馬鈴薯外敷藥膏對膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性滑膜炎白細(xì)胞介素1β表達(dá)的影響*

吳建民 ，劉 曉 ，謝 千 ，李 寧

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2 蘭州市靖遠(yuǎn)路社區(qū)衛(wèi)生中心；3甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性滑膜炎是骨傷科常見病之一，本病是由于膝關(guān)節(jié)滑膜受到急性創(chuàng)傷等刺激引起的滑膜水腫、滲出產(chǎn)生關(guān)節(jié)積液的一種非感染性炎癥反應(yīng)，屬中醫(yī)“痹癥”“鶴膝風(fēng)”等范疇［1］。輕者可見膝關(guān)節(jié)腫痛、屈伸不利，嚴(yán)重者出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形甚至功能喪失。目前西醫(yī)治療主要以激素、非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥、封閉抽吸法治療，但不良反應(yīng)較多，效果不理想。近年來，中醫(yī)藥在治療滑膜炎方面顯示出良好的療效，并且痛苦小、不良反應(yīng)較少［2］。馬鈴薯外敷藥膏是我科在長期的臨床實踐中總結(jié)的經(jīng)驗方，對膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性滑膜炎的治療具有良好的消炎鎮(zhèn)痛效果，為探討其治療的作用機制，本研究選用新西蘭大白兔為研究對象，觀察馬鈴薯外敷藥膏對白介素1β(IL-1β)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級新西蘭大白兔40只，雌雄各半，3～4 月齡，體質(zhì)量 2.2～2.8 kg，由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心提供，動物實驗許可證號：SYXK(軍)2012-0029。實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飲水飼料充足，光照節(jié)律 12 L/12D(7∶00-19∶00)，溫度(23±2)℃，相對濕度(50±10)%。

1.2 藥物與儀器 馬鈴薯外敷藥膏制備材料：馬鈴薯(自購)、明礬及冰片(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，批號：1714590，5707600)；制備方法：將馬鈴薯洗凈，放入器皿中搗成泥，撒上明礬和冰片(比例為馬鈴薯∶明礬∶冰片 =100∶4∶1)，充分?jǐn)噭?，冷藏保?制作1次馬鈴薯外敷藥膏最多為2天用藥量)；扶他林(北京諾華制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H19990291)。兔IL-1β酶聯(lián)免疫分析試劑盒(大連范邦化工技術(shù)開發(fā)有限公司)；3%戊巴比妥鈉、8%硫化鈉(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心提供)。鋼制兔臺、千分卡尺(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心提供)；“英迪”KWD-808-I型脈沖針灸治療儀(廣州康哲醫(yī)療器械有限公司)；HADAIA360型全自動熒光磁微粒酶免分析系統(tǒng)/酶聯(lián)免疫分析儀(日本)。

1.3 造模方法 借鑒易世宏等［3］建立的膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性滑膜炎動物模型，具體方法如下：將新西蘭大白兔固定，剪去右后肢膝關(guān)節(jié)周圍的毛，用8%的硫化鈉將剪剩的毛褪去，暴露皮膚。用3%戊巴比妥鈉按照1 mL/kg的比例由造模兔耳緣靜脈緩慢推注麻醉，然后將兔側(cè)臥于實驗臺上，造模肢朝上，用針灸針垂直刺入兔造模肢股四頭肌中點和腓腸肌中點，連接“英迪”KWD-808-I型脈沖針灸治療儀，使用連續(xù)波波形，頻率始終保持為50 Hz，強度固定在6.0 mA，使其膝關(guān)節(jié)不停地重復(fù)被動屈伸從而造成膝關(guān)節(jié)滑膜的損傷，每天2次，每次45分鐘，連續(xù)進(jìn)行10天。

1.4 分組與給藥 將40只新西蘭大白兔隨機分為正常組、模型組、馬鈴薯外敷藥膏組和扶他林乳膠劑組，每組10只。剔除大白兔膝關(guān)節(jié)周圍體毛，馬鈴薯外敷藥膏組給藥劑量約為18 g/次，扶他林乳膠劑組給藥劑量約為1.2 g/次，分別涂于受試兔右后肢膝關(guān)節(jié)損傷部位，范圍在膝關(guān)節(jié)上下各4 cm以內(nèi)，每天敷藥2次，每次90分鐘，連續(xù)進(jìn)行5天。正常組和模型組未給予藥物處理。

1.5 標(biāo)本采集與存儲 干預(yù)治療完成后，隔日采用空氣栓塞法將新西蘭大白兔處死，切開各組受試兔右后肢膝關(guān)節(jié)囊，用1 mL生理鹽水灌洗關(guān)節(jié)腔，回抽收集關(guān)節(jié)液將關(guān)節(jié)液置于已硅化試管中，4℃、1800r/min離心10分鐘，將上清液置于-80℃冰箱冷凍保存待用。

1.6 指標(biāo)檢測與方法

1.6.1 大體觀察 通過肉眼大體觀察各組動物受試膝關(guān)節(jié)周圍的皮色、關(guān)節(jié)液的色質(zhì)和滑膜厚度的變化情況。

1.6.2 受試關(guān)節(jié)周徑的測定 模型建立開始(第1天)至治療結(jié)束(第15天)，在各組大白兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)外兩側(cè)用記號筆標(biāo)記好固定的2點，使用千分卡尺和尼龍帶在固定點每天測量受試膝關(guān)節(jié)周徑，觀察各組之間的變化情況。

1.6.3 受試關(guān)節(jié)表面溫度測定 在各組大白兔右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)標(biāo)記固定不變的2個點，用數(shù)字體溫計探針在標(biāo)記的固定點每天測量造模開始至干預(yù)治療結(jié)束后各組動物受試膝關(guān)節(jié)溫度，觀察之間的變化情況。

1.6.4 白細(xì)胞介素1β(IL-1β) IL-1β測定嚴(yán)格按照試劑盒檢測說明書操作，實驗結(jié)果以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。具體步驟：稀釋對照品→加樣品及對照品→加酶→顯色液→加入終止液→15分鐘內(nèi)450nm波長測OD值，根據(jù)OD值和標(biāo)準(zhǔn)物濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將OD值代入相應(yīng)公式計算最終濃度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用(±s)表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔膝關(guān)節(jié)皮色、關(guān)節(jié)液色質(zhì)及滑膜厚度 各組大白兔膝關(guān)節(jié)皮色、關(guān)節(jié)液色質(zhì)及滑膜厚度大體觀察結(jié)果。見表1。

表1 各組兔膝關(guān)節(jié)皮色、關(guān)節(jié)液色質(zhì)及滑膜厚度大體觀察

2.2 兔膝關(guān)節(jié)周徑及表面溫度 大白兔膝關(guān)節(jié)周徑及表面溫度的測定結(jié)果。見表2。

2.3 馬鈴薯外敷藥膏對大白兔IL-1β表達(dá)的影響 與空白組相比，IL-1β的表達(dá)模型組最高，馬鈴薯外敷藥膏組次之，扶他林乳膠劑組最少；各組IL-1β與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；馬鈴薯外敷藥膏組與扶他林乳膠劑組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)上意義(P＞0.05)。見表3。

表2 各組兔膝周徑及表面溫度結(jié)果比較(±s)

表2 各組兔膝周徑及表面溫度結(jié)果比較(±s)

注：＊表示與模型組比較，P＜0.01，#表示與扶他林乳膠組比較，P＞0.05

組別 只數(shù) 關(guān)節(jié)周徑/cm 表面溫度/℃空白組 10 0.13±0.03＊ 35.81±0.24＊模型組 10 0.43±0.07 37.32±0.26馬鈴薯外敷藥膏組 10 0.23±0.02＊# 37.01±0.11＊#扶他林乳膠劑組 10 0.22±0.03＊ 36.97±0.15＊

表3 各組兔關(guān)節(jié)液中IL-1β和TN F-α表達(dá)比較(±s)

表3 各組兔關(guān)節(jié)液中IL-1β和TN F-α表達(dá)比較(±s)

注：＊表示與模型組比較，P＜0.01；△表示與扶他林乳膠組比較，P＞0.05

組別 只數(shù) IL-1β/(pg·mL-1)空白組 10 11.07±0.23＊模型組 10 13.82±0.82馬鈴薯外敷藥膏組 10 11.26±0.34＊Δ扶他林乳膠劑組 10 11.24±0.22＊

3 討論

膝關(guān)節(jié)是人體最復(fù)雜、滑膜分布最廣的關(guān)節(jié)，且關(guān)節(jié)負(fù)重大、活動頻繁、易受到損傷，成為滑膜炎的高發(fā)部位［4］?；な艿綋p傷后，血管擴張，產(chǎn)生大量滲出液，同時滑膜細(xì)胞產(chǎn)生大量黏液素［5］。有效緩解膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性滑膜炎患者關(guān)節(jié)疼痛癥狀，減輕炎癥反應(yīng)并促進(jìn)損傷軟骨修復(fù)被認(rèn)為是膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性滑膜炎臨床治療的關(guān)鍵［6］。本病屬于祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“痹證”“鶴膝風(fēng)”等范疇，由內(nèi)因和外因相互作用而發(fā)病，先天稟賦不足、虛損勞倦為內(nèi)因，外感風(fēng)寒濕邪、筋脈瘀阻為外因，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)經(jīng)脈失養(yǎng)，氣機不暢，不榮則痛，不通則痛。治療以活血化瘀、消腫止痛、利水滲濕為主。

馬鈴薯外敷藥膏是我科在臨床實踐中總結(jié)的治療膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性滑膜炎的經(jīng)驗方，該方由馬鈴薯、明礬及冰片組成，方中馬鈴薯性平味甘，具有解毒消腫、生肌止痛之功效；明礬性寒，味酸澀，有解毒殺蟲，燥濕止癢等功效；冰片辛、苦，微寒，具有開竅醒神，清熱止痛的功效。三藥合用，共奏消腫止痛、活血祛瘀、清熱解毒之功?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯抗菌抗炎的主要成分有生物活性肽、糖苷生物堿及酚類化合物等。黃志宏等［7］通過小鼠耳腫脹實驗、大鼠足跖腫脹實驗研究證實馬鈴薯總糖苷生物堿具有較強的抗炎活性。唐霞珠等［8］研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯片外敷能明顯降低靜脈炎發(fā)生率，減輕炎性程度。陳文等［9］以銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌為研究對象，通過抑菌實驗證實明礬混懸液具有較強的體外抑菌作用。冰片有效成分主要為右旋龍腦、左旋龍腦或異龍腦等。常頌平等［10］研究發(fā)現(xiàn)冰片的最低抑菌濃度為5%、殺菌濃度為10%，并且在電鏡下觀察到冰片能破壞真菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，使真菌溶解。

在滑膜炎發(fā)生發(fā)展中，有多種細(xì)胞因子參與并介導(dǎo)其炎癥過程，其中IL-1β在全身性及局部性炎癥中起著關(guān)鍵性的作用。Benito等［11］研究發(fā)現(xiàn)在骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中出現(xiàn)炎性因子的過度表達(dá)，而這些炎性因子是該疾病進(jìn)展的重要遞質(zhì)，主要有IL-1β、TNF-α等。本研究結(jié)果表明，IL-1β的表達(dá)模型組最高，馬鈴薯外敷藥膏組次之，扶他林乳膠劑組最少。與模型組比較，馬鈴薯外敷藥膏組IL-1β的表達(dá)水平顯著降低，提示其能夠抑制炎癥細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)，在分子水平上揭示了馬鈴薯外敷藥膏治療膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性滑膜炎的療效機制。然而，本實驗也存在不足之處，雖然馬鈴薯外敷藥膏可以抑制IL-1β的表達(dá)，但其抑制IL-1β表達(dá)的最佳時間、最佳濃度仍需進(jìn)一步去探索。