蔣 萌 王曉英* 王小兵

1(環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 南京 210009)2(天然藥化教研室， 中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院， 南京 210009)

1 引 言

阿爾茲海默癥(Alzheimer′s disease，AD)是不可逆的神經(jīng)退行性疾病，是癡呆最常見的病因，臨床表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知障礙，日常生活能力下降等。隨著人口的老齡化，AD的發(fā)病率越來越高，不僅危害老年人的健康，也給家庭和社會(huì)帶來了沉重負(fù)擔(dān)，已引起了廣泛關(guān)注。β-淀粉樣蛋白(Amyloidβ-proein，Aβ)級(jí)聯(lián)假說[1]認(rèn)為Aβ聚集過程中形成具有神經(jīng)毒性的低聚物和纖維體，進(jìn)而沉積形成的老年斑是誘發(fā)AD的重要因素。眾多臨床研究提示， 血液、腦脊液和腦組織內(nèi)的Aβ水平異常與AD的病程進(jìn)展密切相關(guān)，Aβ已成為目前研究AD的重要生物標(biāo)志物之一。

Aβ是淀粉樣前體蛋白(APP)由β、γ-分泌酶經(jīng)復(fù)雜的酶切而產(chǎn)生[2]，即APP經(jīng)β-分泌酶切割生成C99(保留APP最后99個(gè)氨基酸)，C99隨后被γ-分泌酶在C端的不同位置切割生成不同長(zhǎng)度的Aβ，主要生成含有40或42個(gè)氨基酸的多肽Aβ40和Aβ42。Aβ存在多種形態(tài)，如Aβ單體(AβM)和Aβ低聚物(AβO)和Aβ纖維體(AβF)。研究表明，Aβ的單體形式?jīng)]有神經(jīng)毒性，而通過成核依賴性復(fù)合過程形成的低聚物和纖維體顯示出神經(jīng)毒性[3]，Aβ的非正常聚集是AD病的病理基礎(chǔ)，在AD病的早期診斷、跟蹤、預(yù)防和治療中具有重要價(jià)值。而Aβ聚集過程的動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定性造成了對(duì)其檢測(cè)困難，因此建立靈敏、高效檢測(cè)不同形態(tài)Aβ的分析方法是十分必要的。近年來，關(guān)于Aβ分析檢測(cè)方法研究取得了諸多進(jìn)展，也已有一些從不同角度對(duì)Aβ分析方法的評(píng)述與報(bào)道[4～8]，但并沒有全面反映近年來Aβ分析檢測(cè)方法的研究進(jìn)展。本文對(duì)目前Aβ的檢測(cè)方法(如神經(jīng)成像、光學(xué)及免疫檢測(cè)方法)進(jìn)行了概述和比較。根據(jù)識(shí)別元件的不同， 重點(diǎn)闡述6類新型電化學(xué)生物傳感方法(包括無標(biāo)記、抗體、多肽、凝溶膠蛋白、血紅素和多種識(shí)別元件聯(lián)用)在Aβ檢測(cè)方面的相關(guān)應(yīng)用與最新研究進(jìn)展，對(duì)未來的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望，為其深入研究與應(yīng)用提供參考。

2 Aβ的常規(guī)檢測(cè)方法

目前，Aβ的常規(guī)檢測(cè)方法主要有神經(jīng)成像方法、光學(xué)檢測(cè)方法及免疫檢測(cè)方法等。神經(jīng)成像方法是能直接或間接對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)(主要是腦)的功能、結(jié)構(gòu)和藥理學(xué)特性進(jìn)行成像的技術(shù)，是AD醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷的重要手段，主要有磁共振成像(MRI)[9,10]、近紅外熒光(NIRF)[11～13]和正電子發(fā)射斷層掃描(PET)[14,15]等。目前，這些成像方法對(duì)Aβ的研究基本都是定性研究。MRI可識(shí)別腦中各個(gè)區(qū)域的Aβ斑塊，但需使用造影劑(如釓二亞乙基三胺五乙酸[9]、臺(tái)盼藍(lán)[10]等)提高靈敏度，由于造影劑的毒性和需穿越血腦屏障等因素， 限制了體內(nèi)成像的可能。NIRF因適宜的穿透深度和無創(chuàng)操作而成為Aβ體內(nèi)成像的有力技術(shù)。常用的NIRF探針有熒光納米顆粒(如CdSe/ZnS量子點(diǎn)[11])、體內(nèi)成像示蹤劑(如姜黃素類似物CRANAD-58[12,13])。由于光學(xué)成像的分辨率隨著熒光發(fā)射源深度的增加而降低，所以NIRF對(duì)Aβ的識(shí)別僅限于腦的外表面。PET使用放射性示蹤劑識(shí)別腦內(nèi)Aβ斑塊，常用放射性示蹤劑為11C和18F同位素，二者半衰期較短，分別為20和110 min[14]，這極大地制約了該技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展。

光學(xué)檢測(cè)方法包括比色法[15,16]、表面熒光強(qiáng)度分布分析(sFIDA)[17,18]、表面等離子共振(SPR)[19,20]、共振光散射(RLS)[21,22]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)[23]、表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)[24]和熒光傳感器[25,26]等(表1)。光學(xué)檢測(cè)方法響應(yīng)時(shí)間短, 分辨率高, 可實(shí)現(xiàn)非接觸檢測(cè)，但易受到干擾，穩(wěn)定性較差。其中，比色傳感器由于可視化、低成本和簡(jiǎn)單快速而廣受關(guān)注。Deng等[16]以納米金(AuNPs)為比色探針，AuNPs吸附的適配體(適配體@AuNPs)為Aβ40的結(jié)合元件。適配體@AuNPs在高鹽條件下聚集形成藍(lán)紫色；加入Aβ后，Aβ與適配體結(jié)合形成復(fù)合物，附著在AuNPs表面，增加納米金顆粒的耐鹽性, 使AuNPs保持分散狀態(tài)，溶液呈粉紅色，以加入Aβ前后溶液的吸收強(qiáng)度比實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，檢出限LOD為10 nmol/L。sFIDA是一種特異性檢測(cè)AβO的定量方法，類似于常規(guī)夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，即Aβ先通過捕獲抗體被固定在功能化的玻璃表面上，再結(jié)合至少兩種以不同熒光染料標(biāo)記的檢測(cè)抗體，最后經(jīng)高分辨率熒光顯微鏡對(duì)表面進(jìn)行成像。因所用檢測(cè)抗體均能識(shí)別Aβ N-末端部分中的重疊表位，只有AβO可以同時(shí)固定結(jié)合兩種檢測(cè)抗體，因此sFIDA對(duì)AβO較AβM敏感。Kühbach等[18]對(duì)384孔板官能化以固定捕獲抗體Nab228，加入AβO樣品孵育，進(jìn)一步與Alexa 488和Alexa 647標(biāo)記的檢測(cè)抗體6E10和Nab228培育，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)sFIDA測(cè)定，AβO的LOD為22 fmol/L。SPR是一種研究分子之間相互作用的有效方法，具有靈敏度高、無標(biāo)記和實(shí)時(shí)測(cè)量等特點(diǎn)，已被用于檢測(cè)金屬離子螯合劑、短肽及抗體與Aβ的相互作用。Xia等[20]先將鏈霉親和素交聯(lián)到覆有聚乙二醇(PEG)自組裝單層的SPR芯片上，用于固定來自兩個(gè)不同流體通道中生物素化的Aβ40和Aβ42抗體，進(jìn)一步捕獲Aβ40和Aβ42，用SPR測(cè)定Aβ40和Aβ42的LOD分別為3.3和3.5 pmol/L。RLS基于彈性光散射，具有靈敏、快速和方便的特點(diǎn)。Yu等[22]用Fe3O4@Au復(fù)合物為RLS探針結(jié)合Aβ，在463.0 nm處測(cè)定RLS強(qiáng)度比I/I0(結(jié)合/未結(jié)合Aβ)，LOD為1.2 fmol/L。FRET與供、受體分子間的空間距離緊密相關(guān)。Xia等[23]選擇AuNPs、CdTe量子點(diǎn)作為供、受體分子。首先多肽PrP(95-110)吸附于AuNPs使之發(fā)生聚集，其對(duì)CdTe的FRET作用減弱，熒光增強(qiáng)；當(dāng)AβO與多肽特異性結(jié)合，AuNPs無法聚集，使得CdTe熒光減弱，根據(jù)熒光變化定量檢測(cè)AβO，LOD為0.2 nmol/L。此外，SERS也成為檢測(cè)Aβ的有力技術(shù)，通過等離子體基質(zhì)上電磁場(chǎng)強(qiáng)化的拉曼散射提供分子結(jié)構(gòu)和分子組成的信息。Teresa等[24]先將氨基官能化的Fe2O3@Au的核殼納米粒子通過酰胺鍵交聯(lián)于氧化石墨烯，再偶聯(lián)Aβ抗體連接Aβ，通過施加激光使納米粒子產(chǎn)生特定拉曼光譜帶以檢測(cè)Aβ，LOD為500 fg/mL。

表1 Aβ的光學(xué)檢測(cè)方法的比較

Table 1 Comparison of optical techniques for detection of Aβ pepetide

方法Method信號(hào)元件Signal element識(shí)別元件Recognition element檢測(cè)范圍Detection range檢出限LOD文獻(xiàn)References比色法Colorimetric method金納米顆粒Gold nanoparticlesCu2+10.5～313.5 nmol/L0.6 nmol/L[15]金納米顆粒Gold nanoparticles適配體Aptamer35～700 nmol/L10 nmol/L[16]表面熒光強(qiáng)度分布分析sFIDAAlexa 633ATTO 488Antibody IC16、6E1010～105 fmol/L1.9 ng/L[17]Alexa 488Alexa 647Antibody 6E10、Nab22810～105 fmol/L22 fmol/L[18]表面等離子體共振SPR銀納米顆粒Silver nanoparticlesAntibody M71Antibody 20C210～105 pmol/L100 fmol/L[19]鏈霉親和素生物素Streptavidin BiotinAntibody 11A50-B1012F4、6E100.02～150 nmol/LAβ40: 3.3 pmol/LAβ42: 3.5 pmol/L[20]共振光散RLS金納米顆粒Gold nanoparticles抗體Antibody0.1～104 ng/mL50 pg/mL[21]Fe3O4@ Au-5～5560000 fmol/L1.2 fmol/L[22]熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET量子點(diǎn)Quantum dotsPrP (95-110)0.5～100 nmol/L0.2 nmol/L[23]表面增強(qiáng)拉曼散射SERS納米顆粒Nanoparticles抗體Antibody0～6 pg/mL500 fg/mL[24]熒光傳感器Fluorescence sensorBaYF5∶Yb,Er納米顆粒BaYF5∶Yb,Er nanoparticles適配體Aptamer0.2～15 nmol/L36 pmol/L[25]羧基熒光素Carboxyl fluorescein適配體Aptamer20～10000 nmol/L12.5 nmol/L[26]sFIDA, surface-based fluorescence intensity distribution analysis; SPR, surface plasmon resonance; RLS, resonance light scattering; FRET, fluorescence resonance energy transfer; SERS, surface enhanced Raman spectroscopy.

基于抗原抗體特異性反應(yīng)的免疫檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)[27,28]、比色免疫法[29]、磁珠免疫法[30,31]、微陣列免疫法[32,33]和毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)免疫測(cè)定[34]等，也是檢測(cè)Aβ的常用方法(表2)。這些免疫技術(shù)通常受到交叉反應(yīng)和高非特異性結(jié)合的影響，且所使用的抗體相對(duì)昂貴?，F(xiàn)已使用的Aβ抗體有BAN50(檢測(cè)分子量40～200 kDa的AβO)、82E1(檢測(cè)分子量高于10 kDa的AβO)、NAB61(檢測(cè)Aβ二聚體，低聚物和纖維體的病理構(gòu)象)、Nab228(檢測(cè)10～25 kDa的AβO)和4G8(檢測(cè)Aβ的17～24的中心區(qū)域氨基酸)等。常規(guī)的ELISA主要局限于操作步驟復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，而比色免疫比較直觀、簡(jiǎn)單。Hu等[29]建立了一種AuNPs修飾雙抗體的Aβ42比色夾心免疫傳感器。分別制備AuNPs修飾的C末端和N末端抗體(C-Ab-AuNP、N-Ab-AuNP)，二者與Aβ42孵育形成夾心復(fù)合物，引發(fā)溶液呈現(xiàn)紅色到藍(lán)色的明顯變化，通過吸收峰強(qiáng)度的差值定量檢測(cè)Aβ，LOD為2.3 nmol/L。此外，以磁珠作為捕獲抗體的固載物更易于分離和再生，如Pi等[31]構(gòu)建了基于量子點(diǎn)(λem=525 nm)和磁性分離的三明治免疫法檢測(cè)Aβ42，先將生物素化C末端抗體連接到鏈霉親和素包被的磁珠上，再加入生物素化N末端抗體-鏈霉親和素修飾的量子點(diǎn)，在Aβ42存在下，形成夾心復(fù)合物， 從而將量子點(diǎn)捕獲到磁珠上，經(jīng)磁性分離，上清液中量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度隨Aβ濃度的增加而降低，LOD為0.2 nmol/L。微陣列能將一維材料按一定方式排列起來， 構(gòu)成陣列體系，易于規(guī)模化。Gagni 等[32]將捕獲抗體固定在聚合物涂覆的硅微陣列平臺(tái)上， 特異性識(shí)別Aβ42，隨后與生物素-檢測(cè)抗體和熒光素-鏈霉親和素同時(shí)孵育，測(cè)定熒光素的熒光強(qiáng)度，檢測(cè)Aβ42的LOD為73.07 pg/mL。CIEF免疫技術(shù)是集樣品前處理與樣品測(cè)定于一體的新型技術(shù)。Hau?mann等[34]先使用抗體6E10對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中Aβ進(jìn)行免疫沉淀，再通過毛細(xì)管等電聚焦分析以洗脫Aβ；洗脫液中依次加入抗體6E10、生物素化抗鼠二抗、鏈霉親和素-辣根過氧化物酶和魯米諾/過氧化物進(jìn)行免疫測(cè)定，通過測(cè)量化學(xué)發(fā)光信號(hào)可以檢測(cè)低至2 ng/mL的Aβ。

表2 檢測(cè)Aβ的免疫方法的比較

Table 2 Comparison of immunoassay methods for detection of Aβ

方法Method免疫平臺(tái)Immune platform抗體種類Antibody type檢測(cè)范圍Detection range檢出限LOD文獻(xiàn)References酶聯(lián)免疫吸附分析ELISA384孔板384 orifice plateHJ3.40～250 pg/mL6.25 pg/mL[27]96孔板96 orifice plateNab2289～300 ng/L2.2 ng/L[28]比色免疫Colorimetric immune金納米顆粒Gold nanoparticlesN,C末端N,C terminal7.5～350 nmol/L2.3 nmol/L[29]磁珠免疫M(jìn)agnetic beadimmunization微芯片MicrochipN末端N terminal25～400 pg/mL20.2 pg/mL[30]量子點(diǎn)Quantum dotsN,C末端N,C terminal0.5～8.0 nmol/L0.2 nmol/L[31]微陣列免疫M(jìn)icroarray Immune硅微陣列Silicon microarray12F4,6E100～5 ng/mL73.07 pg/mL[32]硅烷化表面Silane surface-2.5～7.5 μg/mL300 ng/mL[33]毛細(xì)管等電聚焦 CIEFNanoPro 10006E102～50 ng/mL2 ng/mL[34]

目前，Aβ常規(guī)檢測(cè)方法在靈敏度、分析速度及檢測(cè)成本方面仍有很大的發(fā)展空間。因此，開發(fā)高效、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的Aβ檢測(cè)新方法，對(duì)AD人群同步篩查與檢測(cè)，AD病情、病程變化跟蹤監(jiān)護(hù)，進(jìn)而實(shí)施針對(duì)性干預(yù)與治療具有重要意義。

3 電化學(xué)生物傳感方法檢測(cè)Aβ

電化學(xué)生物傳感方法是利用生物活性材料(如酶、蛋白、抗體、微生物及核酸等)作為識(shí)別元件，將生化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成可定量的物理/化學(xué)信號(hào)，從而進(jìn)行物質(zhì)檢測(cè)的技術(shù)。由于儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、選擇性好、靈敏度高、響應(yīng)快速、成本低及不受樣品顏色和濁度的影響等突出特征，電化學(xué)生物傳感器(換能器為電化學(xué)電極)是目前研究Aβ最具潛力的一種快速簡(jiǎn)便的新型方法。本文根據(jù)識(shí)別元件的不同，對(duì)近幾年檢測(cè)Aβ的電化學(xué)生物傳感器分別進(jìn)行簡(jiǎn)要評(píng)述。

3.1 無識(shí)別元件的電化學(xué)生物傳感器

無識(shí)別元件的電化學(xué)生物傳感器無需標(biāo)記且簡(jiǎn)單有效。Aβ聚集引起結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化， 影響Aβ氨基酸序列中第10位酪氨酸(Tyr10)暴露于Aβ表面的程度，Tyr10殘基在電極表面易氧化，基于此可直接研究Aβ的聚集過程，但定量檢測(cè)較困難。如Vestergaard等[35]首先使用循環(huán)伏安法(CV)、示差脈沖伏安法(DPV)和方波伏安法(SWV)3種技術(shù)檢測(cè)玻碳電極上Aβ序列中Tyr10氧化信號(hào)的變化，進(jìn)而研究Aβ40和Aβ42的聚集過程，結(jié)果顯示兩種肽的聚集過程有顯著差異。Veloso等[36]采用SWV研究Tyr10在印刷電極表面氧化信號(hào)的減少，進(jìn)而篩選Aβ聚集抑制劑β-折疊片狀五肽。Suprun等[37]研究發(fā)現(xiàn)，Aβ序列中Tyr10、3個(gè)組氨酸(His6、His13和His14)及甲硫氨酸(Met35)殘基的氧化電流隨著Aβ42的聚集而降低。Enache等[38]發(fā)現(xiàn)Aβ電化學(xué)氧化行為取決于上述這5種氨基酸殘基及Aβ肽的長(zhǎng)度、疏水性及3D結(jié)構(gòu)。

除了上述直接檢測(cè)Tyr10的方法，還有應(yīng)用電活性物質(zhì)的電化學(xué)生物傳感器，如Zhang等[39]將二茂鐵(Fc)連接到Aβ聚集的核心片段(KLVFFAE)，通過CV、DPV測(cè)量Fc氧化電流隨Aβ孵育時(shí)間的變化, 實(shí)現(xiàn)Aβ聚集過程的電化學(xué)檢測(cè)；并通過監(jiān)測(cè)姜黃素(一種抑制Aβ聚集的電活性酚類化合物)對(duì)聚集的影響，驗(yàn)證該方法適用于Aβ抑制劑簡(jiǎn)單的篩選。此外，EI-Said等[40]在氧化銦錫電極上電沉積AuNPs以吸附Aβ，采用CV進(jìn)行檢測(cè)(圖1)，在0.8 V處顯示出特征性的氧化峰，LOD為20.7 ng/g。將該方法應(yīng)用于AD誘導(dǎo)大鼠腦中提取的Aβ樣品，CV圖顯示雄雌大鼠都在0.8 V處出現(xiàn)峰值，證明該方法檢測(cè)實(shí)際樣品的可行性。

圖1 體外監(jiān)測(cè)Aβ的無標(biāo)記電化學(xué)傳感器[40]Fig.1 Label-free electrochemical sensor for ex-vivo monitoring Aβ[40]

3.2 基于Aβ抗體的電化學(xué)生物傳感器

基于Aβ抗體的電化學(xué)生物傳感器使用較為廣泛(表3)。Prabhulkar等[41]將3種抗體(mHJ2、mHJ7.4、mHJ5.1)分別置于碳纖維微電極上，抗體mHJ2和mHJ7.4分別識(shí)別Aβ40和Aβ42；抗體mHJ5.1既識(shí)別Aβ17～28，又同時(shí)識(shí)別Aβ40和Aβ42，作為陽(yáng)性對(duì)照；通過SWV檢測(cè)Tyr10的氧化電流信號(hào)進(jìn)行定量分析。檢測(cè)Aβ40和Aβ42的線性范圍分別為20和50 nmol/L和20～140 nmol/L， LOD均為20 nmol/L。Li等[42]在磁性氮摻雜石墨烯上固載抗體，經(jīng)磁吸附至絲網(wǎng)印刷金電極上構(gòu)建免疫傳感器，以鐵氰化鉀為探針，用DPV檢測(cè)Aβ42加入前后的電流變化值， 進(jìn)而實(shí)現(xiàn)Aβ定量分析，LOD為5 pg/mL。

表3 基于Aβ抗體的電化學(xué)生物傳感器

Table 3 Electrochemical biosensor based on Aβ antibody

AuNPs因其優(yōu)良的光電特性和生物相容性而廣泛應(yīng)用于基于抗體的Aβ電化學(xué)生物傳感器，主要包括電極修飾和抗體標(biāo)記。Wu等[43]以沉積AuNPs的氧化鋁膜為固載電極捕獲抗體12F4，用于EIS檢測(cè)Aβ42， 線性范圍為1～10000 pg/mL，LOD為0.01 pg/mL。Lien等[44]在印刷芯片上建立3種(方法A、B、C)Aβ阻抗免疫傳感器，它們均由固定在電極上的抗體與Aβ之間的特異性免疫反應(yīng)產(chǎn)生信號(hào)，但電極表面修飾不同。結(jié)果表明，方法C的 LOD最低，為0.57 nmol/L。Carneiro等[45]在巰基丙酸(MPA)修飾的金電極上電沉積AuNPs，進(jìn)而組裝抗體DE2B4(結(jié)合Aβ 1～17的氨基酸區(qū)域)用于直接檢測(cè)Aβ，采用SWV、EIS得到LOD為5.2 pg/mL。de la Escosura-Muiz等[46]通過多孔磁性微球固載Aβ捕獲抗體，進(jìn)一步結(jié)合Aβ和AuNPs標(biāo)記檢測(cè)抗體, 形成三明治復(fù)合物，由計(jì)時(shí)電流法(CA)檢測(cè)鹽酸中AuNPs的陰極電流。多孔磁性微球的高孔隙可有效增加表面積，提高檢測(cè)的靈敏度，LOD低至19 pg/mL。該方法首次應(yīng)用于AD患者血清、血漿和腦脊液中Aβ的檢測(cè)，血清和血漿中未檢出，腦脊液中Aβ濃度為(811±40) pg/mL，與ELISA測(cè)定結(jié)果一致。Liu等[47]在MPA修飾電極上固載抗體6E10(識(shí)別所有Aβ片段的共同N末端)以捕獲復(fù)合物(Aβ16-血紅素-AuNPs)，復(fù)合物可催化O2為H2O2產(chǎn)生電流。因目標(biāo)物Aβ40/42、復(fù)合物與6E10競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合, 導(dǎo)致催化電流下降，該方法可檢測(cè)10 pmol/L的Aβ40/42。Han等[48]制備了新型Au@Fc-Zn-MOF作為檢測(cè)抗體標(biāo)記物，將石墨烯、氨基末端化聚乙二胺大分子修飾電極上結(jié)合AuNPs，并連接捕獲抗體/Aβ/Au@Fc-Zn-MOF標(biāo)記抗體，最后采用SWV檢測(cè)，檢測(cè)Aβ的濃度范圍為0.0001～100 ng/mL，LOD為0.03 pg/mL。

酶因其高催化活性已在Aβ檢測(cè)中得以應(yīng)用，主要包括堿性磷酸酶(ALP)和葡萄糖氧化酶(GOD)。Rama等[49]首先在AuNPs修飾的絲網(wǎng)印刷電極上固載生物素化Aβ，當(dāng)加入目標(biāo)物Aβ和Aβ抗體的混合溶液時(shí)，生物素化Aβ和目標(biāo)物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Aβ抗體，最后與連接ALP的IgG孵育，ALP催化底物3-吲哚基磷酸酯與Ag+的混合物產(chǎn)生電信號(hào)，檢測(cè)Aβ的濃度范圍為0.5～500 ng/mL，LOD為0.1 ng/mL。此外，Liu等[50]通過對(duì)氨基苯酚氧化還原循環(huán)建立檢測(cè)Aβ的競(jìng)爭(zhēng)性免疫法，電極上固載的抗體捕獲Aβ復(fù)合物(鏈霉親和素-ALP/生物素-Aβ的復(fù)合物)，ALP催化對(duì)氨基苯基磷酸產(chǎn)生電化學(xué)活性物對(duì)氨基苯酚，并在還原劑三(2-羧乙基)膦存在下，對(duì)氨基苯酚可在電極上進(jìn)行氧化循環(huán)從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。因目標(biāo)物Aβ和Aβ復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合固載抗體，因此電流隨目標(biāo)物Aβ濃度的增加而降低，LOD為5 pmol/L。 Diba等[51]應(yīng)用PEG、MPA、AuNPs修飾絲網(wǎng)印刷碳電極構(gòu)建基于抗體12F4/Aβ/抗體1E11-ALP的夾心測(cè)定法(圖2A)，通過DPV檢測(cè)ALP和底物4-氨基苯酚磷酸酯之間的特異性電催化反應(yīng)測(cè)定Aβ的濃度，線性范圍為100 fmol/L～25 pmol/L，LOD為100 fmol/L。Wang等[52]基于氧化鈰摻雜氧化鋅(Ce∶ZONFs)的花狀納米材料構(gòu)建魯米諾電化學(xué)發(fā)光(ECL)傳感器檢測(cè)Aβ(圖2B)。通過酰胺化和物理吸附將魯米諾結(jié)合到Ce∶ZONFs表面，再結(jié)合Ab2(二抗)-GOD@Ce:ZONFs-Lum的復(fù)合物作為信號(hào)探針，采用半胱氨酸銀納米線修飾的玻碳電極固定一抗，依次加入Aβ和二抗復(fù)合物。GOD催化葡萄糖產(chǎn)生H2O2，Ce∶ZONFs再催化H2O2產(chǎn)生自由氧， 促進(jìn)魯米諾發(fā)光，且Ce4+?Ce3+反應(yīng)可通過快速電子轉(zhuǎn)移增加ECL反應(yīng)速率， 提高ECL信號(hào)，檢測(cè)Aβ的線性范圍為80 fg/mL～100 ng/mL，LOD低至52 fg/mL。

圖2 (A)基于ALP酶促反應(yīng)[51]和(B)魯米諾ECL[52]的夾心免疫法測(cè)定Aβ的示意圖Fig.2 Schematic diagram of Aβ assay by sandwich immunoassay based on (A) alkaline phosphatase (ALP) enzymatic reaction[51] and (B) luminol electrochemiluminescence (ECL)[52]

3.3 基于Aβ多肽的電化學(xué)生物傳感器

應(yīng)用多肽片段特異性識(shí)別Aβ的電化學(xué)生物傳感器的文獻(xiàn)不多。Beheshti等[53]合成了4種Fc-多肽的生物復(fù)合物，都攜帶Aβ疏水序列：(賴氨酸)-亮氨酸-纈氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸，但是C末端用不同基團(tuán)修飾。通過CV、EIS測(cè)量Fc氧化還原過程中電流變化來檢測(cè)Fc-多肽與固定在金電極表面的Aβ(12-28)的相互作用，結(jié)果表明，F(xiàn)c-多肽可以阻止AβF形成，其程度取決于修飾基團(tuán)的性質(zhì)。Li等[54]基于具有序列RGTWEGKWK的肽可通過氨基酸側(cè)鏈間的疏水作用結(jié)合AβO42，將一端標(biāo)記Fc另一端含有11-巰基烷酸(MUA)的功能性肽探針和9-巰基-1-壬醇(MNH)先后組裝在金電極表面，由于MUA比MNH稍長(zhǎng)，因此肽探針可以擺動(dòng)或彎曲；而肽探針與靶標(biāo)AβO42的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致電極表面電子轉(zhuǎn)移的顯著變化，用SWV測(cè)量該信號(hào)變化從而檢測(cè)AβO42，檢測(cè)范圍為0.48～12 nmol/L，LOD為240 pmol/L。 Li等[55]合成甲基紫(MV)-葫蘆脲(CB)-多肽RGTFEGKF-MUA的復(fù)合物(圖3A)，通過SWV檢測(cè)MV-CB與Aβ42競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固定在電極上多肽而產(chǎn)生的信號(hào)變化，線性范圍為0.5～2.5 nmol/L。

細(xì)胞朊蛋白(膜結(jié)合糖蛋白，PrPC)已在全基因組篩選中被鑒定為AβO的高親和力受體[56]。研究表明，PrPC與AβO相互作用的核心區(qū)域是PrP (95～110)，這些殘基位于PrPC的非結(jié)構(gòu)化N末端區(qū)域內(nèi)，具有THSQWNKPSKPKTNMK的氨基酸序列。Xia等[57]制備了金剛烷(Ad)-PrP(95～110)-AgNPs的復(fù)合物，并將該復(fù)合物固定到β-環(huán)糊精改性的電極表面，目標(biāo)物AβO與AgNPs競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PrP (95～110)，采用線性掃描伏安(LSV)法檢測(cè)AβO的線性范圍為0.02～100 nmol/L，LOD為8 pmol/L。該課題組基于類似的原理將PrP (95～110)和AuNPs直接固定在金電極上，Aβ與AuNPs競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PrP (95～110)，Aβ檢測(cè)范圍為0.1～200 nmol/L，LOD為45 pmol/L[58]。此外，Xing等[59]在PrP (95～110)功能化的電極上結(jié)合AgNPs，可以產(chǎn)生強(qiáng)的氧化電流；而當(dāng)AβO競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PrP (95～110)后，由于不能形成AgNPs/ PrP (95～110)復(fù)合物， 電流幾乎下降到背景水平，LOD為6 pmol/L。Rushworth等[60]將生物素化的PrP (95～110)連接到鏈霉親和素修飾的絲網(wǎng)印刷金電極上，構(gòu)建無標(biāo)記阻抗傳感器(圖3B)，LOD為0.5 pmol/L，該方法應(yīng)用于檢測(cè)培養(yǎng)基中7PA2細(xì)胞模型分泌的AβO，測(cè)得其濃度為24 nmol/L。Liu等[61]構(gòu)建基于PrP (95～110)的類三明治結(jié)構(gòu)，通過固定在金電極的多肽和游離的多肽/ALP復(fù)合物“夾心”法檢測(cè)Aβ，ALP通過催化底物二茂鐵甲醇形成氧化還原信號(hào)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，檢測(cè)范圍為0.005～20 nmol/L，LOD為3 pmol/L。一些基于Aβ多肽的電化學(xué)生物傳感器的相關(guān)技術(shù)具體參數(shù)見表4。目前，此方面的研究主要集中在應(yīng)用PrP (95～110)檢測(cè)Aβ，未來應(yīng)著眼于發(fā)展多種新型的Aβ特異性多肽。

圖3 基于(A)合成肽[55]和(B)PrP(95～110)[60]的Aβ電化學(xué)生物傳感器Fig.3 Aβ electrochemistry biosensor based on (A) coupling peptide[55] and (B) PrP (95-110)[60]

表4 基于Aβ多肽的電化學(xué)生物傳感器

Table 4 Electrochemical biosensor based on Aβ peptides

方法Method電極Electrode識(shí)別元件Recognition element檢測(cè)范圍Detection range檢出限LOD文獻(xiàn)References循環(huán)伏安、電化學(xué)阻抗CV、EIS金電極 Gold electrodeFc-多肽 Fc-peptides--[53]方波伏安 SWV金電極 Gold electrodeMUA-RGTWEGKWK-Fc0.48～12 nmol/L240 pmol/L[54]方波伏安 SWV金電極 Gold electrode MV-CB-RGTFEGKF-MUA0.5～2.5 nmol/L48 pmol/L[55]線性掃描伏安 LSV金電極 Gold electrode Ad-PrP(95～110)-AgNPs0.02～100 nmol/L8 pmol/L[57]電化學(xué)阻抗 EIS金電極 Gold electrode PrPC-AuNPs0.1～200 nmol/L45 pmol/L[58]線性掃描伏安 LSV金電極 Gold electrode PrP(95～110)-AgNPs0.01～200 nmol/L6 pmol/L[59]電化學(xué)阻抗 EIS絲網(wǎng)印刷金電極Screen printing gold electrodePrP(95～110)-0.5 pmol/L[60]循環(huán)伏安CV金電極 Gold electrode ALP-PrP(95～110)0.005～20 nmol/L3 pmol/L[61]

3.4 基于凝溶膠蛋白的電化學(xué)生物傳感器

凝溶膠蛋白在血漿和腦脊液中作為分泌蛋白，并在細(xì)胞質(zhì)中作為主要的肌動(dòng)蛋白結(jié)合物以調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的組裝[62]。1999年，Chauhan等[63]發(fā)現(xiàn)凝溶膠蛋白能以濃度依賴的方式選擇性結(jié)合可溶性AβM。Yu等[64]用多壁碳納米管/AuNPs修飾電極固載凝溶膠蛋白，進(jìn)而捕獲Aβ和HRP-AuNPs-凝溶膠蛋白的復(fù)合物(圖4A)，由HRP催化底物3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺在+0.35 V產(chǎn)生的電信號(hào)， 間接對(duì)Aβ進(jìn)行定量分析，檢測(cè)范圍為0.1～50 nmol/L，LOD低至28 pmol/L，將其應(yīng)用于AD大鼠腦脊液和腦組織(海馬、前額葉皮層和紋狀體)中Aβ的檢測(cè)，與ELISA所測(cè)結(jié)果一致。此外，Yu等[65]也構(gòu)建類似的類三明治Aβ傳感器(圖4B)， 用硫蛋白(Th)取代HRP，通過Th的還原信號(hào)對(duì)Aβ進(jìn)行定量檢測(cè)，線性范圍為0.2～40 nmol/L， LOD為50 pmol/L。應(yīng)用凝溶膠蛋白電化學(xué)檢測(cè)Aβ的相關(guān)報(bào)道較少，其結(jié)合途徑、作用機(jī)理有待深入研究。

圖4 基于凝溶膠蛋白結(jié)合Aβ的(A)HRP[64]和(B)Th三明治免疫法[65]檢測(cè)AβFig.4 Sandwich immunoassay for Aβ based on (A) HRP[64] and (B) Th gelsolin-bound Aβ[65]

3.5 基于血紅素的電化學(xué)生物傳感器

圖5 基于Aβ自組裝單層研究銅和血紅素的作用[69]Fig.5 Effect of copper and heme on Aβ self-assembled monolayer[69]

血紅素可以結(jié)合Aβ形成具有類過氧化物酶活性的復(fù)合物，并且能抑制Aβ聚集[66]，血紅素與Aβ的結(jié)合在AD的早期階段可能發(fā)揮較為重要的作用。Zhou等[67]采用CV和DPV研究Aβ和血紅素的相互作用，結(jié)果表明，His13和His14可能是兩者的結(jié)合位點(diǎn)，且血紅素能抑制AβF的形成。Neumann等[68]通過CV分析氨基己硫醇-血紅素與Aβ16的相互作用，表明血紅素-Aβ復(fù)合物可以增強(qiáng)血紅素的過氧化活性。Pramanik等[69]通過Aβ16-半胱氨酸復(fù)合物在金電極上形成自組裝單層，再將銅、血紅素附著在自組裝單層上，研究它們對(duì)Aβ聚集的影響(圖5)，結(jié)果表明， 血紅素-Aβ比Cu-Aβ催化能力更強(qiáng)。目前， 基于血紅素的Aβ電化學(xué)生物傳感器還處于發(fā)展階段，基本都是定性研究。

3.6 多種識(shí)別元件聯(lián)用的Aβ電化學(xué)生物傳感器

圖6 基于三明治型ECL磁性適配體傳感器檢測(cè)Aβ[75]Fig.6 Detection of Aβ based on a sandwich-type ECL magneticaptasensor[75]

核酸適配體(Apamer)是一類寡核苷酸配體，具有成本低、親和力和特異性高、結(jié)構(gòu)和堿基序列可設(shè)計(jì)以及合成簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。2002年，Ylera等[70]在Aβ40的N端連接半胱氨酸， 通過半胱氨酸和巰基丙基生成二硫鍵將其交聯(lián)在微珠上，利用親和柱法篩選Aβ40的apamer，篩選出Kd值最小(親和力最高)的RNA核酸適配體β55。Takahashi等[71]通過篩選獲得Aβ40寡聚體的RNA核酸適配體N2、E2。Tsukakoshi等[72]在選擇α-突觸核蛋白低聚物的適體時(shí)，發(fā)現(xiàn)適體也與AβO結(jié)合，其中適配體T-SO508與Aβ40寡聚體的結(jié)合力最強(qiáng)。目前，未見單獨(dú)應(yīng)用Aβ適配體作為識(shí)別元件檢測(cè)Aβ的電化學(xué)方法的相關(guān)報(bào)道。

4 結(jié)論與展望

本文重點(diǎn)闡述了新型電化學(xué)生物傳感方法在Aβ檢測(cè)方面的相關(guān)應(yīng)用。但是，面對(duì)臨床實(shí)際樣品中聚集過程動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定的痕量Aβ，提高電化學(xué)生物傳感方法的靈敏度、特異性以及實(shí)用性仍是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。從目前的研究現(xiàn)狀可知， Aβ電化學(xué)生物傳感方法具有如下的發(fā)展趨勢(shì)。

(1)新型復(fù)合納米材料的應(yīng)用。納米材料與電化學(xué)生物傳感技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，可顯著提高分析方法的準(zhǔn)確性、靈敏度和響應(yīng)速度，為Aβ的分析研究與發(fā)展提供了新的思路和手段。目前Aβ分析研究中使用的納米材料較單一，在各種特殊結(jié)構(gòu)和生物相容性納米材料的研制、復(fù)合及應(yīng)用方面，仍有較大的發(fā)展空間。

(2)多種Aβ生物識(shí)別元件的聯(lián)用。目前Aβ的生物識(shí)別元件主要有抗體、多肽、凝溶膠蛋白、血紅素及核酸適配體。Aβ分析研究中單一生物識(shí)別元件的應(yīng)用較多，使用中各有利弊。Aβ多種識(shí)別元件的聯(lián)用可揚(yáng)長(zhǎng)避短、優(yōu)勢(shì)疊加，將是未來Aβ檢測(cè)方法的研究方向。

(3)Aβ不同聚集形態(tài)的同時(shí)檢測(cè)。目前Aβ分析研究仍停留在同一形態(tài)的單一檢測(cè)。在單一流程中實(shí)現(xiàn)Aβ不同聚集形態(tài)的同時(shí)檢測(cè)，不僅能降低成本、節(jié)省時(shí)間，更對(duì)AD早期發(fā)現(xiàn)、跟蹤、預(yù)防和治療具有重要意義。

(4)提高Aβ傳感檢測(cè)的實(shí)用性。目前，Aβ電化學(xué)生物傳感器實(shí)際檢測(cè)效果不理想。將傳感設(shè)計(jì)與樣品前處理有效偶聯(lián)，集分離反應(yīng)、信號(hào)產(chǎn)生、信號(hào)檢測(cè)為一體，有效提高傳感器的實(shí)用性，將是未來Aβ研究的重點(diǎn)。