蝴蝶蘭2種病毒的同步檢測(cè)及其CP融合反義表達(dá)載體構(gòu)建

梁 芳, 鄧祖麗穎, 許申平, 張 燕, 崔 波*

(1.鄭州師范學(xué)院 生物工程研究所，河南 鄭州 450044；2.鄭州幼兒師范高等專(zhuān)科學(xué)校，河南 鄭州 450000)

【研究意義】蝴蝶蘭(Phalaenopsishybrid)是一類(lèi)原產(chǎn)于熱帶亞熱帶地區(qū)的附生蘭科植物，是世界花卉產(chǎn)業(yè)中最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。因其較長(zhǎng)的花期、豐富的色彩、優(yōu)美多樣的花型及高雅的花姿而受到廣大人民的喜愛(ài)[1]。市面上出售的蝴蝶蘭多是采用組織培養(yǎng)方法繁殖，由于長(zhǎng)期進(jìn)行無(wú)性繁殖，使得蝴蝶蘭病毒積累嚴(yán)重，這不僅使其觀(guān)賞價(jià)值大大降低，相關(guān)企業(yè)也因此遭受大量的經(jīng)濟(jì)損失。因此，及時(shí)對(duì)蝴蝶蘭瓶苗進(jìn)行快速檢測(cè)對(duì)防治病毒大范圍擴(kuò)散起著重要作用；同時(shí)，利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段培育抗病毒品種也是育種工作的重要研究?jī)?nèi)容。【前人研究進(jìn)展】據(jù)報(bào)道，可感染蘭花病毒至少有20多種，其中建蘭花葉病毒(Cymbidiummosaicvirus，CyMV)和齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossumringspotvirus，ORSV)是感染最普遍危害最嚴(yán)重的2種蘭花病毒[2-3]，這2種病毒在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。CyMV屬于馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)，基因組由6.3 kb(+)ssRNA組成，其基因結(jié)構(gòu)與同屬其他病毒具有很高的同源性[4]。感染CyMV的植株生長(zhǎng)減緩，葉片出現(xiàn)黃色環(huán)斑或壞死斑，感病花朵褪色畸形[2]。ORSV隸屬于煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)，基因組為(+)ssRNA，其外殼蛋白基因的ORF長(zhǎng)度為477 bp，編碼158個(gè)氨基酸殘基。病毒顆粒呈桿狀，無(wú)包被，基因組與TMV(Tobacco mosaic virus)相似[1]。ORSV在盆栽基質(zhì)中可存活很長(zhǎng)時(shí)間[5]，ORSV感染可導(dǎo)致植株葉片出現(xiàn)條紋花斑，受感染的花朵出現(xiàn)彩色環(huán)斑及褪色[2]。在生產(chǎn)中，二者常常復(fù)合感染，給蘭花產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的后果，由CyMV及ORSV引起的病毒病現(xiàn)已成為影響我國(guó)蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的最主要病害。這些病毒主要通過(guò)在植株移栽及花卉采收過(guò)程中使用被污染的工具而傳播[4,6]。研究表明，CyMV及ORSV的變異不具有地域特異性，其CP基因序列的高度保守性為蘭花抗病毒育種提供了可信的途徑[4, 7-8]。反義RNA是指能與靶RNA通過(guò)堿基互補(bǔ)原則進(jìn)行配對(duì)的RNA分子。反義RNA使病毒基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制受到阻抑而無(wú)法表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到防御病蟲(chóng)害的作用。反義RNA技術(shù)在植物基因工程領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用，比如：控制果實(shí)成熟[9-10]、增強(qiáng)植物抗病性[11-13]、改變花卉顏色[14]等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】利用反義RNA技術(shù)將病毒CP基因?qū)爰闹髦参锾岣呖共⌒缘姆椒ㄒ延胁糠盅芯縖15]。2004年，臺(tái)灣Li-Jen Liao和Yuan-Li Chan等將CyMV的CP基因?qū)牒m中，獲得具有抗病性的蝴蝶蘭植株[16-17]。Kamo等將BYMV(Bean yellow mosaic virus)的CP基因分別以正向和反向插入唐菖蒲基因組中，研究表明轉(zhuǎn)基因植株均延遲了BYMV的感染[18]?！颈疚那腥朦c(diǎn)】本研究首先利用RT-PCR法對(duì)12株蝴蝶蘭樣品進(jìn)行病毒檢測(cè)，然后利用反義RNA技術(shù)將克隆到CyMV和ORSV的CP基因反向插入到表達(dá)載體pCAMBIA1300中，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染蝴蝶蘭原球莖，【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以期培養(yǎng)出能對(duì)CyMV和ORSV具有抗性的蝴蝶蘭新品種。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本實(shí)驗(yàn)所用的12株蝴蝶蘭來(lái)自鄭州師范學(xué)院的人工智能溫室，取新鮮葉片迅速投入液氮中速凍后放-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA的獲得與cDNA第1鏈的合成

用Trizol法提取蝴蝶蘭葉片總RNA，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，作為PCR克隆的模板。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI上已登錄的CyMV和ORSV的CP基因序列，以DNAMAN比對(duì)為基礎(chǔ)，利用Primer Premier 6.0軟件在兩端保守區(qū)分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物(CyMV-F1、CyMV-R1和ORSV-F1、ORSV-R1)，運(yùn)用RT-PCR擴(kuò)增CP基因的方法進(jìn)行病毒的檢測(cè)；得到序列后再分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增CP基因小片段用于構(gòu)建融合表達(dá)載體(CyMV-F2、CyMV-R2和ORSV-F2、ORSV-R2)。根據(jù)表達(dá)載體pCAMBIA1300上酶切位點(diǎn)的種類(lèi)及位置，在CyMVCP基因小片段引物的兩端添加SalI和PstI酶切位點(diǎn)，在 ORSVCP基因引物的兩端添加PstI和XbalI酶切位點(diǎn)(表1下劃線(xiàn)部分)。

表1 蝴蝶蘭2種病毒CP基因引物設(shè)計(jì)

1.4 2種病毒的RT-PCR同步檢測(cè)

以cDNA第1鏈為模板，利用引物CyMV-F1、CyMV-R1和ORSV-F1、ORSV-R1首先分別對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：10×PCR buffer 2.0 μl、dNTPs(2.5 mmol/L) 1.6 μl、正反向引物各1.0 μl、cDNA模板1.0 μl、rTaqDNA聚合酶0.2 μl，ddH2O補(bǔ)充至20.0 μl。然后對(duì)目的片段進(jìn)行同步克隆檢測(cè)，方法同上，反應(yīng)體系中同時(shí)加入2對(duì)引物。

PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將正確片段進(jìn)行回收純化后與pGEM-T easy載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)2次菌落PCR鑒定均為陽(yáng)性者送出測(cè)序。

1.5 2種病毒CP反義融合表達(dá)載體的構(gòu)建

1.5.1CP基因片段的克隆 2種病毒CP基因小片段的克隆方法同上，克隆產(chǎn)物用2 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，電壓50 V，電泳80 min后染色照膠。將位置正確的片段進(jìn)行凝膠回收純化后，與克隆載體pGEM-T easy進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)2次菌落PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性者送出測(cè)序。

1.5.2 CyMV-CP與pCAMBIA1300載體的連接 采用普通質(zhì)粒小提試劑盒(天根)從陽(yáng)性菌液中提取含CyMV-CP基因片段的質(zhì)粒(命名為pGEM-CyMV)，同時(shí)提取pCAMBIA1300質(zhì)粒。將質(zhì)粒pGEM-CyMV及載體pCAMBIA1300分別進(jìn)行雙酶切，酶切體系如下：10×H buffer 1.5 μl，0.1 % BSA 1.0 μl，SalI/PstI內(nèi)切酶各0.5 μl，pGEM-CyMV或pCAMBIA1300 6.5 μl。37 ℃酶切4～5 h。電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物是否正確，將pGEM-CyMV的酶切產(chǎn)物小片段及pCAMBIA1300酶切產(chǎn)物的大片段進(jìn)行切膠回收，電泳檢測(cè)位置及濃度。然后將回收的目的基因CyMV-CP與載體pCAMBIA1300的大片段進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，連接體系如下：10×T4 DNA Ligase buffer 2.5 μl，T4 DNA Ligase 1.0 μl，0.1 % BSA 1.0 μl，CyMV-CP8.0 μl，pCAMBIA1300 12.0 μl。16 ℃過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，單菌落經(jīng)過(guò)2次PCR鑒定后，仍為陽(yáng)性者提取質(zhì)粒后進(jìn)行SalI/PstI雙酶切鑒定，酶切鑒定體系如下：10×H buffer 1.5 μl，0.1 % BSA 1.0 μl，SalI/PstI內(nèi)切酶各0.5 μl，陽(yáng)性質(zhì)粒 6.5 μl。用凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物的位置來(lái)判斷雙酶切鑒定的結(jié)果，酶切鑒定結(jié)果正確的菌液及質(zhì)粒將其命名為pCAMBIA1300-CyMV。

1.5.3 ORSV-CP與pCAMBIA1300-CyMV的連接 將含ORSV-CP基因片段的質(zhì)粒(命名為pGEM-ORSV)及構(gòu)建好的pCAMBIA1300-CyMV質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，酶切體系如下：10×M buffer 1.5 μl，0.1 %BSA 1.0 μl，PstI/XbalI內(nèi)切酶各0.5 μl，pGEM-ORSV或pCAMBIA1300-CyMV 6.5 μl。對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，將pGEM-ORSV酶切產(chǎn)物的小片段和pCAMBIA1300-CyMV酶切產(chǎn)物的大片段進(jìn)行切膠回收。然后將回收的ORSV-CP基因片段與載體pCAMBIA1300-CyMV進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，連接體系如下：10×T4 DNA Ligase buffer 2.5 μl，T4 DNA Ligase 1.0 μl，0.1 % BSA 1.0 μl，ORSV-CP8.0 μl，pCAMBIA1300-CyMV 12.0 μl。

1.5.4 融合表達(dá)載體的鑒定 將ORSV-CP與載體pCAMBIA1300-CyMV的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，用CyMV-F2、CyMV-R2和ORSV-F2、ORSV-R2以及CyMV-F2、ORSV-R2 3對(duì)引物分別進(jìn)行菌落PCR鑒定。對(duì)陽(yáng)性菌液提取質(zhì)粒，對(duì)所提質(zhì)粒再進(jìn)行XbalI/SalI雙酶切鑒定，用于檢測(cè)所構(gòu)建的表達(dá)載體中外源基因的大小。酶切鑒定體系如下：10×T buffer 1.5 μl，0.1 % BSA 1.0 μl，XbalI/SalI內(nèi)切酶各0.5 μl，陽(yáng)性質(zhì)粒6.5 μl。用凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物的位置來(lái)判斷鑒定結(jié)果，經(jīng)PCR檢測(cè)及酶切檢測(cè)均正確的質(zhì)粒命名為pCAMBIA1300-CyMV-ORSV。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝴蝶蘭2種病毒的同步檢測(cè)

用RT-PCR克隆病毒外殼蛋白基因的方法檢測(cè)12株蝴蝶蘭樣品，首先分別檢測(cè)CyMV和ORSV病毒。CyMV檢測(cè)結(jié)果如圖1A所示，12個(gè)樣品中，僅1號(hào)樣品未克隆出目的條帶，6號(hào)樣品條帶較淡，其他10個(gè)樣品均出現(xiàn)明顯的條帶，與預(yù)期的689 bp基因片段位置相符；圖1B所示為ORSV檢測(cè)結(jié)果，僅4、5和10號(hào)克隆出目的條帶，與預(yù)期的477 bp基因片段位置相符，其他樣品未檢測(cè)出目的條帶。將克隆出的目的片段進(jìn)行TA克隆，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送出測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI上分析比對(duì)，CyMV的基因序列與已登錄的其他CyMV的CP基因序列同源性最高為99 %[19]。ORSV的測(cè)序結(jié)果與已登錄的其他ORSV的CP基因序列同源性最高為100 %，與珠海分離物ZH2(KF836086)的序列完全相同，表明克隆出的目的條帶正確，登錄到GenBank上，登錄號(hào)為KU873002。

M.DL2000 DNA marker；1～12.樣品編號(hào)M.DL2000 DNA marker；1-12.Sample number圖1 蝴蝶蘭CyMV(A)及ORSV(B)的RT-PCR檢測(cè)Fig.1 Detection of CyMV (A) and ORSV (B) from Phalaenopsis by RT-PCR method

M.DL2000 DNA marker；4,5,10.樣品編號(hào)M.DL2000 DNA marker; 4,5,10.Sample number圖2 蝴蝶蘭CyMV和ORSV的同步檢測(cè)Fig.2 Simultaneous detection of CyMV and ORSV from Phalaenopsis

由圖1表明，4、5和10號(hào)有可能同時(shí)感染了CyMV和ORSV病毒。將CyMV和ORSVCP基因引物同時(shí)加入PCR反應(yīng)體系中，以4、5和10號(hào)樣品cDNA為模板同時(shí)檢測(cè)2種病毒，結(jié)果如圖2所示，在相應(yīng)的位置均出現(xiàn)明亮且單一的條帶。

M.100 bp DNA ladder marker；1.CyMV CP基因克??；2.ORSV CP基因克隆M.100 bp DNA ladder marker；1.CP gene cloning of CyMV；2.CP gene cloning of ORSV圖3 CyMV及ORSV CP基因克隆Fig.3 CP genes cloning of CyMV and ORSV

1,3.pGEM-CyMV未切；2,4.pGEM-CyMV已切；5,7.pCAMBIA1300未切；6,8.pCAMBIA1300已切；M.DL15000 DNA marker1,3.Not be digested of pGEM-CyMV；2,4.Digested of pGEM-CyMV；5,7.Not be digested of pCAMBIA1300；6,8.Digested of pCAMBIA1300；M.DL15000 DNA marker圖4 pGEM-CyMV及pCAMBIA1300雙酶切圖Fig.4 Double digestion of pGEM-CyMV and pCAMBIA1300

2.2 蝴蝶蘭2種病毒CP基因片段的克隆

如圖3所示，利用CyMV-F2、CyMV-R2和ORSV-F2、ORSV-R2 2對(duì)引物分別對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。CyMV和ORSV的克隆產(chǎn)物分別在100～200 bp之間有一條明亮的條帶，和預(yù)期的125和164 bp的目的片段大小相吻合。將PCR產(chǎn)物凝膠回收后進(jìn)行TA克隆，通過(guò)對(duì)陽(yáng)性菌液測(cè)序可知克隆的目的片段正確。

2.3 CyMV-CP基因與pCAMBIA1300載體的連接

將提取的pCAMBIA1300和含有CyMV-CP基因的質(zhì)粒pGEM-CyMV用SalI/PstI雙酶切。酶切如圖4所示：pCAMBIA1300質(zhì)粒酶切后，只有1個(gè)大條帶，回收該大片段； pGEM-CyMV質(zhì)粒酶切后，顯示2個(gè)大小不同的條帶，回收125 bp的小片段。將2個(gè)回收的片段連接轉(zhuǎn)化后，進(jìn)行菌落PCR鑒定，在125 bp的地方出現(xiàn)目的條帶(圖5)，證明目的基因CyMV已經(jīng)成功插入pCAMBIA1300載體之中。將陽(yáng)性菌落擴(kuò)搖后提取質(zhì)粒，命名為pCAMBIA1300-CyMV。

M.DL2000 DNA marker；1,2,3.菌落PCR克隆產(chǎn)物M.DL2000 DNA marker; 1,2,3.PCR production of clones圖5 pCAMBIA1300-CyMV菌落PCR鑒定Fig.5 Identification of pCAMBIA1300-CyMV clones

M.DL15 000 DNA marker；1.pCAMBIA1300-CyMV未切；2.pCAMBIA1300-CyMV已切；3.pGEM-ORSV未切；4.pGEM-ORSV已切M.DL15 000 DNA marker; 1.Not be digested of pCAMBIA1300-CyMV; 2.Digested of pCAMBIA1300-CyMV; 3.Not be digested of pGEM-ORSV; 4.Digested of pGEM-ORSV圖6 pCAMBIA1300-CyMV及pGEM-ORSV雙酶切圖譜Fig.6 Double digestion of pCAMBIA1300-CyMV and pGEM-ORSV

2.4 ORSV和pCAMBIA1300-CyMV的連接及鑒定

將重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-CyMV和含有ORSV-CP基因的質(zhì)粒pGEM-ORSV用XbalI/PstI雙酶切，回收pCAMBIA1300-CyMV酶切后的大片段和pGEM-ORSV的164 bp小片段(圖6)。用T4 DNA連接酶連接轉(zhuǎn)化后，挑取單菌落，用CyMV-F2、CyMV-R2和ORSV-F2、ORSV-R2以及CyMV-F2、ORSV-R2 3對(duì)引物分別進(jìn)行菌落PCR鑒定，如圖7所示，分別在125、164和289 bp地方出現(xiàn)目的條帶。挑斑擴(kuò)搖后提取質(zhì)粒，用SalI/XbalI進(jìn)行雙酶切，得到了約289 bp的小條帶和1個(gè)大條帶(圖8)，和預(yù)期結(jié)果一致。結(jié)果證明目的基因ORSV和CyMV的CP基因片段均已正確插入pCAMBIA1300載體之中，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pCAMBIA1300-CyMV-ORSV。

3 討 論

建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒復(fù)合侵染蘭科植物的現(xiàn)象非常普遍。同時(shí)檢測(cè)兩種或多種病毒的RT-PCR技術(shù)已有許多成功的報(bào)道[20-21]。該技術(shù)的關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)合適的引物，在保證引物特異性的前提下，避免引物之間的互作干擾。本文鑒于病毒的變異性及多樣性，在CP基因序列的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)引物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，設(shè)計(jì)的引物通過(guò)PCR克隆產(chǎn)物條帶單一，將兩對(duì)不同引物加入同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，克隆產(chǎn)物也很明亮無(wú)拖尾，且無(wú)多余條帶，表明兩對(duì)引物之間互不干擾，且能正確克隆出目的條帶，此雙重PCR檢測(cè)方法并不需要特殊的實(shí)驗(yàn)條件，即可快速準(zhǔn)確檢測(cè)出蘭花植株體內(nèi)是否含有CyMV或ORSV病毒。本研究在蝴蝶蘭溫室大棚內(nèi)挑選具有疑似病毒癥狀的12個(gè)植株作為檢測(cè)對(duì)象，結(jié)果表明，幾乎所有的植株均感染了CyMV病毒，其中25 %既感染了CyMV，同時(shí)感染了ORSV病毒。這些復(fù)合感染的植株往往癥狀較重，葉片環(huán)狀腐爛，危害嚴(yán)重。

M.DL15 000 DNA marker；1.CyMV-CP基因擴(kuò)增產(chǎn)物；2.ORSV-CP基因擴(kuò)增產(chǎn)物；3.CyMV和ORSV 2個(gè)CP基因擴(kuò)增產(chǎn)物M.DL15 000 DNA marker; 1.PCR production of CyMV-CP; 2.PCR production of ORSV-CP; 3.PCR production of CyMV-CP and ORSV-CP圖7 pCAMBIA1300-CyMV-ORSV菌落PCR鑒定Fig.7 Identification of pCAMBIA1300-CyMV-ORSV clones

M.DL15 000 DNA marker；1.pCAMBIA1300-CyMV-ORSV未切；2.pCAMBIA1300-CyMV-ORSV已切M.DL15 000 DNA marker; 1.Not be digested of pCAMBIA1300-CyMV-ORSV; 2.Digested of pCAMBIA1300-CyMV-ORSV圖8 pCAMBIA1300-CyMV-ORSV雙酶切Fig.8 Double digestion of pCAMBIA1300-CyMV-ORSV

本次試驗(yàn)中，雙酶切作為一個(gè)中間環(huán)節(jié)極為重要。特別是雙酶切的時(shí)間需要很好的把握，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，質(zhì)粒易降解，電泳結(jié)果呈現(xiàn)彌散狀態(tài)；時(shí)間過(guò)短不能將質(zhì)粒充分酶切。而且不同的酶所需時(shí)間有所差異。本試驗(yàn)中，為了使酶切充分，一般可酶切過(guò)夜，對(duì)酶切產(chǎn)物無(wú)明顯影響，但是PstI酶過(guò)夜導(dǎo)致產(chǎn)物電泳無(wú)可見(jiàn)單一條帶，表明時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能使質(zhì)粒降解。因此，改為酶切4～5 h，則可得到單一明亮的條帶。

本文采用改造過(guò)的pCAMBIA1300作為表達(dá)載體，在pCAMBIA1300的基礎(chǔ)上，加上了一個(gè)超表達(dá)啟動(dòng)子Super promoter和GFP序列。啟動(dòng)子下游(5’→3’方向)分別為XbaI、PstI、SalI等酶切位點(diǎn)，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)在目的序列中均沒(méi)有這3個(gè)酶切位點(diǎn)，故挑選這3個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行外源基因的插入。根據(jù)反義RNA的設(shè)計(jì)原則，先將CyMV-CP基因反向插入到PstI和SalI位點(diǎn)，經(jīng)2次菌落PCR檢測(cè)均能克隆到明亮的125 bp的條帶，表明CyMV-CP基因成功插入到表達(dá)載體pCAMBIA1300上。然后，再切開(kāi)XbaI與PstI位點(diǎn)，將ORSV-CP基因反向插入到攜帶有CyMV-CP基因的pCAMBIA1300上，插入的外源基因經(jīng)過(guò)雙酶切鑒定，可得到約289 bp的片段，表明CyMV-CP與ORSV-CP基因均正確插入到pCAMBIA1300上。構(gòu)建的反義融合表達(dá)載體pCAMBIA1300-CyMV-ORSV轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后侵染蝴蝶蘭原球莖，是否可有效增強(qiáng)蝴蝶蘭植株對(duì)CyMV及ORSV病毒的抵抗力及減輕感染病毒癥狀還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

所設(shè)計(jì)的2對(duì)特異性引物能夠在同一PCR反應(yīng)體系中快速高效地檢測(cè)出CyMV和ORSV，克隆產(chǎn)物清晰明亮無(wú)非特異性條帶，此方法可用于蘭花病毒的快速檢測(cè)。將克隆出的CyMV和ORSVCP基因小片段與載體pCAMBIA1300連接構(gòu)建的融合反義表達(dá)載體pCAMBIA1300-CyMV-ORSV，經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定表明融合反義基因已成功插入到載體中。