銀杏二萜內(nèi)酯對心肌缺血再灌注損傷大鼠細(xì)胞凋亡的影響及其機理研究

李延珍 李忠輝 李 良 楊 建 李 銳 李國慶 董志歡 郭海平

（邯鄲市第一醫(yī)院，河北邯鄲 056002）

銀杏葉為銀杏科銀杏屬多年生落葉喬木銀杏的葉，是我國傳統(tǒng)中藥品種，《本草綱目》和《中藥志》中均有記載，其性味甘苦澀平，具有益心斂肺、化濕止瀉之功效?，F(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，銀杏二萜內(nèi)酯類化合物為銀杏葉的主要有效成分，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（DGMI）主要成分為銀杏內(nèi)酯，其中銀杏內(nèi)酯A占35%，銀杏內(nèi)酯B占60%，銀杏內(nèi)酯C占2%，銀杏內(nèi)酯K占2%。既往研究發(fā)現(xiàn)DGMI具有抑制氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)作用[1-2]，但DGMI是否對心肌缺血再灌注后細(xì)胞凋亡具有抑制作用及其作用機制報道尚不多見。本研究通過結(jié)扎冠狀動脈前降支建立心肌缺血再灌注大鼠模型，造模前7d開始給予DGMI進(jìn)行干預(yù)，探討DGMI對心肌缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的影響及其可能的機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠（8周齡，220～260g），購自河北省實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（冀）2013-1-003。飼養(yǎng)環(huán)境：23℃～25℃，相對濕度55%～60%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

1.2 藥物與試劑 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（DGMI）購自江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司（批號：20170416）；TTC購自美國Sigma公司（批號：M2128）；TUNEL試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：161208）；Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3多克隆抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號：20170316、20170401、20170329）。

1.3 儀器 生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；石蠟切片機（德國Leica公司）；BI-2000醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；FA25勻漿機（上海洽姆儀器科技有限公司）；倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；DYCZ-24D雙垂直電泳槽、DYCZ-40B轉(zhuǎn)印電泳槽、DYY-11型多用電泳儀（北京六一儀器廠）；低溫離心機（德國eppendorf公司）。

2 實驗方法

2.1 分組、給藥與造模 將100只實驗用大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為假手術(shù)組、模型組和DGMI低（1.5mg/kg）、中（3mg/kg）、高（6mg/kg）劑量組，每組20只。DGMI各劑量組分別腹腔注射DGMI 1.5、3、6mg/（kg·d），1次/d，連續(xù)7d，假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水。最后1次給藥2h后，除假手術(shù)組外其余各組大鼠參照徐叔云等[3]報道的實驗方法，通過夾閉左冠狀動脈前降支的方法制備心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，實驗過程實施心電圖監(jiān)測，心電圖示ST段抬高或T波高聳為心肌缺血，夾閉30min后恢復(fù)血流灌注，抬高的ST段降低或高聳的T波得以恢復(fù)表示心肌再灌注成功。假手術(shù)組行手術(shù)通路但不夾閉冠狀動脈。

2.2 心電指標(biāo)監(jiān)測 全程實施心電圖監(jiān)測，再灌注60min后記錄各組大鼠心電圖PR間期、QRS間期、ST段變化。

2.3 取材及指標(biāo)檢測 完成心電指標(biāo)監(jiān)測后，各組大鼠均腹腔注射水合氯醛實施麻醉后開胸取心臟組織。各組隨機取8只大鼠進(jìn)行心肌梗死面積測定，再隨機取4只大鼠進(jìn)行心肌組織病變和心肌細(xì)胞凋亡觀察，剩余8只大鼠進(jìn)行Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達(dá)檢測，

2.3.1 TCC染色法測定心肌組織梗死面積 取心臟組織置-20℃凍存20min后切片，2%TTC溶液（恒溫37℃、避光）孵育15min，灰白色為梗死區(qū)，采用醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)分析心肌組織梗死面積。

2.3.2 心肌組織病變及心肌細(xì)胞凋亡的觀察 取心臟組織并置于4%多聚甲醛溶液中72h進(jìn)行固定，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片和脫蠟水化處理后，通過HE染色并通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織病變，通過TUNEL染色后使用倒置光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡狀況。凋亡指數(shù)（AI）計算：每張TUNEL染色切片選取不重疊的6個視野，分別計數(shù)每個視野中的細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，各組取平均值后計算AI。AI（%）=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.3.3 Western blotting法 檢 測Bcl-2、Bax、激 活 型Caspase-3蛋白表達(dá) 取心肌組織并研磨勻漿，經(jīng)12000r/min低溫（4℃）離心20min處理后取沉淀，BCA法行蛋白定量后實施高溫蛋白變性，電泳，待溴酚藍(lán)接近膠底部時停止，轉(zhuǎn)膜，春紅溶液染色，室溫下5%脫脂奶粉封閉2h，一抗Bcl-2、Bax、激 活 型Caspase-3、β-actin（1∶500）4℃過夜，洗膜，二抗（1∶100）室溫?fù)u床上孵育1h后經(jīng)ECL顯色。根據(jù)條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參半定量分析Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 15.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠心電圖監(jiān)測情況 與假手術(shù)組大鼠比較，模型組及DGMI各劑量組大鼠結(jié)扎左冠狀動脈前降支后出現(xiàn)左心室前壁呈灰白，而后逐漸呈現(xiàn)紫紺的癥狀，心電圖示ST段抬高或T波高聳，提示急性心肌梗死大鼠模型造模成功。經(jīng)DGMI中、高劑量預(yù)處理7d，缺血再灌注損傷大鼠心電圖波形明顯改善，以DGMI高劑量組心電圖波形改善情況最為顯著。各組大鼠缺血再灌注60min時心電圖檢測結(jié)果見表1。

3.2 各組大鼠心肌組織梗死面積比較 假手術(shù)組大鼠心肌組織無梗死，模型組大鼠心肌組織梗死面積為（45.18±5.60）%，顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）；DGMI低、中、高劑量組梗死面積分別為（39.43±7.27）%、（31.94±5.62）%、（22.41±4.53）%，與模型組比較，DGMI中、高劑量組心肌梗死面積顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。與DGMI低劑量組比較，DGMI高劑量組梗死面積顯著降低（P＜0.01）；DGMI中劑量組梗死面積與DGMI低、高劑量組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.3 各組大鼠心肌組織病變觀察結(jié)果比較 經(jīng)HE染色后觀察病理切片，假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)均未見明顯異常；模型組心肌組織呈現(xiàn)肌原纖維斷裂、排列紊亂，心肌細(xì)胞呈空泡變性，細(xì)胞質(zhì)著色不均，胞核深染等病理性改變；與模型組比較，DGMI低、中、高劑量組大鼠心肌組織病變呈現(xiàn)不同程度改善，以DGMI高劑量組效果最為顯著。見圖1。

表1 各組大鼠心電圖PR間期、QRS間期、ST段比較（）

表1 各組大鼠心電圖PR間期、QRS間期、ST段比較（）

注： 與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與DGMI低劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數(shù)（只） PR間期（ms） QRS間期（ms） ST段（mV）假手術(shù)組 20 44.69±4.78 32.19±2.88 0.22±0.04模型組 20 31.74±4.59** 22.35±2.73** 0.51±0.06**DGMI低劑量組 20 34.00±4.96 22.52±2.60 0.49±0.07 DGMI中劑量組 20 36.51±5.25△ 25.94±2.99△ 0.41±0.08△DGMI高劑量組 20 36.85±5.28△ 27.80±3.32△△## 0.35±0.05△△#

3.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡狀況比較 經(jīng)TUNEL染色后觀察，模型組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多；與模型組比較，DGMI低、中、高劑量組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，以DGMI高劑量組最為顯著。見圖2。假手術(shù)組心肌細(xì)胞AI為0；模型組大鼠心肌細(xì)胞AI為（56.81±10.24）%，較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01）；DGMI低、中、高劑量組AI分別為（45.86±9.11）%、（39.24±7.83）%、（26.35±5.79）%，與模型組比較，DGMI中、高劑量組AI顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。與DGMI低、中劑量組比較，DGMI高劑量組AI顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；DGMI低、中劑量組組間AI比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.5 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達(dá)比較 結(jié)果見圖3、表2。

4 討論

隨著高血壓、高血脂等基礎(chǔ)疾病發(fā)病率的提高，冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary heart disease，CHD）以及由其所引發(fā)的急性心肌梗死（aeute myoeardial infaretion，AMI）發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重危害著人類的生命健康。及時通過藥物或介入手術(shù)溶栓以實現(xiàn)血流恢復(fù)灌注是目前臨床上治療AMI的主要方案，但缺血再灌注損傷并發(fā)癥的存在嚴(yán)重影響著AMI預(yù)后。缺血再灌注損傷病理機制非常復(fù)雜，既往研究發(fā)現(xiàn)心功能異常、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)以及繼發(fā)性心肌細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要病理機制[4-8]，這也為我們研發(fā)能夠有效降低缺血再灌注損傷的新型藥物提供了思路。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)（HE，×200倍）

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡狀況（TUNEL，×400倍）

圖3 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達(dá)比較（）

表2 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達(dá)比較（）

注： 與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與DGMI低劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數(shù)（只） Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax 激活型caspase-3假手術(shù)組 20 0.26±0.09 0.19±0.07 1.37±0.58 0.10±0.04模型組 20 0.39±0.12* 0.75±0.18** 0.53±0.17** 0.49±0.18**DGMI低劑量組 20 0.41±0.10 0.60±0.19 0.67±0.24 0.42±0.15 DGMI中劑量組 20 0.52±0.14△ 0.42±0.14△△ 1.21±0.43△△## 0.30±0.10△DGMI高劑量組 20 0.63±0.16△△# 0.36±0.11△△## 1.69±0.61△△## 0.16±0.06△△##

心電圖ST段抬高或T波高聳是急性心肌梗死的典型表現(xiàn)，本研究采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法制備急性心肌梗死大鼠模型，該造模方法操作簡單、成功率高且與臨床AMI癥狀接近，是目前AMI動物實驗研究常用的造模方法[9]。本實驗研究結(jié)果表明，經(jīng)DGMI干預(yù)能夠有效改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心電圖波形，改善心肌組織病變，減小心肌組織梗死面積，且高劑量組上述作用均優(yōu)于低劑量組，提示DGMI對心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用并且該作用具有一定的劑量依賴性。

激活型Caspase-3和Bcl-2基因家族Bcl-2、Bax是細(xì)胞凋亡過程中重要的調(diào)控基因。激活型Caspase-3參與細(xì)胞凋亡的啟動以及整個凋亡過程的調(diào)控[10-12]；Bcl-2能夠抑制細(xì)胞色素C釋放和Caspase-3激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，而具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[13]；Bax具有破壞線粒體滲透性、激活Caspase-3而表現(xiàn)出促細(xì)胞凋亡作用[14]；Saeedi Borujeni MJ等[15]研究發(fā)現(xiàn)Bax與Bcl-2能夠聚合成二聚體，從而相互抑制活性，所以Bax/Bcl-2表達(dá)比值更加能夠體現(xiàn)二者對細(xì)胞凋亡的實際調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DGMI干預(yù)能夠顯著上調(diào)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax和激活型Caspase-3蛋白表達(dá)，顯著提高Bax/Bcl-2比值，高劑量組對Bcl-2蛋白、Bax和激活型Caspase-3蛋白的調(diào)控作用均優(yōu)于低劑量組，這可能是DGMI抑制心肌細(xì)胞凋亡的重要分子機制之一。

綜上所述，DGMI可能通過抑制心肌細(xì)胞凋亡而對心肌缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用，其機制可能與DGMI調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白（上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、下調(diào)Bax和激活型Caspase-3蛋白表達(dá)，提高Bax/Bcl-2表達(dá)比值）有關(guān)。氧化應(yīng)激是缺血再灌注損傷重要病理機制之一，DGMI對心肌缺血再灌注損傷后氧化應(yīng)激的影響及其與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系有待于進(jìn)一步探討。