA的純度及產(chǎn)率比較

Table 1 Comparison of total RNA purity and yield from Yew needles by 4 extraction methods (n=3)

方法Methods材料SpeciesA260A280A260/A280RNA濃度RNA concentration(μg/mL)產(chǎn)率Yield(μg/g·FW)TRIzol法TRIzol method幼嫩葉Young needles0.1187±0.0040.061±0.0021.78±0.42135.3±2.665.2±2.1CTAB法CTAB method成熟葉Mature needles0.212±0.00250.152±0.0031.39±0.01269.3±2.3127.2±1.5SDS酚法SDS phenol method成熟葉Mature needles0.14±0.00470.105±0.0761.33±0.02205.3±2.3140.0±4.7改良CTAB-LiCl法Modified CTAB-LiCl method成熟葉Mature needles0.219±0.0140.117±0.0091.88±0.03428.3±3.4174.9±10.8

3.3 提取紅豆杉針葉RNA的特定基因的克隆

分別將TRIzol法和CTAB-LiCl法提取的紅豆杉針葉RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA片段大小在200～1500 bp范圍內(nèi)，符合常規(guī)的反轉(zhuǎn)錄結(jié)果(圖3)。

以上述cDNA為模板，利用基因18S rRNA為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示，18S rRNA在紅豆杉幼嫩、成熟針葉中均擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的片段，以成熟針葉為材料采用CTAB-LiCl法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增條帶清晰且特異性強(qiáng)(圖4)。進(jìn)一步將條帶回收并測序，得到的序列在GenBank進(jìn)行BLAST比對后確認(rèn)為紅豆杉的18S rRNA基因序列。說明改良的CTAB-LiCl法提取的紅豆杉RNA，反轉(zhuǎn)錄結(jié)果好，可以應(yīng)用于后續(xù)基因表達(dá)等分子生物學(xué)研究。

圖3 紅豆杉針葉RNA的反轉(zhuǎn)錄結(jié)果M: DNA marker; 1: 改良CTAB-LiCl法提取紅豆杉成熟葉總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA， 2: TRIzol法提取紅豆杉幼嫩葉總RNA的反轉(zhuǎn)錄cDNA， cDNA濃度: 1 (20 ng/5 μL), 2 (15 ng/5 μL)。Fig.3 Electrophoretogram of transcription of total RNA from needlesM, DNA marker, 1, Total RNA transcription from mature needles by CTAB-LiCl method extraction, 2, Total RNA transcription from young needles by TRIzol extraction. cDNA concentration: 1, 20 ng/5 μL; 2, 15 ng/5 μL.

圖4 RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行18S rRNA基因擴(kuò)增的結(jié)果M: DNA marker; 1: 陰性對照(水作為模版)，2: 幼嫩針葉擴(kuò)增18S rRNA基因，3: 成熟針葉擴(kuò)增18S rRNA基因。Fig.4 Electrophoretogram of 18S rRNA gene amplified with cDNA after RNA transcriptionM: DNA marker, 1: Negative control (RT-PCR amplification of water template), 2: RT-PCR amplification of 18S rRNA gene of young needles, 3: RT-PCR amplification of 18S rRNA gene of mature needles.

4 結(jié) 論

采用改進(jìn)的CTAB-LiCl法能有效從紅豆杉成熟針葉中提取純度較高、完整性較好的RNA，A260/A280比值為1.9～2.0，28S、18S的電泳條帶清晰,總RNA產(chǎn)率較其它方法高。本研究中建立的紅豆杉成熟針葉RNA的提取方法為紅豆杉等針葉植物分子生物學(xué)的研究奠定良好的技術(shù)基礎(chǔ)，同時也對其它富含多糖多酚以及植物表皮蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)較多的試驗材料RNA提取具有很好的借鑒意義。