可視化組胺快速檢測試紙研究

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

隨著人們生活水平的提高，對溫飽的質(zhì)量要求也有所提高。因此，人們對食品的生產(chǎn)質(zhì)量、加工環(huán)境、流通和銷售過程等各個環(huán)節(jié)的安全問題越來越關(guān)注。而食品安全監(jiān)督部門的檢測方法大部分為儀器分析，使用儀器分析不僅需要相關(guān)的技術(shù)人員，而且成本較高、生成報告過程較慢，因此，導(dǎo)致監(jiān)管部門無法對檢測結(jié)果及時進(jìn)行匯報[1]。所以，人們對快速、準(zhǔn)確、靈敏、低成本且能夠在現(xiàn)場檢測的食品安全分析技術(shù)越來越感興趣[2]。試紙法，因為它的制造和使用方法簡單且成本低、具有可降解性、容易進(jìn)行修飾和印跡，并且它自身的多孔纖維結(jié)構(gòu)可以無需其他外部動力進(jìn)行富集，白色的檢測背景為化學(xué)比色和熒光檢測提供了合適的條件。目前，利用試紙法作為檢測手段已經(jīng)成為了人們廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)[2-3]。

組胺（histamine，HA），又名組織胺，分子式C5H9N3，化學(xué)名 4（5）－（2－氨乙基）咪唑[4]。HA 在組胺酸脫羧酶和細(xì)菌的共同作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)而產(chǎn)生[5]。HA屬于生物堿，高含量的HA有毒性，能夠引起血壓降低，當(dāng)人體攝入HA含量超過1.5 mg/kg時，將會引起過敏反應(yīng)而導(dǎo)致食物中毒[6]。正常儲藏的水產(chǎn)品HA含量不會超過50 mg/kg[7]，這種情況下一般不會引起食物中毒，只有腐敗變質(zhì)的食品會產(chǎn)生大量的HA。由于儲藏技術(shù)落后導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)，以及國外在進(jìn)出口時對我國食品安全設(shè)置的技術(shù)性貿(mào)易壁壘，都會導(dǎo)致我國經(jīng)濟(jì)的嚴(yán)重?fù)p失。因此，我們需要研究一種快速、簡便、靈敏且能夠現(xiàn)場檢測HA的方法。目前，對水產(chǎn)品中HA含量的測定方法主要有分光光度法、液相色譜法、離子色譜法、薄層層析法、毛細(xì)管電泳法、熒光法、電化學(xué)法、生物學(xué)法和比色法等[8-14]。目前報道已經(jīng)有檢測HA的試紙[15]，但大多數(shù)方法都較為繁瑣、費(fèi)時、費(fèi)力且成本較高，而且檢測靈敏度、檢測范圍有待進(jìn)一步提高。為了進(jìn)一步簡化操作程序、節(jié)約檢測時間、提高檢測靈敏度和擴(kuò)大檢測范圍，研制了一種高效的可視化HA快速檢測試紙法。此方法根據(jù)比色法的原理制備了組胺檢測溶液，用聚離子溶液修飾后的濾紙對組胺檢測溶液進(jìn)行富集后具有明顯的顏色變化，可以在現(xiàn)場進(jìn)行快速檢測，并且操作簡便、成本低廉、對檢測者沒有技術(shù)要求，可以實(shí)現(xiàn)批量化生產(chǎn)，在現(xiàn)場檢測中有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磷酸組胺：上海源葉生物科技有限公司；對硝基苯胺、氫氧化鈉、三氯乙酸：天津市福晨化學(xué)試劑廠；亞硝酸鈉、碳酸氫鈉：天津凱通化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇：天津市化學(xué)試劑一廠；甲醇：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；氨水：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；鹽酸、1-乙烯基-3-辛基咪唑溴鹽、烯丙基三乙氧基硅烷、偶氮二異丁腈：天津市大茂化學(xué)試劑廠；魷魚：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

101-IBS電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市華北實(shí)驗儀器有限公司；SB-5200D超聲波清洗劑：寧波新芝生物科技股份有限公司；SHB-3循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；THZ-82B恒溫水?。撼Ｖ葜遣┤?；JY-CH-001研磨機(jī)：永康市九順瑩商貿(mào)有限公司；0.001級pH計：S220梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 載體試紙的篩選

選用快、中、慢速3種型號的定量濾紙進(jìn)行試驗。將試紙剪成長5 cm、寬1.5 cm的試紙條，將一定濃度的顯色試劑和待測物質(zhì)的溶液滴加到濾紙上，靜置5 min后觀察不同型號濾紙的顯色效果。選擇顏色變化明顯、擴(kuò)散度小的濾紙作為載體試紙。

1.3.2 顯色體系的優(yōu)化

1.3.2.1 溶解對硝基苯胺所用溶劑影響

分別以水、乙醇、不同酸性水溶液（0.5、1、1.5、2、2.5mol/L鹽酸溶液）與乙醇混合液為溶劑分別溶解對硝基苯胺，觀察對硝基苯胺的溶解狀態(tài)以及顯色效果。

1.3.2.2 溶解亞硝酸鈉所用溶劑影響

因為乙醇可以調(diào)節(jié)溶劑的極性，所以將不同體積比的水和乙醇混合液（體積比 1∶10、1∶2、1∶1、3∶2、3∶1、2∶1）作溶劑溶解亞硝酸鈉。觀察亞硝酸鈉的溶解狀態(tài)以及顯色效果。

1.3.2.3 顯色試劑比例對顯色效果影響

HA的顯色體系為對硝基苯胺與亞硝酸鈉的混合溶液，將兩種溶液以不同體積比（1∶10、1∶2、1∶1、3∶2、3 ∶1、2 ∶1、5 ∶2）混合，并滴加一定濃度的 HA，使其顯色，觀察顯色效果。

1.3.2.4 背景色的優(yōu)化

要使HA與顯色試劑反應(yīng)顯色，需加入堿性試劑，同時，堿性試劑也會使顯色試劑顯色，我們稱其為背景色。GB 5009.208-2016[16]《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中生物胺的測定》中堿性試劑為2.5 g/50 mL的碳酸鈉溶液，考慮到碳酸氫鈉同樣為堿性試劑，為了優(yōu)化背景顏色，分別配制相同濃度2.5 g/50 mL的碳酸氫鈉與碳酸鈉分別與顯色試劑反應(yīng)，觀察其背景色。

1.3.2.5 待測液的比例

HA與碳酸氫鈉的比例不同也會影響待測液的顯色效果。將 HA 與碳酸氫鈉分別以 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的體積比混合。在處理過的濾紙上分別將4種比例的待測液進(jìn)行滴定，觀察它們的顯色效果。

1.3.3 試紙的修飾

1.3.3.1 成膜物質(zhì)修飾

探究成膜物質(zhì)是否會對試紙滲透作用產(chǎn)生影響，從而提高試紙的靈敏度。因此將聚乙烯醇溶解后浸泡到濾紙上，觀察修飾過聚乙烯醇的濾紙和未加修飾的濾紙的滲透作用。

1.3.3.2 聚離子溶液修飾

先用0.5 mol/L的氨水潤濕103慢速型號的濾紙，再用聚離子溶液涂抹被氨水潤濕的試紙。將顯色試劑分別與10、1 mg/L的HA待測溶液混合后分別滴加到用聚離子溶液修飾后的濾紙上和未修飾的濾紙上，觀察顯色效果。

聚離子溶液的合成：1-乙烯基-3-辛基咪唑溴鹽與烯丙基三乙氧基硅烷按質(zhì)量比6：20混合，用10 mL甲醇溶解，超聲 5 min～10 min，沖氮?dú)?5 min～10 min，加入偶氮二異丁腈封口超聲5 min，60℃水浴加熱反應(yīng)24 h。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)比色卡的制作

第一步將慢速濾紙裁剪長5 cm、寬1.5 cm的試紙條。

第二步將2.5 mg/mL對硝基苯胺溶液與5 mg/mL亞硝酸鈉溶液以體積比3∶2混合配制成顯色試劑。

第三步 配制濃度為 10 000、1 000、100、10、1、0.1 mg/L的HA溶液，分別取適量溶液于試管中，加入相同體積的碳酸氫鈉，震蕩，制成檢測液。

第四步將顯色試劑與檢測液混合，待顏色穩(wěn)定后，均勻滴于聚離子溶液修飾后的試紙上，吹干，密封保存留作標(biāo)準(zhǔn)比色卡。

1.3.5 樣品檢測

1.3.5.1 樣品處理

將從當(dāng)?shù)爻匈徺I的魷魚樣品中取可食用的魚肉部分，用粉碎機(jī)將魚肉均勻絞碎，稱量5.00 g的魚肉試樣，加入三氯乙酸溶液（100 g/L），密封后在水浴鍋中超聲5 min，將魚肉靜置浸泡3 h后過濾。殘渣用蒸餾水洗滌過濾2次～3次，合并所有濾液，將濾液用氫氧化鈉溶液（250 g/L）調(diào)pH值至5.00±0.05，然后移至100 mL容量瓶中用蒸餾水定容備用[17]。用以上方法提取同一樣品的不同存儲條件的樣品1、樣品2，樣品1為正常冷凍狀態(tài)下存儲24 h的魚肉樣品，樣品2為常溫下儲存24 h后變質(zhì)的魚肉樣品。

1.3.5.2 實(shí)際樣品檢測

采用本研究建立的快速檢測試紙法分別對提取過的樣品1和樣品2進(jìn)行檢測，觀察顯色情況與標(biāo)準(zhǔn)比色卡進(jìn)行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體試紙的篩選

不同型號的濾紙對顯色試劑與待測溶液的顯色效果和擴(kuò)散程度有一定的影響，將試劑分別滴于不同型號的濾紙上，結(jié)果如表1所示。

從表1中可以看出，慢速濾紙顯色最佳，因此，后續(xù)所有試驗都以慢速濾紙為載體。

表1 濾紙型號的影響Table 1 The effect of filter paper type

2.2 顯色體系的優(yōu)化

2.2.1 所用溶劑對對硝基苯胺溶解性的影響

分別以水、乙醇、不同酸性水溶液（0.5、1、1.5、2、2.5 mol/L鹽酸溶液）與乙醇混合液為溶劑分別溶解對硝基苯胺，結(jié)果如表2所示。

表2 所用溶劑對對硝基苯胺溶解性的影響Table 2 Solvent effect of nitroanilineon dissolution

水作溶劑，冷卻有析出，會重結(jié)晶；乙醇作溶劑，冷卻無析出，不會重結(jié)晶。若溶解時不加酸，對硝基苯胺浸泡過濾紙后則紙呈黃色，紙質(zhì)較硬，當(dāng)濃度為2 mol/L時，顯色效果最佳，背景干擾最小。因此，后續(xù)所有試驗都以乙醇與2 mol/L的鹽酸為溶劑溶解對硝基苯胺。

2.2.2 所用溶劑對亞硝酸鈉溶解性的影響

不同比例的水和乙醇溶解的亞硝酸鈉滴在濾紙上的顯色效果不同，結(jié)果如表3所示。

表3 所用溶劑對亞硝酸鈉溶解性的影響Table 3 Solvent effect of sodium nitrite ondissolution

水和乙醇體積比為1∶2時效果最佳。因此，后續(xù)所有試驗都以體積比為1∶2的水和乙醇為溶劑溶解亞硝酸鈉。

2.2.3 顯色試劑比例對顯色效果影響

與亞硝酸鈉的混合溶液在不同比例的情況下與HA待測溶液混合的顯色效果不同，結(jié)果如表4所示。

表4 顯色試劑比例對顯色效果影響Table 4 Effect of the color reagent ratio on the color reaction

對硝基苯胺與亞硝酸鈉體積比為3∶2時顯色效果最佳。因此，后續(xù)所有試驗都以對硝基苯胺與亞硝酸鈉體積比為3∶2作為顯色試劑比例。

2.2.4 背景色的優(yōu)化

相同濃度的碳酸氫鈉與碳酸鈉分別與顯色試劑反應(yīng)，結(jié)果如表5所示。

表5 背景色的優(yōu)化Table 5 The optimization of background color

碳酸氫鈉作為堿性試劑背景色明顯較淺，與顯色試劑顯色效果最佳。因此，后續(xù)所有試驗都以2.5 g/50 mL碳酸氫鈉作為堿性試劑。

2.2.5 待測液的比例

HA 與碳酸氫鈉以不同體積比 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4混合，顯色效果如圖1所示。

圖1 待測液的比例Fig.1 The proportion of the solution

當(dāng)HA與碳酸氫鈉體積比為1∶1時擴(kuò)散最小、顯色最均勻，與待測溶液反應(yīng)后顯色效果最佳。因此，后續(xù)所有試驗都以HA與碳酸氫鈉體積比為1∶1作為待測液比例。

2.3 試紙的修飾

2.3.1 成膜物質(zhì)修飾

將濾紙浸泡聚乙烯醇后與未浸泡聚乙烯醇濾紙對比，結(jié)果如表6所示。

表6 聚乙烯醇對滲透性的影響Table 6 The effect of polyvinyl alcohol（PVA）on the permeation of paper

浸泡過聚乙烯醇的濾紙滲透作用減小，因此舍棄該方案，進(jìn)一步探究修飾試紙的方案。

2.3.2 聚離子溶液修飾

103慢速濾紙用聚離子水溶液和氨水處理過后與未修飾過的濾紙相比，分別滴加過HA與顯色試劑的混合溶液后顯色結(jié)果如圖2、圖3所示。

圖2 聚離子溶液修飾的濾紙F(tuán)ig.2 Modification of filter paper with poly（ionic liquids）solution

圖3 未修飾的濾紙F(tuán)ig.3 Unmodified filter paper

聚離子溶液修飾過的濾紙顯色均勻、無背景色，不干擾測定液在試紙上的顯色并且對測定液進(jìn)行了富集，經(jīng)過修飾的濾紙可以檢測出0.1 mg/L的HA而未加修飾的濾紙則檢測不出0.1 mg/L的HA。因此，利用此方法修飾后的濾紙不僅加深了測定液在試紙上的顯色程度、提高了靈敏度、降低了方法的檢出限，而且更易于觀察、辨別色階的變化，制作標(biāo)準(zhǔn)比色卡。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)比色卡的制作

可視化HA檢測試紙的標(biāo)準(zhǔn)比色卡如圖4所示。

隨著HA濃度的降低，在試紙上的顯色情況隨之變淺。當(dāng)HA的濃度為0.1 mg/L時顯色情況與背景色有明顯的色階變化，因此，該試紙法的檢測限為0.1 mg/L。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)比色卡Fig.4 Standard color card

2.5 實(shí)際樣品的檢測

采用本研究建立的快速檢測試紙法分別對提取過的樣品1和樣品2進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如圖5所示。

圖5 實(shí)際樣檢測Fig.5 The detection of histamine in fish

樣品1的顯色情況比樣品2的顏色要深，與比色卡對比和濃度為100 mg/L的組胺標(biāo)準(zhǔn)樣品相似。所以，正常冷凍狀態(tài)下儲存的魚中不含（或含有及其微量）HA，可安全食用；而變質(zhì)的魚中HA含量增加，如果攝入量超過100 mg會導(dǎo)致食物中毒。因此，本研究建立的快速檢測試紙在現(xiàn)場的實(shí)際樣檢測中有很大的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

本研究選用聚離子溶液修飾過的103型號慢速濾紙為載體，顯色試劑為體積比3∶2的2.5 mg/mL對硝基苯胺與亞硝酸鈉（對硝基苯胺溶劑為乙醇與2 mol/L鹽酸的混合溶液體積比為9∶1，5 mg/mL亞硝酸鈉溶劑為水和乙醇混合溶液體積比為1∶2），待測溶液為比例1∶1的2.5 g/50 mL碳酸氫鈉與HA混合溶液，建立了可視化HA快速檢測試紙法。試驗結(jié)果表明：該方法的最低檢測限為0.1 mg/L，實(shí)際樣品檢測可明顯觀察到變質(zhì)樣品中HA與顯色試劑反應(yīng)后的顏色變化。聚離子溶液修飾過的試紙降低了方法的檢出限并且制作出的標(biāo)準(zhǔn)比色卡可長期保存。此試紙制造成本低、方法簡單、便于儲存且攜帶方便，能夠快速、靈敏的定性及半定量的檢測魚類產(chǎn)品中HA，可批量生產(chǎn)并進(jìn)行現(xiàn)場檢測。