CO2增施對四川弱光區(qū)設施黃瓜葉片光系統(tǒng)功能及其產(chǎn)量的影響

張澤錦，唐 麗*，李躍建，劉小俊

(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所/蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點實驗室，四川 成都 610066；2. 農(nóng)業(yè)部西南地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，四川 成都 610066)

【研究意義】二氧化碳(CO2)排放引起的全球氣候變化嚴重影響著人類的生存和發(fā)展，是國際社會面臨的重大挑戰(zhàn)，但CO2同時又是植物生長過程中有機物形成的碳源，光合作用的反應底物，其濃度的變化直接影響植物光合生理生化過程。蔬菜作物干物質(zhì)產(chǎn)量的90 %～95 %則是由光合作用所制造[1]，劉保才等(1995)用通徑分析證明，影響日光溫室蔬菜產(chǎn)量的三大環(huán)境因素中，CO2濃度對產(chǎn)量形成貢獻最大[2]?！厩叭搜芯窟M展】黃瓜是設施栽培的主要作物品種之一，我國北方設施黃瓜占設施面積的50 %～60 %，專業(yè)種植區(qū)甚至高達80 %以上[3]。位于中國的西南地區(qū)的四川盆地全年的平均太陽輻射小于1500 MJ·m-2，屬于中國光照資源5類地區(qū)[4]。黃瓜是該地區(qū)設施栽培的主要品種之一，約占四川設施栽培面積25.9 %?！颈狙芯壳腥朦c】有關CO2的施肥技術國內(nèi)外已經(jīng)做了相關研究[5]，關于黃瓜的光合作用前人分別從氣體交換、光合關鍵酶及生長發(fā)育等方面做了大量工作[6-7]，但其中關于葉片光系統(tǒng)功能的研究主要集中在光系統(tǒng)II(PSII)進行葉綠素熒光的探討[8-10]，對于光系統(tǒng)I(PSI)和跨膜質(zhì)子梯度的影響卻鮮有報道，CO2濃度升高對黃瓜葉片2個光合系統(tǒng)影響的機理尚未明確；此外，有關CO2增施對黃瓜生長等方面的研究主要集中在北方密閉性較好且光照充足的日光溫室中，但針對南方弱光地區(qū)生產(chǎn)大量采用密閉性較差的塑料大棚中黃瓜生產(chǎn)類似研究較少，經(jīng)濟適用且易于推廣的CO2施肥方式缺乏相應推廣應用的理論支撐?！緮M解決的關鍵問題】為了進一步明確CO2增施對弱光區(qū)黃瓜葉片光系統(tǒng)功能的作用機制和吊袋式CO2增施技術在設施黃瓜促成生產(chǎn)中的應用價值，本試驗研究CO2增施對黃瓜葉片PSI、PSII、跨膜質(zhì)子梯度以及產(chǎn)量的影響，為四川弱光區(qū)設施黃瓜促成高產(chǎn)栽培技術提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設計

試驗于2016年1-7月在四川省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所塑料大棚進行。以黃瓜(品種：川翠3號)為實驗材料，育苗于2月1日進行，待黃瓜苗長到三葉一心時，定植于塑料大棚中(長30 m，寬8 m)，1周后進行實驗處理。CO2增施期間光照強度最高為1212 μmol·m-2·s-1。CO2增施采用吊袋式CO2氣肥的增施方法，每包CO2發(fā)生劑重110 g，1個塑料大棚均勻吊掛16個CO2施肥袋，每個施肥袋吊掛位置距地面1.5 m處。另外1個大棚無CO2吊袋設為CK，每隔15 d更換1次CO2增施包。晴天CO2增施棚內(nèi)CO2濃度最高約為550 μmol·mol-1，最低濃度約為320 μmol·mol-1，對照棚內(nèi)最高CO2濃度為480 μmol·mol-1，最低CO2濃度為310 μmol·mol-1；陰天CO2增施棚內(nèi)CO2濃度最高約為510 μmol·mol-1，最低濃度約為400 μmol·mol-1，對照棚內(nèi)最高CO2濃度為470 μmol·mol-1，最低CO2濃度為380 μmol·mol-1。大棚內(nèi)設置3個實驗重復，每個小區(qū)20株黃瓜，面積6 m2。由于氣溫的逐漸升高，CO2增施于4月30日結束。3-4月根據(jù)天氣狀況白天10：00左右進行開啟大棚天窗進行放風除濕。兩個棚內(nèi)黃瓜施肥按照常規(guī)處理進行。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 葉片葉綠素含量及葉面積測定 本試驗于CO2增施時(3月18日和4月3日)和CO2增施結束后(5月11日和5月14日)，選取植株中部的黃瓜葉片參照楊勁峰等(2002)方法進行葉面積測量[11]；葉片葉綠素含量采用丙酮法進行測定。

1.2.2 氣體交換參數(shù)的測定 本試驗于4月上旬，選擇晴天對黃瓜葉片光合特性進行測定。黃瓜葉片光合速率測定用便攜式光合作用測量系統(tǒng)(LI-6400，LI-COR公司，美國)，對試驗區(qū)內(nèi)選取的5株黃瓜，測定植株中部葉片的光響應曲線。將待測葉片在該光強下放置30 min以充分活化光合系統(tǒng)。使用開放氣路，空氣流速控制為500 μmol·s-1，CO2濃度400 μmol·mol-1。從高到低設定光照強度的梯度為：1800、1500、1200、1100、1000、800、600、400、200、100、50、20、0 μmol·m-2·s-1，測定時每一光強下停留3 min。采用非直線雙曲線模型擬合光響應曲線，并計算光補償點(Ls)、光飽和點(Lc)，表觀量子效率(AQE)、暗呼吸速率(Rd)及最大光合速率(Pmax)相關光響應參數(shù)[12]。

1.2.3 葉片熒光參數(shù)的測定 光系統(tǒng)誘導熒光曲線的測量：黃瓜葉片暗適應2 h的葉片，利用雙通道熒光儀dual-PAM100(Walz，德國)中誘導曲線測量程序測定誘導熒光曲線，Actinic light設置為8檔。

光響應熒光曲線的測量：在使用光適應的葉片，利用雙通道熒光儀Dual-PAM-100(Walz，德國)中l(wèi)ight curve測量程序測定黃葉片PSII和PSI快速熒光響應曲線。測量結束后采用EP擬合模型對其擬合，自動計算相關參數(shù)。

快速葉綠素熒光誘導動力學曲線的測量：利用雙通道熒光儀Dual-PAM-100(Walz，德國)自動測量程序，在葉片暗適應180 min后測定黃瓜葉片快速葉綠素熒光誘導動力學曲線，JIP-test參數(shù)根據(jù)Strasser等(2000)計算得到[13]。

暗光暗誘導的550～515 nm差示信號測定：根據(jù)Schreiber and Klughammer(2008)方法，利用雙通道熒光儀dual-PAM-100的P515/535模塊系統(tǒng)及其自動程序測定[14]。黃瓜葉片暗適應后開始測量，10 s開啟光強為274 μmol·m-2·s-1的光化光進行光照，并持續(xù)至300 s關閉光照，全部測量過程于400 s時結束。根據(jù)曲線計算得出跨膜質(zhì)子動力勢(pmf)，跨膜電位(Δψ)跨膜質(zhì)子梯度(ΔpH)化及玉米黃素相對含量(Z)。

表1 CO2增施對黃瓜葉片PSI和PSII量子產(chǎn)量及電子傳遞速率的影響(n=12)

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)的處理及分析利用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0軟件完成。分別對各試驗區(qū)的試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 CO2增施對葉片光合系統(tǒng)I和光合系統(tǒng)II的影響

CO2增施處理中PSI的量子產(chǎn)量[Y(I)]、相對電子傳遞速率[ETR(I)]以及由于受體側限制引起的PSI處非光化學能量耗散的量子產(chǎn)量[Y(NA)]與對照黃瓜葉片無顯著差異，但CO2增施處理供體側引起的由于供體側限制引起的PSI處非光化學能量耗散的量子產(chǎn)量[Y(ND)]顯著低于對照，為對照處理的97.2 %。PSII的量子產(chǎn)量[Y(II)]、相對電子傳遞速率[ETR(II)]以及光保護和光損傷的2個參數(shù)PSII處非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量[Y(NO)]和PSII處調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量[Y(NPQ)]在CO2增施處理和對照間均無顯著差異(表1)。

通過熒光響應曲線的測量，采用Eilers and Peeters(1998)的公式進行光響應曲線的擬合得到快速光曲線的初始斜率(α)、最大電子傳遞速率(ETRmax)及最小飽和光強(IK)。α反應光能利用效率，ETRmax和IK反應樣品對強光的耐受能力[15]。從表2可以看出，CO2增施提高了PSII和PSI的ETRmax以及PSI的IK，分別比對照提高了40.2 %，28.4 %及20.4 %。CO2增施未提高PSII和PSI的快速熒光初始斜率和PSII的最小飽和光強(IK)。

2.2 CO2增施對葉片光合系統(tǒng)II能量分配的影響

初始熒光(Fo)是PSII作用中心完全開放即所有的電子受體QA、QB和PQ等最大程度氧化態(tài)時的熒光產(chǎn)量，此時的熒光強弱與天線色素含量的多少及作用中心的活性狀態(tài)有關。天線色素降解和非光化學能量耗散易造成Fo的降低，而光合機構的可逆失活又使其升高。黃瓜CO2增施處理的初始熒光Fo與未增施的對照Fo分別為0.20和0.19，無顯著差異，最大光化學效率Fv/Fm反應了潛在的量子效率，CO2增施和對照分別為0.80和0.79，無顯著差異。

表2 CO2增施對黃瓜葉片光響應熒光參數(shù)的影響(n=12)

表3 CO2增施對黃瓜葉片葉綠素熒光響應參數(shù)的影響(n=12)

從PSII中能量分配來看，CO2增施處理黃瓜葉片反應中心捕獲的用于電子傳遞的能量(ETo/RC)為1.70，比對照顯著增加了7.6 %；而處理與對照的黃瓜葉片單位反應中心吸收的光能(ABS/RC)，單位反應中心捕獲的用于還原QA的能量(TRo/RC)以及單位反應中心熱耗散的能量(DIo/RC)無顯著差異。以上結果表明，CO2增施黃瓜葉片PSII反應中心捕獲的用于電子傳遞的能量顯著增加(ETo/RC)可能是導致光反應最大電子傳遞速率的提高的原因之一。

PIABS指以吸收光能為基礎的性能指數(shù)，由捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中超過QA的其它電子受體概率(ψo)、光合活性反應中心的數(shù)目(RC/ABS)和最大光化學效率(φPo)3個參數(shù)組成。

圖1 黃瓜葉片暗-光-暗誘導的550～515差示信號的變化Fig.1 Effect of CO2 enrichment on slow dark-light-dark induction transients of the 550-515 nm difference signal of cucumber leaves

CO2增施處理的RC/ABS比對照處理增加25 %；ψo和φPo 2個參數(shù)處理與對照之間無顯著差異。CO2增施處理的黃瓜葉片PIABS比CK顯著提高了11.0 %。因此，CO2增施使黃瓜葉片單位面積上光合活性反應中心的數(shù)目顯著增加可能是提高其葉片光合的性能指數(shù)增高的主要原因(表3)。

2.3 CO2增施對葉片跨膜質(zhì)子動力勢的影響

在光化光關閉后，暗-光-暗誘導的550～515 nm差示信號先下降后上升，從550～515 nm差示信號曲線變化可得出跨膜質(zhì)子梯度(ΔpH)、跨膜電位(Δψ)、跨膜質(zhì)子動力勢(pmf)及可逆玉米黃素(Zeaxanthin，Z)相對含量的變化。

黃瓜葉片暗適應時與經(jīng)過照光關燈后測量結束時550～515 nm差示信號的差值代表葉片可逆玉米黃素相對含量。如圖1和表4所示，CO2增施處理后“暗基線”的增加顯著高于對照，玉米黃素相對含量為16.63，比對照增加34.7 %，CO2增施處理促進了可逆玉米黃素的形成。以上結果說明CO2處理的黃瓜葉片比對照具有更強減輕黃瓜葉片光氧化脅迫的能力。

光化光關閉后的550～515 nm差示信號曲線變化，可反映葉片Δψ及ΔpH大小。光化光照射達到穩(wěn)定時550～515 nm差示信號與關閉光化光并達到穩(wěn)態(tài)后550～515 nm差示信號的差值，反映葉片類囊體膜Δψ相對大??；關閉光化光達到穩(wěn)態(tài)后P515信號與關閉光化光后信號下降的最低點差值反映類囊體膜ΔpH相對大小[16-17]。CO2增施顯著提高了Δψ和pmf，分別比對照處理提高29.8 %和19.2 %；兩處理的ΔpH無顯著差異。pmf增高的主要原因是由于Δψ的增高，因為較高的Δψ提高了類囊體膜上的代謝活性及蛋白運轉，同時提高了膜的滲透性。

表4CO2增施對黃瓜葉片跨膜質(zhì)子參數(shù)的影響(n=12)

Table 4 Effect of CO2enrichment on membrane potential (Δψ), proton gradient (ΔpH), proton motive force (pmf) and relative content of xeaxanthin(n=12)

ΔψΔpHpmf玉米黃素相對含量Relative content of xeaxanthinCO2增施CO2 enrichment4.97± 0.385.13± 0.7610.10±0.4616.63±1.97CK3.83± 0.254.63± 0.808.47±0.9512.35±1.65ANOVA?NS??

表5 CO2增施對黃瓜葉片光響應氣體交換參數(shù)的影響(n=6)

2.4 CO2增施對葉片光響應氣體交換參數(shù)的影響

由表5可以看出，CO2處理顯著提高了黃瓜葉片的表觀量子效率(AQE)，比對照提高了16.7 %；暗呼吸速率(Rd)同時也顯著提高，是對照處理的1.24倍。光飽和點，光補償點及最大光合速率則處理與對照無顯著差異。

2.5 CO2增施對黃瓜葉面積和葉綠素含量的影響

由表6可以看出，4月3日測定CO2增施處理黃瓜葉片的葉綠素b和總葉綠素含量分別為1.37和5.23 mg·g-1，顯著高于對照處理，分別是對照處理的1.3和1.1倍。但CO2增施處理黃瓜葉片的葉綠素a/b為2.00，顯著低于對照處理，是對照處理的74.3 %。5月14日測定黃瓜葉片葉綠素含量各指標CO2增施處理與對照無顯著差異。

由圖2可以看出，3月15日CO2增施和對照處理的黃瓜葉面積分別為45.0和24.0 m2，CO2增施處理的黃瓜葉面積比對照增加了87.5 %。5月11日測量CO2增施處理和對照處理的黃瓜葉面積分別為221.7和200.5 m2，無顯著差異。4月底以后由于氣溫的上升，塑料大棚均未閉棚，CO2增施棚的CO2濃度與對照棚內(nèi)CO2濃度均為大氣濃度，因此5月CO2增施和對照處理之間黃瓜中部葉片的葉綠素含量與葉面積無顯著差異。

2.6 CO2增施對黃瓜產(chǎn)量的影響

由表7可以看出，CO2增施提高了黃瓜單果重，收獲期平均單果重為0.32 kg，顯著高于對照處理的0.24 kg。收獲期結束后，測量黃瓜植株長。單株果數(shù)和小區(qū)總產(chǎn)量，CO2增施處理黃瓜植株長和單株果數(shù)分別為257.5 cm和7.2，顯著高于對照處理的185.8 cm和5.4，是對照處理的1.4和1.3倍；CO2增施處理黃瓜小區(qū)總產(chǎn)量為43.3 kg，比對照增產(chǎn)73.8 %。以上結果表明，CO2增施提高黃瓜產(chǎn)量，可能是通過增加植株長，增加單株結果數(shù)和提高單果重來實現(xiàn)。

表6 CO2增施對黃瓜葉片葉綠素含量的影響(n=15)

表7 CO2增施對黃瓜生長和產(chǎn)量的影響(單果重、單株果數(shù)及植株長n=12；小區(qū)產(chǎn)量n=3)

圖2 CO2增施對黃瓜葉面積的影響(n=15)Fig.2 Effect of CO2 enrichment on leave area of cucumber (n=15)

3 討 論

光合作用中較強的CO2傳導能力，較高的光反應和暗反應活性是葉片提高光合速率的生理基礎[18]。CO2不僅是植物光合作用的主要原料，還是作物產(chǎn)量的形成的重要來源。短期提高CO2濃度不但增加了植物光合作用的碳源，還提高了C3植物的光合速率[19]。溫室內(nèi)CO2濃度由200 μmol·mol-1提高到400 μmol·mol-1時，設施內(nèi)黃瓜、番茄和辣椒的凈光合速率提高55 %～130 %[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，CO2增施時期使得黃瓜葉片葉面積和葉綠素含量增高，而葉綠素a/b下降，更好地利用散射光，在弱光條件下提高葉片凈光合速率[21]，這與魏珉等(2003)[22]、郭衛(wèi)華等(2004)[23]、寶俐等(2016)[24]等報道類似。CO2增高使得黃瓜葉片表觀量子效率(AQE)增高。表觀量子效率(AQE)值為弱光階段的光響應曲線的斜率，其值大小與色素蛋白復合體數(shù)目相關。CO2升高后的黃瓜葉片總葉綠素含量和葉綠素b含量的增高則是導致其利用弱光的能力增強的主要原因。葉片光利用率的提高，有助于減輕西南地區(qū)早春的弱光環(huán)境對黃瓜生長產(chǎn)生的脅迫。

與植物葉片“表觀性”的氣體交換參數(shù)凈光合速率相比，光合熒光參數(shù)具有反應光合作用“內(nèi)在性”特點。本研究發(fā)現(xiàn)，CO2升高提高了黃瓜葉片內(nèi)的兩個光系統(tǒng)的最大電子傳遞速率，降低了由于供體側限制引起的PSI處非光化學能量耗散的量子產(chǎn)量[Y(ND)]，PSI具有接受更多的電子在供體側用于光合作用電子傳遞的能力，從而引起葉片的PSI的最小飽和光強(IK)增大。此外，PSⅡ和PSI的最大電子傳遞速率的提升，更多的光能用于電子鏈中的電子傳遞，為葉片暗反應提供更多的能量。

Fv/Fm代表原初光能轉化效率，本次試驗CO2升高并未使黃瓜葉片的原初光能轉化效率增高，這與魏珉等(2000)在黃瓜幼苗上報道CO2升高提高黃瓜葉片原初光能轉化效率0.98 %～1.72 %有所不同[25]，與王晨光等(2015)在大豆上的研究結果類似[26]，這可能與黃瓜不同生長時期對CO2敏感度有關。Maxwell等(2000)認為健康植物的Fv/Fm值較為穩(wěn)定，為0.83左右，植物受到脅迫Fv/Fm才會降低[27]。但有些研究表明Fv/Fm對脅迫的反應不如PIABS敏感[28-29]。由本實驗結果可以看出，對于黃瓜葉片來說，PIABS比Fv/Fm更能靈敏的評價黃瓜葉片的光合性能的變化。

跨膜電勢(Δψ)的和跨膜質(zhì)子勢(ΔpH)不僅可以驅(qū)動類囊體膜上ATP酶合成ATP[30]，跨膜質(zhì)子勢(ΔpH)還能通過qE機制耗散過多光能，下調(diào)光合效率，從而起到調(diào)節(jié)光合能力的作用[31]。本試驗中，CO2升高導致黃瓜葉片跨膜電位(Δψ)增高，這說明促進了玉米黃質(zhì)的形成，通過類囊體ATP酶從腔內(nèi)流向基質(zhì)的H+的量增多。光合作用中另外提供能量的則是內(nèi)囊體薄膜上的跨膜質(zhì)子梯度所構成，CO2增施顯著的提高了跨膜質(zhì)子動力勢(pmf)，而跨膜電位(Δψ)則是pmf提高的根本原因。更多的氫離子通過跨膜質(zhì)子動力勢的增多而進入內(nèi)囊體膜，從而通過ATPase流出，產(chǎn)生更多的ATP用于暗反應的能量供應。

與前人報道單株結果數(shù)增加，但單果重并無顯著差異是苗期CO2增施黃瓜增產(chǎn)的主要原因有所不同[8]，本實驗黃瓜除了單株果數(shù)增加，單果重也有較大幅度增加。由于本實驗在黃瓜定植一周后增施CO2，導致前期葉片弱光捕獲能力增加，同時葉片PSII和PSI活性增強，將捕捉到的光能高效的轉化為化學能，產(chǎn)生更多的ATP用于暗反應的能量供給，促進了黃瓜葉片CO2同化能力的增加，為前期黃瓜生長奠定了良好的物質(zhì)基礎；此外，CO2增施增加了黃瓜花芽的分化，增加了開花數(shù)，從而導致單株坐果數(shù)的增加，最終導致黃瓜產(chǎn)量的增加。這與番茄葉片在CO2增加的環(huán)境中具有較高的CO2同化和運轉效率，同化產(chǎn)物運轉至果實促進了坐果和果實發(fā)育類似[32-33]。由此可見，在春季黃瓜塑料大棚促成栽培過程中從定植后開始增施CO2能顯著的提高其產(chǎn)量。

4 結 論

CO2增施增加了黃瓜的葉面積、光合色素量、2個光系統(tǒng)的電子傳遞效率及類囊體的跨膜質(zhì)子梯度，葉片接受的光能更多的用于CO2同化作用，同時提高了黃瓜葉片的弱光利用率和抗光氧化的能力，最終通過增加單果重和單株結果導致其產(chǎn)量的增加。此外，本實驗結果可以看出，操作簡單且成本較低的吊袋式施肥方式，因其增產(chǎn)效果明顯，在四川弱光地區(qū)春季黃瓜促成栽培中具有較好的應用前景。