彩色棉多藥和有毒化合物輸出蛋白MATE家族基因的鑒定及表達(dá)分析

王作敏 劉 瑾 孫士超 張新宇 薛 飛 李艷軍,* 孫 杰

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彩色棉多藥和有毒化合物輸出蛋白MATE家族基因的鑒定及表達(dá)分析

王作敏1劉 瑾1孫士超2張新宇2薛 飛2李艷軍2,*孫 杰2

1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 新疆石河子 832003;2石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆石河子 832003

植物多藥和有毒化合物輸出家族(multidrug and toxic compound extrusion, MATE)是一類可轉(zhuǎn)運(yùn)陽(yáng)離子染料、氨基葡糖、多種抗生素與藥物等次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。本研究利用生物信息學(xué)手段從陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定了MATE家族基因, 并從基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、染色體分布、基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式等方面對(duì)該基因家族特征進(jìn)行了比較分析。共鑒定出91個(gè)陸地棉基因, 命名為~。陸地棉MATE蛋白與擬南芥MATE蛋白均可分為A、B、C、D、E、F和G 7個(gè)亞家族, 其中84個(gè)GhMATE蛋白具有12個(gè)典型的跨膜結(jié)構(gòu)域。染色體定位顯示,家族成員定位在不同的25條染色體上, 共形成5個(gè)基因簇。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn), GhMATE家族基因在棉花各組織中均有表達(dá), 但表達(dá)模式各不相同, 其中和在棕色棉纖維中的表達(dá)量明顯高于在白色棉中, 表明它們可能與棕色棉纖維的顏色形成相關(guān)。本研究為進(jìn)一步解析棉花MATE家族基因的功能和作用機(jī)制積累了有價(jià)值的資料。

陸地棉; 彩色棉; MATE家族; 生物信息學(xué); 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

天然彩色棉成熟吐絮時(shí)纖維自身具有天然色彩[1]。其纖維在制成成品之前無(wú)需化學(xué)印染, 既可節(jié)省生產(chǎn)成本, 又可避免紡織品中化學(xué)染料對(duì)人體健康和環(huán)境造成的不良影響, 符合當(dāng)前人們注重健康、環(huán)保, 崇尚自然的消費(fèi)理念, 因此, 彩色棉及其紡織品的開(kāi)發(fā)和利用具有十分廣闊的市場(chǎng)前景[2-3]。然而, 天然彩色棉品種資源僅包括棕色和綠色兩大色系, 纖維顏色單一, 著色不均勻, 色牢度和色飽和度低[4], 這些問(wèn)題在很大程度上限制了彩色棉的利用和發(fā)展, 因此, 亟待對(duì)彩色棉纖維色澤品質(zhì)進(jìn)行改良以提高其市場(chǎng)價(jià)值。

棕色棉纖維色素形成的前體物質(zhì)是原花青素[5-6], 又稱縮合丹寧, 是一類通過(guò)植物類黃酮次生代謝途徑合成的聚多酚類化合物[5-7]。原花青素生物合成途徑的研究已取得巨大進(jìn)展, 已知經(jīng)公共苯丙烷途徑、核心類黃酮-花青素途徑、原花青素特異途徑生成原花青素的前體物質(zhì)表兒茶素[8-10]。原花青素的前體物質(zhì)是在細(xì)胞質(zhì)中合成的, 需經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)揭号輧?nèi)聚合生成多聚體才能呈現(xiàn)出各種顏色[11]。MATE家族蛋白(multidrug and compound extrusion)在原花青素的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用, 因此,基因可用作利用基因工程技術(shù)改良彩色棉纖維色澤品質(zhì)的候選基因[12-13]。

MATE是一個(gè)新型的多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族, 分布于原核生物、真核生物中, 大部分成員都有12個(gè)跨膜區(qū)域, 此類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)氨基葡糖、陽(yáng)離子染料、多種抗生素和藥物具有轉(zhuǎn)運(yùn)作用[14-15]。研究者對(duì)擬南芥MATE家族的研究較為透徹, 擬南芥中至少有56個(gè)基因, 根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系可分為7個(gè)亞家族, 分別在Fe3+和Al3+等金屬離子、類黃酮、四甲胺、水楊酸等次級(jí)代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮作用[16-17]。擬南芥基因編碼一種類黃酮循環(huán)必需的MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 定位于液泡膜上, 它利用膜兩側(cè)的H+/Na+濃度梯度作為推動(dòng)力, 將胞漿內(nèi)合成的花青素、原花青素等多酚類色素的單體物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡等亞細(xì)胞器官中[18-19]。蒺藜苜蓿能促進(jìn)液泡吸收單寧的前體物質(zhì)表兒茶素-3’-0-葡萄糖苷, 將轉(zhuǎn)入擬南芥突變體, 可以使其種皮顏色恢復(fù)至野生型, 同時(shí)原花青素的含量也恢復(fù)至野生型水平, 表明是蒺藜苜宿中原花青素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵基因[12,20]。蘋(píng)果和在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中均與聚為一類, 將這2個(gè)基因分別轉(zhuǎn)入擬南芥突變體, 均可以使突變體恢復(fù)至野生型, 表明和是蘋(píng)果中轉(zhuǎn)運(yùn)原花青素的關(guān)鍵基因[21]。

迄今為止, 陸地棉中僅分離出2個(gè)MATE家族基因[6,22], 陸地棉基因組測(cè)序的完成使得MATE家族基因的鑒定工作成為可能。本研究鑒定陸地棉中的MATE家族基因, 全面、系統(tǒng)地解析基因的基本信息、保守域結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、染色體定位以及組織表達(dá)分析等信息, 為進(jìn)一步克隆和利用棉花基因改良棉纖維的色澤品質(zhì)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 陸地棉MATE家族基因的鑒定

以已克隆的陸地棉基因(CotAD_26128)的氨基酸序列作為查詢(Query)序列, 利用BlastP從陸地棉全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.cottongen.org/)中搜索MATE家族基因, 初步篩選出基因序列。用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)和Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/)軟件鑒定陸地棉基因編碼的蛋白序列是否存在跨膜結(jié)構(gòu), 設(shè)置參數(shù)為缺省值, 去除非全長(zhǎng)的短片段以及相同基因的冗余序列, 保存完整且具有表達(dá)信息的基因序列用于下一步分析, 最終確定陸地棉基因組中MATE家族基因的序列。

1.2 MATE家族基因編碼的氨基酸序列分析

利用ExPAsy (http://web.expasy.org/)在線工具分析陸地棉MATE家族蛋白的基本理化性質(zhì), 如氨基酸序列的等電點(diǎn)(pI)、蛋白質(zhì)殘基數(shù)(aa)。利用陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.cottongen.org/)分析開(kāi)放閱讀性框(ORF)。利用Softberry (http://www. softberry.com/)和PSORT (http://psort.hgc.jp/form. html)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3 MATE家族基因進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

利用MEGA6.0提供的ClustalW程序?qū)?1個(gè)陸地棉和56個(gè)擬南芥的MATE蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì), 然后通過(guò)鄰位相連法(Neighbor-Joining, NJ, BootStrap = 1000)構(gòu)建陸地棉和擬南芥中基因家族的復(fù)合進(jìn)化樹(shù)。從擬南芥網(wǎng)站(http://www. arabidopsis.org/)下載擬南芥MATE蛋白序列。

1.4 MATE家族基因的結(jié)構(gòu)分析

采用DNAMAN和ClustalX對(duì)MATE家族蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì); 利用在線軟件TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/)預(yù)測(cè)MATE蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain, TM); 從陸地棉全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)下載MATE家族基因的外顯子和內(nèi)含子信息, 利用在線軟件Gene Structure Display Server (GSDS) (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析陸地棉基因外顯子–內(nèi)含子(intron–exon)的數(shù)目及分布。

1.5 陸地棉MATE家族基因的染色體定位分析

從陸地棉全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得MATE家族基因的染色體定位信息, 以及陸地棉各條染色體的長(zhǎng)度信息, 利用MapInspect軟件繪制GhMATE家族基因的染色體定位圖。

1.6 陸地棉MATE家族基因在棉花不同組織中的表達(dá)分析

1.6.1 植物材料的準(zhǔn)備 陸地棉(L.)品種“新陸早33”、“新彩棉5號(hào)”由新疆石河子大學(xué)棉花所提供, 播種于石河子大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng), 常規(guī)管理。在棉花盛花期掛牌標(biāo)記當(dāng)日開(kāi)花的花蕾, 以第3天為時(shí)間節(jié)點(diǎn), 摘取3~27 DPA (days post-anthesis, 開(kāi)花后天數(shù))棉鈴, 室內(nèi)剝?nèi)∨咧榧袄w維; 取棉花種子用濃硫酸脫絨后播種于花盆(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=2∶1)中, 28℃培養(yǎng)2~3周, 待幼苗長(zhǎng)出2片真葉時(shí)將其拔出, 水培2 d之后取其根、莖、葉, 花從田間摘取。將上述植物材料液氮速凍后, 保存于–80℃冰箱, 用于提取RNA。

1.6.2 棉花總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

采用改良的CTAB酸酚法提取棉花樣品總RNA[23], 用DNase I處理后利用Nanodrop1000紫外分光光度技測(cè)定OD260和OD280值, 計(jì)算RNA的濃度與純度。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性, 保存于–80℃?zhèn)溆谩０凑沾筮B寶生物工程有限公司Reverse Transcriptase M-MLV (RNaseH-)說(shuō)明書(shū)合成cDNA第1鏈。

1.6.3 陸地棉MATE家族基因的qRT-PCR分析

根據(jù)陸地棉MATE家族基因的cDNA序列, 采用Primer5.0軟件在基因序列3′端特異性區(qū)域設(shè)計(jì)引物(表1), 擴(kuò)增片段約為200 bp。分別以白色棉“新陸早33”、棕色棉“新彩棉5號(hào)”幼苗的根、莖、葉、花和不同發(fā)育時(shí)期棉纖維cDNA為模板, 利用qRT-PCR方法檢測(cè)陸地棉MATE家族基因的表達(dá)情況, 內(nèi)參基因?yàn)?GenBank登錄號(hào)為DQ116441.1)。qRT-PCR反應(yīng)體系為10.0 μL, 其中cDNA 1 μL、2×FASTSYBR混合物5.0 μL、基因特異正向引物(10 μmol L–1) 0.2 μL、反向引物(10 μmol L–1) 0.2 μL, RNase-Free H2O 3.6 μL。qRT-PCR在LightCycler 480II系統(tǒng)上進(jìn)行, 反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性1 min; 95℃變性15 s, 56.5℃退火20 s, 72℃延伸30 s, 45個(gè)循環(huán)。按照2–??Ct計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)值。實(shí)驗(yàn)中采集每種材料3組重復(fù)樣品, 每個(gè)樣品的RNA提取需進(jìn)行3次重復(fù), 共計(jì)9組實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉MATE家族基因的鑒定與命名

用已克隆的棕色棉MATE基因(CotAD_26128)為探針序列, 在陸地棉全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https:// www.cottongen.org/)中比對(duì), 獲得了91個(gè)候選MATE家族基因, 分別命名為(表2)。彩色棉MATE家族基因的編碼序列(coding sequence, CDS)長(zhǎng)1119~1632 bp, 編碼374~548個(gè)氨基酸; 家族成員蛋白質(zhì)的分子量介于36.6~60.3 kD之間, 理論等電點(diǎn)介于5.17~9.22之間。對(duì)各成員蛋白序列的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明, 多數(shù)GhMATE (66個(gè))被定位在細(xì)胞膜上, 少數(shù)被定位在液泡膜(8個(gè))、葉綠體膜(7個(gè))和細(xì)胞質(zhì)膜(10個(gè))上(表2)。

表2 陸地棉MATE蛋白家族成員的鑒定

(續(xù)表2)

(續(xù)表2)

2.2 陸地棉MATE家族基因的進(jìn)化關(guān)系分析

圖1顯示, 56個(gè)擬南芥MATE蛋白被清晰地分成A、B、C、D、E、F、G 7個(gè)亞家族, 陸地棉MATE蛋白被分至不同的亞家族中。其中A亞家族是最大的一個(gè)進(jìn)化分支, 包括23個(gè)GhMATE家族成員, 其次是E、F和G亞家族各包括13個(gè)成員, B亞家族包括11個(gè)成員, C和D亞家族各包括9個(gè)成員。有13個(gè)基因和擬南芥基因聚在一個(gè)分支, 屬于E亞家族。

圖1 陸地棉、擬南芥MATE家族蛋白成員進(jìn)化分析

利用MEGA5.1軟件及鄰位相連法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù), 設(shè)置Bootstrap參數(shù)為1000次重復(fù), 有7個(gè)進(jìn)化分支被命名為A~G, 7種不同的顏色代表7個(gè)亞家族, N0.代表每個(gè)分支陸地棉的成員。

The phylogenetic tree was generated using the neighbor-joining criteria in MEGA 5.1 with 1000 Bootstrap replicates; the seven distinct clades were named as A–G. The seven different color boxes represent seven clades. N0. representsmembers in each clade.

2.3 陸地棉MATE家族基因的保守域和結(jié)構(gòu)分析

GhMATE家族成員含有10~13個(gè)TM, 其中GhMATE43蛋白含有13個(gè)TM, GhMATE25、GhMATE67、GhMATE70和GhMATE73含有11個(gè)TM, GhMATE24、GhMATE90含有10個(gè)TM, 剩余84個(gè)GhMATE蛋白均含有12個(gè)TM, 部分GhMATE蛋白的12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域如圖2所示。對(duì)獲得的91個(gè)GhMATE家族基因的內(nèi)含子和外顯子的個(gè)數(shù)和排布情況分析表明, 大多數(shù)基因(50個(gè))由7~8個(gè)外顯子和6~7個(gè)內(nèi)含子組成, 其中27個(gè)基因含有8個(gè)外顯子和7內(nèi)含子, 23個(gè)基因含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子; 23個(gè)基因僅由外顯子組成, 不含有內(nèi)含子, 這些基因分別存在于B、C、D、E、F和G亞家族中, 其中C和D亞家族中居多; 剩余的18個(gè)基因中, 3個(gè)基因由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成, 其他15個(gè)基因由2~6個(gè)外顯子和1~5個(gè)內(nèi)含子組成(圖3)。

圖2 不同亞家族中GhMATE蛋白的多重序列比對(duì)

圖3 陸地棉MATE基因的進(jìn)化樹(shù)和基因結(jié)構(gòu)比較

藍(lán)色表示UTR (上下游序列), 綠色表示編碼區(qū), 灰線表示內(nèi)含子區(qū)。

The blue shows the UTR, the green indicates the exon, and the gray indicates the intron.

2.4 陸地棉MATE家族基因的染色體定位

91個(gè)GhMATE家族成員分布在25條染色體上, 其中48個(gè)分布在13個(gè)A基因組上, 43個(gè)分布在12個(gè)D基因組上, Chr.D4染色體上未發(fā)現(xiàn)基因(圖4)。染色體Chr.A3上分布的基因最多, 為8個(gè); 其次是Chr.A11, 為7個(gè), Chr.D2、Chr.D5和Chr.D11上各分布6個(gè); 染色體Chr.A5、Chr.A9和Chr.A12上各分布5個(gè); 染色體Chr.A2、Chr.D9和Chr.D12上各分布4個(gè); 其余14個(gè)染色體上各分布1~3個(gè)。根據(jù)200 kb的核苷酸中含有3個(gè)以上基因即為1個(gè)基因簇的定義[24], GhMATE家族基因在3條染色體上形成了1個(gè)基因簇, 分別為Chr.A11 (和)、Chr.D2 (和)和Chr.D11 (和)。在Chr.A3染色體上形成了2個(gè)基因簇, 即形成1個(gè),形成了另1個(gè), 其他染色體上未形成基因簇。

圖4 陸地棉MATE家族基因染色體定位

2.5 陸地棉MATE家族基因的表達(dá)模式分析

從7個(gè)亞家族中分別選取20多個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)模式分析, 包括所有定位于液泡膜上的基因、13個(gè)E亞家族成員以及隨機(jī)選取的其他亞家族成員。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn), GhMATE家族基因在白色棉、棕色棉不同器官(根、莖、葉、花)及棉纖維細(xì)胞的不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)。根據(jù)qRT-PCR結(jié)果, 從中篩選出、、、、、和共7個(gè)在棕色棉纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因, qRT-PCR結(jié)果顯示,和基因在棕色棉纖維中的表達(dá)量明顯高于白色棉, 在棕色棉纖維中的表達(dá)量變化呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 分別在15DPA和21DPA達(dá)到最大值, 幾乎是白色棉纖維表達(dá)量的7~10倍。、和基因在棕色棉纖維中的表達(dá)量均高于白色棉纖維, 均在21 DPA時(shí)達(dá)到最大值, 但僅為白色棉表達(dá)量的1.0~1.8倍。和在15~27 DPA的棕色棉纖維中的表達(dá)量高于白色棉纖維, 但兩者表達(dá)量的倍數(shù)較低。在棉纖維發(fā)育過(guò)程中, 上述7個(gè)基因在棕色棉纖維中表達(dá)量均高于白色棉, 其中和在棕色棉纖維中的表達(dá)優(yōu)勢(shì)最明顯, 暗示它們可能與棕色棉纖維的顏色形成相關(guān)。

3 討論

MATE蛋白是一個(gè)新型的多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族, 其成員數(shù)量龐大, 大概有203個(gè)已經(jīng)測(cè)序的基因廣泛分布于古細(xì)菌、細(xì)菌、酵母、動(dòng)物和植物中[13-15], 如擬南芥中58個(gè)、葡萄中57個(gè)、楊樹(shù)中58個(gè)、玉米和短柄草中38個(gè)[25]。模式植物擬南芥和煙草中MATE家族基因的復(fù)雜相關(guān)特征和生物學(xué)功能已被挖掘和鑒定[17,26]。擬南芥中MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可分為A、B、C、D、E、F和G亞家族, 分別在Fe3+和Al3+等金屬離子、類黃酮、四甲胺、水楊酸等次級(jí)代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮作用。A亞家族的(At3g23560)與轉(zhuǎn)運(yùn)四甲銨毒素物質(zhì)相關(guān)[27]; C亞家族的(At4g39030)可能與轉(zhuǎn)運(yùn)水楊酸或其前體物質(zhì)相關(guān)[28]; D亞家族的(At3g08040)具有維持?jǐn)M南芥內(nèi)環(huán)境鐵離子動(dòng)態(tài)平衡功能[29]; E亞家族的(At2g04070)在植物體內(nèi)介導(dǎo)生物堿、抗生素和其他有毒化合物轉(zhuǎn)出[30];(At3g59030)定位在液泡膜上, 與原花青素的前體物質(zhì)向液泡的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[16-17]。研究者從彩色棉中分離到4個(gè)黃酮類基因, 共獲得5個(gè)色素合成相關(guān)基因和, 并據(jù)此推測(cè)棕色棉中的色素物質(zhì)是原花青素[31]。原花青素是在細(xì)胞質(zhì)中合成的, 再經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)揭号葜小ATE家族蛋白在花青素和原花青素的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起重要作用[12-13]。本研究在彩色棉屬棕色棉中鑒定出91個(gè)GhMATE家族成員, 分為7個(gè)亞家族, 其中13個(gè)棕色棉基因與擬南芥原花青素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因聚為一類, 表明基因可能參與細(xì)胞內(nèi)原花青素向液泡的轉(zhuǎn)運(yùn), 從而影響彩色棉纖維顏色的形成。

圖5 MATE家族基因在棉花不同組織中的qRT-PCR分析

R: 根; S: 莖; L: 葉; F: 花; 6~27 DPA:開(kāi)花后6、9、12、15、18、21、24、27 d纖維。

R: root; S: stem; L: leaf; F: flower; 6–27 DPA: fiber cells at 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, and 27 DPA, respectively.

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的亞細(xì)胞定位對(duì)其行使生物學(xué)功能至關(guān)重要, 不同的亞細(xì)胞定位可能引起轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的差異。植物MATE蛋白主要定位于質(zhì)膜或液泡膜[32]。轉(zhuǎn)運(yùn)原花青素的MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白大多定位在液泡膜上, 將原花青素的前體物質(zhì)糖基化/?；谋韮翰杷剞D(zhuǎn)運(yùn)至液泡中[11,33]。本研究表明, 多數(shù)定位在細(xì)胞膜上, 少數(shù)定位在液泡膜, 葉綠體膜和細(xì)胞質(zhì)膜上。8個(gè)定位在液泡膜上的基因可能與原花青素的前體物質(zhì)糖基化/?；韮翰杷氐霓D(zhuǎn)運(yùn)有關(guān), 使原花青素在液泡中積累、聚合形成不同聚合度的原花青素聚合物, 從而決定彩色棉纖維的顏色。由于E亞家族的基因和定位于液泡膜的基因可能與原花青素的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān), 推測(cè)它們可能存在較高的一致性, 比較后發(fā)現(xiàn), 兩組基因僅有一個(gè)重合的基因, 說(shuō)明研究者對(duì)植物MATE家族基因的結(jié)構(gòu)和功能研究尚不完善, 其他亞家族成員中也可能存在與原花青素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因。

MATE蛋白家族長(zhǎng)度在400~700個(gè)氨基酸之間, 大多數(shù)氨基酸成員包括400~550個(gè)殘基[34]。本研究中GhMATE家族成員編碼374~548個(gè)氨基酸殘基, 符合MATE家族成員的基本特征。根據(jù)前人研究, MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白約有12個(gè)TM, 如擬南芥MATE蛋白家族含有8~13個(gè)TM, FRD3含有13個(gè), EDS5含有11個(gè)TM[35]。12個(gè)TM是植物MATE蛋白行使功能的核心元件[36]。本研究發(fā)現(xiàn)84個(gè)蛋白序列均含有12個(gè)TM, 1個(gè)蛋白含有13個(gè)TM, 5個(gè)蛋白少于12個(gè)TM。12個(gè)TM符合MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基本特征, 表明大多數(shù)GhMATE蛋白均具有行使蛋白功能的完整核心元件。

基因在棕色棉、白色棉不同組織和棉纖維細(xì)胞的不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá), 從7個(gè)亞家族中共找到7個(gè)在棕色棉纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因, 其中和在棕色棉纖維中的表達(dá)量明顯高于白色棉, 且都定位于液泡膜上。擬南芥TT12是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)定位于液泡膜上, 參與原花青素前體表兒茶素3′-葡萄糖苷的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[12,18,33]。苜蓿定位在液泡膜上, 優(yōu)先運(yùn)輸原花青素合成前體表兒茶素3’-O-葡糖苷, 能夠彌補(bǔ)擬南芥突變體種子的表型缺陷[12,20]。葡萄中也鑒定出2個(gè)與MATE家族序列同源性很高的基因和, 在花青素生物合成的組織中表達(dá), 特異運(yùn)輸?；幕ㄇ嗨豙37]。Frank等[21]在蘋(píng)果中克隆了2個(gè)基因, 命名為和, 系統(tǒng)進(jìn)化分析表明, 它們與聚為一類, 這2個(gè)基因均能使擬南芥突變體恢復(fù)至野生型, 證明和是蘋(píng)果中轉(zhuǎn)運(yùn)原花青素的關(guān)鍵基因[16]。本研究通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析, 發(fā)現(xiàn)GhMATE13蛋白與擬南芥原花青素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白聚為一類, 且都定位在液泡膜上, 表明GhMATE13可能參與原花色素的轉(zhuǎn)運(yùn)及液泡積累, 在彩色棉纖維顏色形成過(guò)程中起重要作用。只定位于液泡膜上, 屬于A亞家族成員, 推測(cè)在棕色棉顏色形成過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用, 其功能有待進(jìn)一步研究。本研究有助于進(jìn)一步研究GhMATE家族基因在棕色棉纖維顏色形成中的作用機(jī)制。

4 結(jié)論

鑒定出91個(gè)GhMATE家族基因, 將它們分為A、B、C、D、E、F和G 7個(gè)亞家族, 其中84個(gè)GhMATE蛋白具有12個(gè)典型的跨膜結(jié)構(gòu)域, GhMATE家族成員被定位在25條染色體上, 共形成5個(gè)基因簇。和在棕色棉纖維中的表達(dá)量明顯高于在白色棉中, 可能在棕色棉纖維的顏色形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

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Identification and Expression Analysis of Multidrug and Toxic Compound Extrusion Protein Family Genes in Colored Cotton

WANG Zuo-Min1, LIU Jin1, SUN Shi-Chao2, ZHANG Xin-Yu2, XUE Fei2, LI Yan-Jun2,*, and SUN Jie2

1College of Life Sciences, Shihezi University, Shihezi 832003, Xinjiang, China;2Agricultural College / Key Laboratory of Oasis Eco-agriculture Xinjiang Production and Construction Group, Shihezi University, Shihezi 832003, Xinjiang, China

MATE (multidrug and toxic compound extrusion) is a transport proteins family that can transport toxins, glucosamine, antibiotics and drugs. In this study, the MATE family genes were identified from genome database ofL. through bioinformatics analysisand phylogenetic relationship, chromosome distribution, gene structure and expression patterns of this family were comprehensively compared. A total of 91genes were found in the cotton genome and named as–.genes of cotton were classified into seven groups namely A, B, C, D, E, F, and G with a classification is consistent with Arabidopsis. Multiple sequence alignment and conserved domain prediction indicated that 84 of the 91 GhMATE proteins contained 12 typical transmembrane domains. The chromosome mapping analysis showed thatgenes were distributed with different densities over 25 chromosomes and clustered into five clusters. The qPCR showed that thegenes expressed in all tissues of cotton with different expression patterns.andwere preferentially expressed in brown cotton fibers than in white cotton fibre, suggesting that they may play an important role in brown color formation of cotton fibre. This study provides valuable informations for dissecting functions and molecular mechanisms ofin cotton.

L.; naturally colored cotton; MATE family; bioinformatics; qRT-PCR (quantitative real-time PCR)

2017-11-01;

2018-04-11;

2018-05-10.

10.3724/SP.J.1006.2018.01380

李艷軍, E-mail: lyj20022002@sina.com.cn

E-mail: 1427786863@qq.com

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U1303281)和石河子大學(xué)動(dòng)植物育種重點(diǎn)項(xiàng)目(YZZX201601, gxjs2014-yz08)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (U1303281) and the Key Projects of Plant and Animal Breeding of Shihezi University (YZZX201601, gxjs2014-yz08).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180508.1644.006.html