黃華斌 傅 奇 胡 佳 游其華 莊峙廈， 楊朝勇 王小如*，

1(廈門華廈學院 檢驗與科學技術系， 廈門 361024) 2(廈門大學 化學化工學院， 廈門 361005)

1 引 言

固相萃取法提取DNA是利用固體物質(如硅、玻璃、離子交換樹脂表面[1])與DNA分子發(fā)生共價鍵合或靜電作用等，實現DNA吸附。與傳統的熱法[2]提取相比, 固相萃取法具有操作簡便、DNA降解少的優(yōu)點，且固相萃取技術易與微流控芯片集成[3]，有利于實現DNA微全分析，目前已有研究[4,5]將固相萃取技術與PCR擴增集成在微流控芯片中，實現全血DNA的提取與分析。

根據填充物制作方法不同，基于固相萃取的DNA提取微流控芯片可分為非填充式芯片和填充式芯片。非填充式芯片主要在刻蝕出的通道中進行表面功能化修飾加工[6]，這類芯片性能穩(wěn)定，但加工過程繁瑣，加工費用昂貴[7]; 填充式芯片是在管道中填充二氧化硅等固定相載體以實現對DNA的提取[8]。Tian等[9]將硅球填充在毛細管內，以硅球為載體提取了DNA，實現了SPE法的小型化; Breadmore[10]利用Sol-gel把硅珠固定填充到微溝道中，實現從血液、細菌和病毒樣品中提純DNA，這類芯片載體更換靈活，但在芯片內不易控制，提取過程易造成管道堵塞。二氧化硅包裹的磁性微球具有操控簡單方便[11]、機械強度較高、耐酸堿腐蝕、比表面積大、固定效率高和生物相容性好等優(yōu)點[12-13]，已被應用于生物提取。Shan等[14]對磁性納米粒子表面進行改性，獲得pH可控的磁珠，并成功用于病毒和質粒DNA的提取。由于磁珠的可操控性強，在微流控芯片中有良好的應用優(yōu)勢[15]，Choi等[16]通過磁場將表面固定有生物素標記抗體的磁珠固定在芯片通道中，通過磁場控制，可以簡單方便地引入或排出磁珠; Zhang等[17]構建了夾層式的磁珠固相萃取芯片，實現了λ-DNA的微量提取; Li等[18]構建了磁珠芯片，提取人類淋巴細胞中的DNA，提取效率雖比市售試劑盒略低，但有助于實現自動化分析。

本研究采用自制的表面電性可控的磁珠[19]，用于微流控芯片中，充分利用氨基化超順磁納米顆粒容易在通道中固定、DNA分子與表面電性可控磁珠吸附和解吸控制簡單且時間短的優(yōu)勢，構建了DNA固相萃取芯片。采用激光刻蝕方法在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)上燒蝕出所需孔道，通過熱壓封接孔道，芯片設計簡單，操作方便; 灌注磁珠于芯片通道中，磁珠填充操控容易，依靠磁場固定于通道中，提取過程自動化程度高?？疾炝肆魉俚忍崛嶒灥膮?，并通過對提取液進行凝膠電泳與PCR實驗，與商業(yè)化試劑盒進行性能對比，構建了一種便捷的全血中基因組DNA的提取芯片。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

激光儀(美國Spirit公司); JVC-1000熱壓鍵合機(蘇州汶灝股份有限公司)， HARVARD PHD2000微量注射泵(美國Harvard公司); NanoDrop-1000全波長紫外/可見光掃描分光光度計(美國Thermo公司); PowerPac Basic凝膠電泳儀(美國BIO-RAD公司); GeL Logic 200凝膠成像系統(美國Kadak公司); ADL1233 PCR儀(美國BIO-RAD公司); Zetasizer nano Zeta電位分析儀(英國Malvern公司); JEM2100透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)。

聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，2 mm, 深圳日昌有機玻璃化工有限公司); 三(羥甲基)氨基甲烷(Tris堿)、乙二胺四乙酸鈉(EDTANa2·2H2O)、無水乙醇、乙酸鈉和乙二醇(分析純，國藥集團化學試劑有限公司); 血樣為正常人血樣，由廈門大學醫(yī)院提供; 血細胞裂解液、蛋白酶K (美國Invitrogen公司); Taq DNA 聚合酶(1 u/μL，日本TaKaRa Biotechnology公司); 脫氧核糖核酸(dNTPs，美國Promega公司); 瓊脂糖(LP0028A, 英國Oxoid公司K); 50 bp Ladder(北京Tiangen公司); 溴化乙錠(EtBr，上海生工生物公司); 超純水(18.2 MΩ·cm)由Milli-Q(美國Millipore公司)制備。TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0); 擴增片段包括256 bp，正向引物5′-TGC TTG TGA ATT TTC TGA GAC GGA TG -3′,反向引物5′-AAC AGA ACT ACC CTG ATA CTT TTC TGG A -3′ (美國Promega公司)。

2.2 實驗方法

2.2.1氨基化SiO2@Fe3O4磁性復合微球制備與表征采用水熱法和St?ber法制備具有核殼型結構的超順磁性SiO2@Fe3O4微球，采用氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)對SiO2@Fe3O4微球表面進行修飾，得到表面電性可控的氨基化SiO2@Fe3O4磁性復合微球[19]，采用透射電鏡表征磁珠形貌。取20 mg磁珠分散于5 mL超純水中，濃度為4 μg/μL，備用，采測量磁珠(100 ng/mL)在提取核酸時所用幾種溶液(吸附溶液，淋洗液，洗提液)中的Zeta電位，研究磁珠在不同溶液中的表面電性。

圖1 磁珠芯片設計圖: (A) 芯片俯視示意圖; (B) 芯片各層示意圖Fig.1 Design of magnetic beads chip： (A) Over view of chip; (B) layers of chip

2.2.2芯片設計與制作微流控芯片的通道由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)經過激光刻蝕后熱壓封接而成。圖1為磁珠芯片的設計圖，圖1A為芯片俯視圖，由圖1B中的3片PMMA基片按從上到下順序熱壓封接得到。圖中的圓環(huán)為穿孔的液流口，線條為液流通道。激光儀的工作參數如表1所示。圖中上層基片中通道寬約300 μm，深約200 μm; 底層基片中通道寬約500 μm，深約200 μm。

表1 激光儀刻蝕參數

Table 1 Etching parameters of laser instrument

參數Parameters精度Accuracy(dpi)功率RF Power(W)速率Speed(mm/s)PPI長度Length(mm)寬度Width(mm)深度Depth(mm)空心圓 Hollow circle100058280011.0-上層通道 Upper channel10004016800150.30.2底層通道 Bottom channel10002514800100.50.2

2.2.3磁珠芯片用于DNA提取(1)磁珠芯片操作方法:如圖2所示，2和3接微量注射泵，7接恒流泵。工作時，首先關閉6和8，磁珠由1處注入，7接恒流泵，牽引磁珠懸濁液進入芯片，磁珠到達5處時，由于5下方放置的永磁鐵的作用，磁珠停留在5中，4為圖1中2的穿孔小圓圈。待磁珠全部到達5處時，關閉1和7，打開6，微量注射泵從2處注入樣品溶液，樣品溶液流經5時，溶液中的DNA與5中的磁珠結合，其他未能結合的物質離開5，流出芯片，切換注入淋洗液，淋洗液將沖洗附著在磁珠表面的溶劑和其他未結合物質，并流出芯片。結束后關閉6，打開8，利用微量注射泵從3處注入洗脫液，流經5處時，由于溶液pH值的改變使DNA從磁珠表面脫附，并隨洗脫液從8處流出，收集洗脫液，短期保存于4℃，取適量洗脫液進行PCR實驗。實驗結束，移去磁鐵，斷開7與恒流泵的接口，1接注射泵依次用2 mol/L NaOH和超純水清洗各個通道，排出芯片內磁珠，棄去。通道清洗干凈后，芯片可重復使用。

圖2 磁珠芯片圖： (A)為示意圖; (B)為實物照片1. 磁珠溶液進口; 2. 樣品與淋洗液進口; 3. 洗提液進口; 4. 雙堰; 5. 磁珠固定區(qū)域; 6. 樣品與淋洗液出口; 7. 磁珠出口; 8. 洗提液出口。Fig.2 Diagram of magnetic beads chip: (A) Sketch map of magnetic beads chip; (B) Physical drawing of magnetic beads chip1. Magnetic beads solution inlet; 2. Sample and eluent inlet; 3. Eluant inlet; 4. Double weir; 5. Beads fixed area; 6. Sample and eluent outlet; 7. Magnetic beads outlet; 8. Eluant outlet.

(2)磁珠芯片提取DNA實驗條件優(yōu)化：全血提取DNA實驗中，在20 μL全血中加入200 μL裂解液和2 μL蛋白酶K，混勻，進行裂解反應，裂解反應后加入30 μL NaAc-HAc (2 mol/L, pH 5.0)溶液，混勻。按芯片操作方法進行實驗，實驗參數按表2設置，收集洗脫液，用Nanodrop檢測洗脫液在260 nm的吸收值與純度，計算磁珠芯片的提取效率。

表2 磁珠芯片提取DNA實驗條件

Table 2 Experimental conditions for DNA extraction by magnetic bead chip

步驟Experimental steps溶液組成Solution compositionpH值pH總體積Volume(μL)流速Flow speed(μL/min)時間Time(min)磁珠Magnetic beads20 μL bead (4 μg/μL)+20 μL NaAc-HAc (2 mol/L)5.0401000.4吸附 Adsorption20 μL Whole blood +200 μL lysis solution+2 μL Protenase K+30 μL NaAc-HAc (2 mol/L)5.22521025淋洗 ElutionNaAc-HAc (2 mol/L )5.02002010解吸 DesorptionTE 10× pH 8.08.02054

2.2.4提取產物的分析取5 μL洗脫液進行凝膠電泳(0.6%瓊脂糖，80 V，50 min)，并與自制磁珠芯片外提取液和商品化提取試劑盒提取液進行對比。取適量的洗脫液進行PCR實驗：模板分別為磁珠芯片洗脫液、自制磁珠芯片外提取液和商品化提取試劑盒提取液，并用TE溶液進行空白對照實驗。擴增片段包括256 bp，正向引物5′-TGC TTG TGA ATT TTC TGA GAC GGA TG-3′，反向引物5′-AAC AGA ACT ACC CTG ATA CTT TTC TGG A-3′。25 μL PCR 反應體系中含有正反向引物各0.01 μmol、d5 μmol NTP、2.5 μL緩沖液(10×)、0.25 μL Taq DNA 聚合酶及100 ng模板。熱循環(huán)參數為：94℃預變性3 min; 然后以94℃變性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s; 擴增30個循環(huán); 最后72℃延伸5 min使反應完全。反應完成后，取反應產物5 μL在3.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳(1×TAE電泳緩沖液，電壓70 V，50 min)，用凝膠成像系統拍攝電泳圖譜。

3 結果與討論

3.1 磁珠形貌及其表面電性表征

磁珠的透射電鏡圖如圖3所示，磁珠大小約300 nm。DNA提取中所用到裂解液、淋洗液與洗提液的pH值都影響氨基化磁珠的表面電性。實驗表征了氨基化磁珠分散在各種溶液時的Zeta電位，如圖4所示，淋洗液a為2 mol/L NaAc-HAc (pH 5.0)，樣品處理液b為：200 μL裂解液+2 μL蛋白酶K+30 μL 2 mol/L NaAc-HAc (pH 5.2)，洗脫液c為：TE10×(pH 8.0)，樣品處理對照液d為：裂解液+蛋白酶K(pH 9.3)。其中a的作用是使磁珠表面電荷為正，并中和裂解液中的堿，作為提取過程中的淋洗液; b為磁珠吸附DNA分子時所處的反應環(huán)境; c為DNA分子從磁珠表面解析時所用的洗脫液; d為b的對照實驗所需而設計。根據氨基化磁珠的Zeta電位實驗結果可知，氨基化磁珠在不同pH值的溶液中表現出表面電性不同.在淋洗液(醋酸緩沖溶液)和樣品處理液中，磁珠表面電荷為正，在洗脫液中磁珠表面電荷為負，通過改變溶液的pH可以控制磁珠表面的電性而實現對DNA的提取：低pH溶液中磁珠表面為正電性，此時溶液中若有負電性的DNA分子，則兩者由于靜電引力作用而吸附在一起，而當溶液的pH值較高時，磁珠表面的電性轉變?yōu)樨撾?，此時，在其表面的負電性DNA分子由于靜電斥力而脫離磁珠表面。對實驗過程中芯片的流出溶液(樣品處理液、淋洗液和洗脫液)進行DNA純度測定，分別為：樣品處理液A260/A280=1.053，淋洗液A260/A280=0.625，洗脫液為A260/A280=1.72，由此可見，本研究構建的表面電性可控的磁珠芯片可通過控制提取過程中溶液的pH值在液流流動的過程中實現磁珠對DNA的吸附與脫附。

圖3 磁珠透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopy (TEM) image of magnetic beads

已報道的DNA萃取主要基于二氧化硅表面與DNA分子形成氫鍵或其它共價鍵的形式結合，結合和脫附時間較長，整個提取過程時間通常約為15～60 min，具體時間與樣品提取量相關，一般的樣品量少于10 μL[5,20]。本研究采用的氨基化磁珠與DNA分子的作用力主要為靜電作用力，吸附和脫附時間短，提取20 μL全血的實驗過程共需40 min，從單位樣品的提取時間可知，本研究構建的芯片提取DNA的速度與已報道的微流控提取芯片相比，速度較快，在微流控芯片中由于反應體系微量化，很多反應需在液體流動過程中進行，因此反應速度快的體系在實際應用中具有更好的優(yōu)勢。

圖4 磁珠在不同溶液中的Zeta電位 a，淋洗液; b，樣品吸附溶液; c，洗脫液; d，樣品對照液Fig.4 Zeta potential of magnetic beads in different solutionsa, Eluent; b, sample adsorption solution; c, desorption solution; d, control sample solution

3.2 芯片的設計

采用PMMA片制作三層式芯片，在激光刻蝕后清洗干凈，通過熱壓鍵合機快速鍵合，相比硅片芯片，操作環(huán)節(jié)簡便易操作，且對實驗環(huán)境和儀器條件要求低; 同時避免了硅羥基對磁珠的共價鍵合作用。

芯片為三層結構，在中間一層的穿孔相當于芯片的雙堰結構，主要是為使液流在此形成渦流，達到攪拌溶液的作用，從而使溶液中的DNA更充分接觸磁珠。同時緩沖從1處(圖2)流過來的液流，防止磁珠堆積。磁珠通過磁鐵固定在提取區(qū)域設計成寬扁結構(寬約500 μm，深約200 μm)，扁平結構可使磁珠平鋪分散在分離通道中，有利于DNA分子與磁珠接觸。寬度過大易導致磁珠分布不均，因此選擇比其它通道(300 μm)略寬作為扁平分離通道的寬度。

3.3 磁珠芯片的DNA提取

圖5 吸附、淋洗和解吸流速對DNA提取率的影響Fig.5 Effect of adsorption, elution and desorption flow rate on DNA extraction rate

3.3.1DNA提取條件的選擇和優(yōu)化在磁珠芯片中，各溶液分階段持續(xù)流經萃取區(qū)域，與磁珠進行充分接觸，從而實現溶液中的DNA分子與磁珠吸附與解吸附。Cady等[7]在芯片外的磁珠實驗中已經對提取過程的磁珠的飽和用量和各溶液組成及其pH進行了探討，本研究芯片上提取DNA基于芯片外實驗研究的基礎，選擇磁珠用量為20 μL磁珠懸濁液(4 μg/μL)，在室溫(20℃)下進行。由于流速直接決定了DNA分子與磁珠的吸附和解吸附時間，從而影響提取效率，吸附和解吸過程中，流速越低，萃取效率越高，因此，重點進行了芯片流速的優(yōu)化。由圖5可知，吸附過程中，流速越大，DNA提取率越低，主要是因為流速大，DNA分子與磁珠表面未充分結合就被液流帶出磁珠固定區(qū)域而使提取得率降低，5 μL/min與10 μL/min的流速時，提取效率接近，為了節(jié)省反應時間，選擇10 μL/min作為吸附過程的流速。在洗脫過程中，流速越大，提取效率也越低，主要原因是流速太大，使得磁珠的表面電性轉變時間不夠，而導致DNA分子未能及時地從磁珠表面解吸，而使提取得率降低。由于洗脫液體積較少對實驗時間影響較小，因此選擇5 μL/min作為洗脫液的流速。在淋洗過程中，流速在20 μL/min時，提取效率較高，因此選擇20 μL/min作為淋洗液的流速。

3.3.2全血中DNA的提取效率將磁珠芯片用于人全血中DNA的提取，運用NanoDrop-1000分光光度計分析DNA的濃度與純度，每次實驗結束后排除磁珠，清洗后的芯片可重復使用，表3為5次重復實驗得到的結果，通過C=50×A260換算求得洗脫液的DNA濃度, 計算洗提液 (20 μL)中的DNA總量，除以理論總量即可得提取率。成人新鮮血液中DNA含量約為30～60 ng/μL[9]，限于實驗條件，假設實驗用血的DNA濃度為最高含量60 ng/μL，則20 μL全血中的DNA約為1.2 μg，最終求算DNA的平均提取率為34.7%。DNA純度以A260/A280值為參照，提取的DNA溶液的A260/A280平均值為1.74(表3)，所得DNA純度較高[21,22]。

表3 人全血中基因組DNA提取實驗結果

Table 3 Parallel experimental results of genomic DNA extracted from human whole blood

次數TimesA260A260/A280提取量Extractionquantity(μg)提取率Extractionrate(%)10.4051.690.40533.820.4121.730.41234.330.3981.800.39833.240.4461.740.44637.250.4181.730.41834.8平均Average1.7434.7

芯片上DNA平均提取率為34.7%，與Zhang等[17]報道的磁珠芯片用于λ-DNA提取率(50%)相比，提取效率略低。這是由于提取的目標DNA不同，并且本研究的提取芯片提取的DNA總量較大，導致提取效率降低。芯片上的全血中基因組DNA提取率比芯片外磁珠直接提取操作(提取率約70%)低[19]，推測因為在芯片中磁珠必須通過磁鐵固定在通道中，無法完全充分分散，與芯片外的提取過程中吸打混勻相比，磁珠與DNA分子接觸吸附的幾率更低。由于DNA分子是在溶液流動過程中與磁珠接觸并發(fā)生靜電作用，因此與芯片外的靜止接觸相比，DNA分子更難以吸附到磁珠表面。洗提液的純度與磁珠的芯片外實驗[19](A260/A280≈1.81)相比也有所下降，主要因為在芯片外提取實驗過程中，通過移液槍吸打淋洗溶液，物理吸附在磁珠表面和DNA分子表面的蛋白質由于吸打的外力而脫離磁珠，使得提取液中蛋白質含量更低，DNA純度較高; 在芯片中實驗過程中，淋洗時磁珠通過磁鐵固定平鋪在通道中，通過物理吸附磁珠和DNA分子表面的部分蛋白質，在淋洗環(huán)節(jié)中，由于液流沖力較磁珠外實驗吸打操作的外力小，蛋白質較難從磁珠和DNA分子表面脫落，從而使得提取液中蛋白質含量較芯片外實驗高，DNA純度有所下降。為驗證提取的DNA無損傷或純度是否能滿足進一步的PCR分析，進一步對提取液的DNA進行凝膠電泳和PCR實驗。

圖6 提取液(A)及其PCR產物(B)的凝膠電泳圖0. 空白; 1. 商品化DNA kit提取的基因組DNA; 2. 磁珠芯片提取的DNA; 3. 自制磁珠在芯片外提取的DNA; 4. DNA markerFig.6 Gelelectrophoretograms of (A) eluent and (B) PCR products0. Blank;1. Genomic DNA by commercially DNA kit; 2.Eluent by magnetic beads in chip; 3. Eluent by magnetic beads out of chip; M. 50bp marker

3.3.3磁珠芯片提取DNA的凝膠電泳與PCR擴增圖6為洗提液的凝膠電泳圖(圖6A)與PCR產物電泳圖(圖6B)。圖6A中的0、1、2、3分別為空白、商品化基因組DNA提取試劑盒提取液、自制磁珠芯片提取液、自制磁珠芯片外提取液的電泳條帶。凝膠電泳結果表明，DNA提取試劑盒提取液、自制磁珠芯片提取液、自制磁珠芯片外提取液的電泳條帶基本一致，表明磁珠芯片成功地實現了從全血中提取獲得基因組DNA，過程中未發(fā)生損傷。提取液的PCR實驗結果顯示，磁珠芯片洗提液的PCR產物與其它兩個PCR產物一致。上述結果表明，本研究制備的的基于表面電性可控的磁珠技術的DNA提取芯片可用于提取全血中的基因組DNA，提取液可直接用于進一步的PCR反應。

4 結 論

芯片上的DNA提取對微全分析具有重要作用。本研究將自制的表面電性可控的磁珠應用于PMMA提取芯片中，磁珠借助外磁場固定于微通道中，利用此芯片成功實現了人全血中基因組DNA的無損提取，洗提液可直接用于進一步PCR反應。此磁珠芯片制作簡單，操作方便，自動化程度較高，便于與PCR芯片連接，實現從樣品到檢測結果的微全分析。