賈永梅 婁筱叮 夏 帆*,3

1(嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院， 湛江 524048) 2(中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)材料與化學(xué)學(xué)院， 武漢 430074)3(華中科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院， 武漢 430074)

1 引 言

細(xì)胞是生命的基本單位，其中包含各種生物活性物質(zhì)，如核酸(DNA、RNA)、蛋白質(zhì)、離子、生物小分子等。對(duì)這些生物活性物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)、原位監(jiān)測，可詳細(xì)闡述它們?cè)谏^程中的作用、引發(fā)的生物學(xué)效應(yīng)及生物學(xué)功能，對(duì)生命科學(xué)研究、重大疾病診斷和個(gè)性化治療具有重要意義[1]。在對(duì)這些生物活性物質(zhì)進(jìn)行研究的眾多方法技術(shù)中，細(xì)胞成像研究技術(shù)由于具有觀測定位精準(zhǔn)的特點(diǎn)、獨(dú)特的時(shí)間和空間分辨率高的性質(zhì)，成為分子水平上準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)、原位監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)生物活性物質(zhì)信號(hào)變化及觀測細(xì)胞形態(tài)的重要手段[2]。

在進(jìn)行單細(xì)胞成像研究時(shí)，細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)生物活性物質(zhì)自身無法產(chǎn)生易被儀器或肉眼所捕獲的信號(hào)，通常需使用生物探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)特異性識(shí)別生物活性物質(zhì)，并與特定的生物活性物質(zhì)結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，產(chǎn)生相應(yīng)信號(hào)變化，通過監(jiān)測生物探針信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物活性物質(zhì)準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)、原位監(jiān)測[3]。生物探針的響應(yīng)信號(hào)有多種，其中熒光信號(hào)在用于單細(xì)胞成像研究時(shí)，具有直觀[4]、操作簡單[5]、選擇性好[6]、靈敏度高[7]、無需參比、不受電磁場的影響、可遠(yuǎn)程實(shí)時(shí)在線自動(dòng)監(jiān)測等特性[8]，還具備對(duì)細(xì)胞進(jìn)行靜態(tài)觀察、對(duì)細(xì)胞內(nèi)分子動(dòng)力學(xué)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測、對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行定位和對(duì)蛋白質(zhì)分子的相互作用進(jìn)行研究等優(yōu)點(diǎn)[9]，在單細(xì)胞成像技術(shù)研究中發(fā)揮了重要作用。

近年來，研究者設(shè)計(jì)并合成出一系列熒光探針，如核酸熒光探針[10]、多肽熒光探針[11]、納米熒光探針[12]等，利用熒光探針與目標(biāo)分子之間的特異性識(shí)別作用，成功地將其引入到單細(xì)胞成像研究中，使得該研究領(lǐng)域進(jìn)入一個(gè)全新階段。本文重點(diǎn)介紹近五年來核酸熒光探針在單細(xì)胞成像中的研究進(jìn)展。

2 核酸熒光探針應(yīng)用于細(xì)胞成像

2.1 雙標(biāo)記核酸熒光探針

自1996年Tyagi等[13]首次提出分子信標(biāo)(MB)探針以來，由于其相比DNA線性探針具有較高的特異性、價(jià)格低廉、設(shè)計(jì)及合成簡單等優(yōu)點(diǎn)，在生物傳感器中被廣泛應(yīng)用。通常MB探針在設(shè)計(jì)和應(yīng)用時(shí)，需標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。無目標(biāo)分子存在時(shí)，MB探針自身形成特定的空間結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)在空間上靠近，所以MB探針自身不發(fā)射熒光; 當(dāng)目標(biāo)分子存在時(shí)，它和MB探針的環(huán)狀部分結(jié)合，打開MB探針，使得熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，因此發(fā)射出熒光信號(hào)[14]。通過監(jiān)測探針熒光信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子檢測(圖1)。

圖1 分子信標(biāo)熒光探針在細(xì)胞成像中的應(yīng)用：(A) 分子信標(biāo)探針識(shí)別DNA分子檢測原理[15]; (B) 基于Bst聚合酶誘導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)和核酸外切酶輔助的循環(huán)反應(yīng)的二次酶放大策略檢測miRNA[16]; (C) DNA四面體結(jié)構(gòu)探針在細(xì)胞內(nèi)攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)過程[19]; (D) 利用雙色DNA四面體納米結(jié)構(gòu)檢測細(xì)胞內(nèi)miRNA-21和miRNA-155[21]。Fig.1 Molecular beacons (MB) used for intracellular imaging: (A) Schematic representation of recognition mechanism for random DNA[15]; (B) Schematic illustration of HQEA strategy for miRNA detection based on Bst polymerase induced strand displacement reaction and a lambda exonuclease-aided recycling reaction[16]; (C) Schematic of cellular uptake, transport and fate of DNA tetrahedral[19]; (D) Dual-color DNA TetrNano for simultaneous detection of intracellular miRNA-21 and miRNA-155[21]

細(xì)胞膜帶有大量負(fù)電荷，通常會(huì)將同樣帶有負(fù)電荷的核酸分子屏蔽在膜外，而MB探針是帶負(fù)電荷的親水性大分子化合物，因此不能自由地穿過細(xì)胞膜的磷脂層。Qiu等[15]利用可細(xì)胞內(nèi)化的核酸適配體和MB探針的雜交結(jié)構(gòu)，開發(fā)了一種自輸送、光激活的分子信標(biāo)MB探針，用于實(shí)時(shí)檢測活細(xì)胞內(nèi)miRNA (圖1A)。利用標(biāo)記Cy5熒光基團(tuán)的核酸適配體AS1411作為載體探針，MB探針可以被高效地輸送到指定細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，而其細(xì)胞內(nèi)化的量及其在細(xì)胞內(nèi)的分布均可依據(jù)光照射前后Cy5的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)信號(hào)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤。利用切割反應(yīng)，有效控制MB探針的檢測行為，實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞體系中檢測目標(biāo)RNA，時(shí)空分辨率高。

雖然MB探針非常適合在均質(zhì)及活細(xì)胞體系中檢測目標(biāo)分子，但是MB探針和靶分子DNA以1∶1的比例結(jié)合，利用堿基配對(duì)作用力對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行檢測，通常檢測靈敏度低。為了克服這一技術(shù)難題，Duan等[16]設(shè)計(jì)了一種一步法、超靈敏的二次循環(huán)擴(kuò)增檢測方法用于MCF-7細(xì)胞系中miR-21和PC3細(xì)胞系中miR-221的檢測。利用缺刻內(nèi)切酶、DNA聚合酶和消化酶以及一條改進(jìn)的分子信標(biāo)探針，設(shè)計(jì)了一個(gè)雙循環(huán)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了靶標(biāo)分子和信號(hào)探針的比例為1∶N2的超靈敏反應(yīng)策略，通過檢測miR-21在乳腺癌組織和正常組織中的表達(dá)量，表明該方法可以很好地區(qū)分乳腺癌組織及正常組織(圖1B)。

傳統(tǒng)的DNA探針常用一維(單鏈DNA)或二維結(jié)構(gòu)(如發(fā)夾結(jié)構(gòu))作為識(shí)別元件，其傳感界面的均一性在制備過程中難以得到有效控制，影響實(shí)際應(yīng)用中檢測的穩(wěn)定性和重復(fù)性。而三維結(jié)構(gòu)的DNA探針具有高結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和剛性，可以有效提高DNA探針在表面分布排列的均一性，并精確調(diào)控探針之間的距離，顯著提高對(duì)目標(biāo)分子檢測的靈敏度和特異性。自2011年Li等[17]首次利用DNA四面體作為一種納米尺度的藥物載體，將具有免疫刺激效應(yīng)的CpG寡核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞并刺激產(chǎn)生特定的細(xì)胞因子以來，DNA四面體結(jié)構(gòu)在生物傳感領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)的單細(xì)胞成像技術(shù)利用共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行表征，而超分辨率熒光顯微鏡可打破原有的光學(xué)遠(yuǎn)場衍射極限對(duì)光學(xué)系統(tǒng)極限分辨率的限制，很容易超過光學(xué)分辨率的極限，達(dá)到納米級(jí)分辨率[18]。該課題組利用超分辨率熒光顯微鏡技術(shù)的這一優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合生物化學(xué)手段，清晰地展示了一類自組裝DNA四面體結(jié)構(gòu)在活細(xì)胞中的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)過程(圖1C)，并實(shí)現(xiàn)在活細(xì)胞體系中觀察端粒酶的準(zhǔn)確位置[19,20]。Zhou等[21]將DNA四面體結(jié)構(gòu)和MB探針的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，在DNA四面體結(jié)構(gòu)的兩條DNA鏈中分別標(biāo)記對(duì)不同目標(biāo)分子具有識(shí)別功能的MB探針，并標(biāo)記不同熒光基團(tuán)，通過監(jiān)測不同發(fā)射波段的熒光信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞體系中對(duì)miRNA-155和miRNA-21的檢測(圖1D)。而He等[22]利用兩個(gè)DNA四面體結(jié)構(gòu)之間的鏈置換反應(yīng)，催化放大信號(hào)， 實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞體系中檢測miRNA。

2.2 單標(biāo)記核酸熒光探針

2.2.1基于FRET原理檢測的單標(biāo)記核酸熒光探針為了降低熒光探針的設(shè)計(jì)難度、設(shè)計(jì)成本并拓寬其應(yīng)用范圍，研究者們利用一些功能納米材料的獨(dú)特性質(zhì)，構(gòu)建單標(biāo)記熒光探針[23]，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子檢測(圖2)。

圖2 (A) 利用適配體/氧化石墨烯的納米復(fù)合物用于活細(xì)胞內(nèi)分子及體外分子的原位探測過程[26]; (B)在二元體系中檢測單細(xì)胞內(nèi)miRNA[30]; (C) 利用AIE熒光探針原位監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性[34]; (D) 利用雙熒光信號(hào)探針檢測細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞提取物中的端粒酶活性[36]Fig.2 (A) Schematic illustration of in vitro and in situ molecular probing in living cells by using aptamer/GO-nS nano complex[26]; (B) Schematic illustration of the binary system for miRNA tracking in the single cells[30]; (C) Schematic illustration of the aggregation-induced emission (AIE)-based in situ telomerase activity detection and imaging[34]; (D) Schematic illustration of double fluorescent signal bioprobe for detection of extracellular and intracellular telomerase activity[36]

基于FRET原理的檢測中包括能量受體和能量給體兩個(gè)部分。在能量受體方面，自2004年Novoselov等[24]發(fā)現(xiàn)石墨烯以來，石墨烯由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)以及優(yōu)異的電學(xué)、光學(xué)、力學(xué)和熱學(xué)等性能，在催化、能源、防腐、電子器件和化學(xué)及生物傳感等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。其中氧化石墨烯由于其良好的分散性、水溶性以及生物相容性而在生物化學(xué)傳感領(lǐng)域得到了較好的發(fā)展。作為一種二維碳納米材料，石墨烯具有較大的比表面積和較強(qiáng)的熒光淬滅能力，可作為一種有效的生物載體將生物分子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)部[25]?；谝陨显恚琖ang等[26]將標(biāo)記有FAM熒光基團(tuán)的核酸適配體和氧化石墨烯(GO)結(jié)合，構(gòu)建納米復(fù)合物，利用細(xì)胞的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。核酸適配體結(jié)合細(xì)胞質(zhì)中的ATP而脫離GO表面，此時(shí)熒光基團(tuán)FAM遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)GO，因此發(fā)射熒光，利用激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞質(zhì)中ATP的可視化成像分析(圖2A)。Xing等[27]利用GO能強(qiáng)烈吸附熒光標(biāo)記的單鏈DNA(ssDNA)并淬滅其熒光的能力，將GO引入單標(biāo)記核酸熒光探針檢測體系，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸序列、離子、蛋白質(zhì)及小分子等目標(biāo)分子的檢測。

除GO外，還有一種功能納米材料-納米金在細(xì)胞成像中也被廣泛應(yīng)用。納米金在可見光區(qū)有很強(qiáng)的吸收，且生物相容性好，表面易于功能化修飾，是優(yōu)良的能量受體，同時(shí)還可以通過增強(qiáng)熒光分子吸收以及輻射衰減等途徑增強(qiáng)熒光發(fā)射[28]。Qian等[29]設(shè)計(jì)一種基于帶缺口MB探針構(gòu)建而成的功能化納米探針，用于原位檢測單細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性。MB探針標(biāo)記有端粒酶引物(TSP)，有端粒酶時(shí)，端粒酶可引發(fā)TSP以重復(fù)片段擴(kuò)增，導(dǎo)致內(nèi)部鏈取代和雜交并打開MB探針的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，此時(shí)端粒酶被“點(diǎn)亮”，通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測端粒酶活性在不同劑量與端粒酶活性相關(guān)藥物作用下的變化，實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞體系內(nèi)原位定量檢測端粒酶活性并區(qū)分腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞。該研究方法為端粒酶活性相關(guān)的生物學(xué)研究、腫瘤的臨床診斷和治療提供了潛在工具。Qian等[30]以納米金為能量受體，熒光基團(tuán)Cy5作為能量給體，將不同DNA序列的MB1探針和MB2探針分別標(biāo)記在納米金上。分子信標(biāo)(MB1和MB2)探針的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)非常臨近，所以分子信標(biāo)(MB1和MB2)探針自身不發(fā)射熒光。 miRNA存在時(shí)，它和分子信標(biāo)探針的環(huán)狀部分結(jié)合，打開分子信標(biāo)(MB1和MB2)探針，使得熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離，因此發(fā)射熒光。通過監(jiān)測熒光信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞體系中對(duì)miRNA檢測，同時(shí)納米金聚集，其最大吸收峰向近紅外波段移動(dòng)，更有利于光熱治療，殺死癌細(xì)胞(圖2B)。Pan等[31]將標(biāo)記有Alexa Fluor 488的MB1探針和標(biāo)記有Cy3的MB2探針同時(shí)標(biāo)記在納米金上，此時(shí)分子信標(biāo)(MB1和MB2)探針的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)非常臨近，因此分子信標(biāo)(MB1和MB2)探針不發(fā)射熒光。當(dāng)有Survivn RNA存在時(shí)，它和MB1探針的環(huán)狀部分結(jié)合，打開MB1探針，使得熒光基團(tuán)Alexa Fluor 488遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，因此Alexa Fluor 488發(fā)射熒光。當(dāng)TK1Mrna存在時(shí)，它和MB2探針的環(huán)狀部分結(jié)合，打開MB2探針，使得熒光基團(tuán)Cy3遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，且此時(shí)熒光基團(tuán)Alexa Fluor 488和熒光基團(tuán)Cy3的距離較近，可有效發(fā)生FRET現(xiàn)象，通過監(jiān)測FRET信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞體系中檢測多重mRNA。

在能量給體方面，隨著新材料技術(shù)的發(fā)展，也取得了一些新的突破。傳統(tǒng)的熒光染料在高濃度時(shí)或聚集狀態(tài)下，熒光淬滅，即聚集誘導(dǎo)淬滅(ACQ)現(xiàn)象。2001年Tang等[32]發(fā)現(xiàn)一類分子在溶液中幾乎不發(fā)光，而在聚集狀態(tài)或固態(tài)會(huì)發(fā)出很強(qiáng)的熒光，即聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)現(xiàn)象，大大拓寬了熒光探針在生化傳感領(lǐng)域中的應(yīng)用范圍。與傳統(tǒng)的熒光探針相比，AIE探針具有優(yōu)越的抗漂白能力和更高的可靠性[33]?；贏IE分子的獨(dú)特發(fā)光效應(yīng)，Zhuang等[34]在端粒酶引物5’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，無端粒酶時(shí)，引物無法擴(kuò)增，帶有正電荷的AIE分子與核酸分子通過靜電作用力結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，此時(shí)AIE分子聚集狀態(tài)弱，且AIE分子與淬滅基團(tuán)非常臨近，AIE分子的熒光被淬滅; 有端粒酶時(shí)，引物以重復(fù)片段擴(kuò)增[35]，擴(kuò)增片段會(huì)繼續(xù)與AIE分子通過靜電作用力結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，此時(shí)AIE分子以聚集狀態(tài)存在，且遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，因此AIE分子發(fā)射熒光。通過監(jiān)測AIE分子熒光信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞體系中檢測端粒酶活性(圖2C)。在單細(xì)胞成像時(shí)，該研究方法大大降低了背景熒光信號(hào)干擾，增加了檢測方法的可靠性。同時(shí)，該課題組[36]在端粒酶引物標(biāo)記淬滅基團(tuán)可降低背景熒光信號(hào)干擾的基礎(chǔ)上，還利用最大發(fā)射波長為藍(lán)光波段的AIE分子和紅光波段的AIE分子彼此之間可產(chǎn)生FRET現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞體系中檢測端粒酶活性，大大拓寬檢測范圍(圖2D)。

2.2.2基于親疏水作用力檢測的單標(biāo)記核酸熒光探針傳統(tǒng)核酸熒光探針在設(shè)計(jì)和應(yīng)用時(shí)，需要標(biāo)記熒光基團(tuán)和輔助基團(tuán)(淬滅基團(tuán)或能量匹配基團(tuán))，另外還需考慮熒光基團(tuán)的標(biāo)記位置(末端或內(nèi)部修飾)，增加熒光探針的設(shè)計(jì)難度及應(yīng)用成本、降低對(duì)生物活性物質(zhì)檢測靈敏度和特異性。利用傳統(tǒng)核酸熒光探針進(jìn)行單細(xì)胞成像研究時(shí)，需反復(fù)洗滌，除去未與目標(biāo)分子結(jié)合的熒光探針，以降低背景信號(hào)。該方法操作步驟繁瑣，限制了其實(shí)際應(yīng)用。近年來，研究者在開發(fā)新型熒光探針時(shí)，越來越關(guān)注物質(zhì)的本源特性[37]，如吸光性、親疏水性等物理化學(xué)性質(zhì)，其中親疏水作用力作為生命活動(dòng)兩大作用力之一，具有響應(yīng)迅速、特異性識(shí)別目標(biāo)分子能力強(qiáng)、無需額外引入輔助物質(zhì)等特性，引起研究者關(guān)注 (圖3)。

圖3 (A) 基于端粒酶引物延長和Exo Ⅲ輔助的二次放大策略示意圖[40]; (B) 基于DSN酶的催化放大策略和利用AIE功能核酸分子探針檢測單細(xì)胞體系中汞離子[41]; (C) 利用復(fù)合探針CF-DNA的親疏水可調(diào)控性能，檢測細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性[42]; (D) 基于共軛聚合物的熒光探針CP-DNA，應(yīng)用于端粒酶活性檢測中[43]Fig.3 (A) Schematic illustration of quadratic amplification strategy based on telomerase elongation reaction and Exo Ⅲ-aided reaction[40]; (B) Schematic illustration of DSN enzyme based catalytic amplification analysis of Hg2+ ions in living cells using AIEgens functional nucleic acids probe[41]; (C) Conjugated fluorene-DNA composite probe (CF-DNA) for sensitive detection of telomerase activity in living cells by turning the hydropathical profile of bipolar probes[42]; (D) Conjugated polymers-DNA for sensitive detection of telomerase activity in living cells[43]

Min等[38]利用TPE分子的聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性，及核酸DNA分子在蛋白酶的作用下的結(jié)構(gòu)可精確調(diào)控性能，對(duì)TPE分子進(jìn)行特殊修飾。通過Click反應(yīng)，將TPE分子與DNA分子共價(jià)鍵結(jié)合，構(gòu)建具有親疏水可調(diào)控性能的單標(biāo)記核酸熒光探針TPE-DNA。miRNA存在時(shí)，miRNA與核酸熒光探針TPE-DNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)作用，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，利用核酸外切酶Ⅲ識(shí)別DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的3’凹陷端并將其降解的特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA的循環(huán)檢測，進(jìn)一步調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度，可將檢測限降低到10 amol/L。但是TPE分子在紫外光照射下，發(fā)射藍(lán)色熒光，在進(jìn)行單細(xì)胞成像研究時(shí)，易受生物自體熒光信號(hào)干擾。該課題組繼而對(duì)TPE分子進(jìn)行特殊修飾，使其在紫外光照射下發(fā)射黃色熒光，并將其與DNA共價(jià)鍵結(jié)合，形成具有親疏水性可調(diào)控的單標(biāo)記核酸熒光探針TPEPy-DNA，并利用該探針監(jiān)測活細(xì)胞內(nèi)miRNA[39]和端粒酶活性[40](圖3A)。與傳統(tǒng)的單標(biāo)記核酸熒光探針相比，該探針在進(jìn)行單細(xì)胞成像研究時(shí)，具有很好的光穩(wěn)定性。此外，該課題組[41]還將TPE衍生物與DNA共價(jià)鍵結(jié)合，構(gòu)建具有親疏水可調(diào)控性能的單標(biāo)記核酸熒光探針AFNAs，Hg2+可特異性識(shí)別堿基T，并形成穩(wěn)定的復(fù)合物，通過調(diào)控單標(biāo)記熒光探針AFNAs的聚集狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞體系內(nèi)檢測Hg2+(圖3B)。

Xia課題組根據(jù)生物活性物質(zhì)調(diào)控單標(biāo)記核酸熒光探針的親疏水性質(zhì)及聚集狀態(tài)能力不同，利用共軛聚合物穩(wěn)定的光電性質(zhì)及光學(xué)信號(hào)倍增特性，開發(fā)出兩種基于共軛芴分子的單標(biāo)記核酸熒光探針。一種是基于分子量為700共軛芴的單標(biāo)記核酸熒光探針 (圖3C)[42]; 另一種為基于分子量>5000共軛聚合芴的單標(biāo)記核酸熒光探針 (圖3D)[43]。利用這兩種具有親疏水可調(diào)控性質(zhì)的單標(biāo)記核酸熒光探針?biāo)鶚?gòu)建的生物/化學(xué)傳感器，僅靠調(diào)控探針的親疏水性，引起疏水基團(tuán)“聚集”和“分散”兩種狀態(tài)變化，即可產(chǎn)生相應(yīng)熒光信號(hào)變化，通過監(jiān)測熒光信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)在緩沖溶液體系、復(fù)雜樣本體系中對(duì)核酸(DNA、RNA)序列、蛋白質(zhì)、離子及生物小分子等目標(biāo)分子的高靈敏、高特異性、高效檢測。另外將該探針引入到活細(xì)胞體系中，實(shí)現(xiàn)了在單細(xì)胞體系中端粒酶活性檢測。

2.3 基于靜電作用力檢測的免標(biāo)記核酸熒光探針

免標(biāo)記熒光分析法，由于無需對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記，探針的設(shè)計(jì)與合成較簡單，合成與純化周期短。Qian等[44]以多孔硅納米粒子(MSN)為載體，在MSN孔道內(nèi)共價(jià)固定熒光淬滅劑BHQ和填充熒光素，通過靜電吸附在其表面包裹含有端粒酶底物片段的DNA鏈，將熒光素封堵在孔道內(nèi)。在端粒酶的作用下，端粒酶引物擴(kuò)增，導(dǎo)致探針擴(kuò)增產(chǎn)物的兩端雜交形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)而脫離MSN表面，從而打開孔道，釋放熒光素，此時(shí)熒光素遠(yuǎn)離淬滅劑BHQ，因此發(fā)射熒光。通過檢測熒光信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)檢測端粒酶活性(圖4A)。

共軛聚合物由于具有獨(dú)特的分子線效應(yīng)、強(qiáng)光捕獲以及信號(hào)放大的特性，引起研究者們關(guān)注[45]。但共軛聚合物為疏水材料，而生物分子通常需在均相水溶液體系中才可保持其生物活性。為將共軛聚合物引入熒光探針檢測傳感體系，Lv等[46]對(duì)共軛聚合物的支鏈進(jìn)行特殊修飾，合成出水溶性共軛聚合物。同時(shí)利用水溶性共軛聚合物與生物活性分子間的靜電作用力，實(shí)現(xiàn)在均相水溶液體系中對(duì)目標(biāo)分子檢測[47]，并成功將該功能納米材料引入活細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)對(duì)目標(biāo)分子準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)、原位監(jiān)測[48](圖4B)。但傳統(tǒng)的水溶性共軛聚合物在對(duì)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)分子進(jìn)行檢測時(shí)，多使用近紫外或白光光源。每種光的組織穿透性與其波長密切相關(guān)，波長越短，組織穿透性越弱，而近紫外及白光的波長范圍為200～780 nm， 表明組織穿透能力有限，當(dāng)深層組織感染細(xì)菌的時(shí)候，近紫外及白光作光源的光動(dòng)力療法將無能為力。Li等[49]將水溶性共軛聚合物與上轉(zhuǎn)換納米材料結(jié)合起來，以980 nm的近紅外光作為激發(fā)光源，激發(fā)上轉(zhuǎn)換納米材料，繼而通過FRET原理激發(fā)水溶性共軛聚合物，利用水溶性共軛聚合物產(chǎn)生的單線態(tài)氧或活性氧物質(zhì)達(dá)到殺菌目的。

圖4 (A) 免標(biāo)記熒光分析法檢測細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性[44]; (B) 在近紅外光下，利用共軛聚合物微球作為光熱轉(zhuǎn)換器，監(jiān)測活細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)狀況[48]; (C) 基于AIE分子的免標(biāo)記法檢測細(xì)胞提取物中端粒酶活性[50]; (D) 基于氧化石墨烯平臺(tái)免標(biāo)記的分子信標(biāo)探針檢測端粒酶活性[51]。Fig.4 (A) Label-free fluorescence assay used for detection of intracellular telomerase activity[44]; (B) strategy to remotely control the gene expression in living cells with CPNs-Tat as photothermal transducer under NIR light[48]; (C) label-free fluorescence assay for telomerase activity [50]; (D) schematic illustration of GO-based platform for telomerase activity detection using label-free beacon[51]

免標(biāo)記熒光分析法中所用的熒光分子有很多種，其中AIE分子由于其獨(dú)特的發(fā)光體系已經(jīng)成為了一種強(qiáng)有力的分析工具，被廣泛應(yīng)用于設(shè)計(jì)高靈敏度和高選擇性的“turn-on”型生物熒光探針和生物化學(xué)傳感器。利用AIE分子的獨(dú)特發(fā)光效應(yīng)，核酸探針不再需要標(biāo)記淬滅基團(tuán)或者輔助基團(tuán)，一條簡單的免標(biāo)記核酸探針即可高效地完成對(duì)目標(biāo)物的檢測，極大地簡化了傳統(tǒng)核酸探針的結(jié)構(gòu)，降低探針的設(shè)計(jì)、合成成本及操作難度?；陟o電吸引力，Lou等[50]設(shè)計(jì)了一種基于AIE效應(yīng)的免標(biāo)記核酸探針，用于檢測單細(xì)胞體系和病人組織樣本中端粒酶活性。無端粒酶時(shí)，端粒酶引物帶有大量負(fù)電荷與帶有正電荷的AIE分子通過靜電作用力，形成復(fù)合物，此時(shí)AIE分子以分散態(tài)存在，熒光較弱; 有端粒酶時(shí)，端粒酶引物以重復(fù)片段擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物可與大量AIE分子結(jié)合，形成復(fù)合物，此時(shí)AIE分子以聚集狀態(tài)存在，熒光增強(qiáng)。通過監(jiān)測AIE分子熒光信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞體系和病人組織樣本中的端粒酶活性檢測(圖4C)。但是傳統(tǒng)的AIE分子，如TPE-Z在紫外光的照射下，呈藍(lán)色熒光，而生物材料的自體熒光也為藍(lán)色，在進(jìn)行單細(xì)胞成像研究時(shí)，檢測信號(hào)易受背景信號(hào)干擾，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。為了降低背景信號(hào)干擾，該課題組[51]利用GO吸附單鏈DNA、解吸附雙鏈DNA的功能，設(shè)計(jì)一條MB探針，其環(huán)狀部分可與端粒酶引物擴(kuò)增片段互補(bǔ)配對(duì)。無端粒酶時(shí)，MB探針與AIE分子通過靜電作用力結(jié)合并形成復(fù)合物，由于其環(huán)狀部分為單鏈DNA，被吸附在GO表面，此時(shí)熒光基團(tuán)AIE分子與GO距離較近，AIE分子的熒光被GO淬滅，因此不發(fā)射熒光; 有端粒酶時(shí)，端粒酶引物擴(kuò)增，擴(kuò)增片段與MB的環(huán)狀部分通過堿基互補(bǔ)配對(duì)作用結(jié)合并形成復(fù)合物，打開MB探針，并從GO表面解吸附，此狀態(tài)下，熒光基團(tuán)AIE分子與GO遠(yuǎn)離，因此發(fā)射熒光。通過監(jiān)測AIE分子熒光信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)病人組織樣本中端粒酶活性檢測。該方法降低背景熒光信號(hào)干擾，提高檢測信噪比，大大拓寬癌細(xì)胞端粒酶提取物檢測的線性范圍(圖4D)。該課題組[52]還利用調(diào)控DNA鏈的長短調(diào)控AIE分子的聚集狀態(tài)并產(chǎn)生相應(yīng)熒光信號(hào)響應(yīng)的特性，將線性腫瘤抑制基因p53片段通過連接酶的作用連接成環(huán)狀DNA，一旦這些環(huán)狀的p53片段被紫外輻射損傷，滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)將不能順利進(jìn)行，熒光信號(hào)急劇下降，最終實(shí)現(xiàn)光損傷的超靈敏檢測。該課題組[53]還將AIE分子應(yīng)用于固體表面檢測目標(biāo)分子，通過調(diào)控芯片表面的親疏水性，實(shí)現(xiàn)在固體芯片表面對(duì)miRNA高靈敏檢測。

3 結(jié) 論

熒光分析法具有靈敏度高、無需參比、不受電磁場影響等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞成像研究中。目前，新型核酸熒光探針應(yīng)用于單細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像研究已取得顯著成果，但也存在一些問題需，要進(jìn)一步探索：(1)核酸熒光探針的穩(wěn)定性及安全性。傳統(tǒng)核酸熒光探針，尤其是有機(jī)熒光探針，在進(jìn)行單細(xì)胞成像研究時(shí)，不穩(wěn)定、易被漂白、生物毒性大。隨著納米材料的不斷發(fā)展，功能核酸熒光探針取得了較好的發(fā)展，但仍需進(jìn)一步改進(jìn)，合成具有更好的生物相容性、更長的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間、更低的毒性、易代謝的熒光探針，以使核酸熒光探針更好地應(yīng)用于單細(xì)胞成像研究及活體實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)示蹤和臨床醫(yī)學(xué)診斷及治療。(2)近紅外核酸熒光探針的制備。雖然在可見光條件下的核酸熒光探針應(yīng)用于單細(xì)胞成像已經(jīng)得到了一些滿意的結(jié)果，但由于生物材料對(duì)可見光的強(qiáng)烈吸收和散射，使得單細(xì)胞成像尤其在活體示蹤成像的深度僅局限在10-2m內(nèi)，更深組織的成像還依賴于近紅外熒光探針的發(fā)展。