2型糖尿病下肢動脈中膜鈣化影響因素研究

勞 鈺 羅葆明 楊 川 任 萌 劉 丹 田 晶 阮鏡良 嚴 勵

血管鈣化指血管壁內(nèi)鈣鹽過量沉積，依據(jù)發(fā)生部位的不同可分為內(nèi)膜鈣化、中膜鈣化、心臟瓣膜鈣化、血管鈣化防御4種主要類型[1]。中膜鈣化發(fā)生于動脈的中膜，可獨立于內(nèi)膜鈣化存在，在糖尿病患者下肢動脈病變中尤為常見[2-3]。本團隊既往研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者下肢動脈中膜鈣化檢出率較糖耐量正常者高，糖尿病是下肢動脈中膜鈣化發(fā)生的獨立危險因素。但糖尿病下肢動脈中膜鈣化的病因及發(fā)生機制目前尚未完全明確，促進其發(fā)生發(fā)展的危險因素鮮有報道。故本研究將結(jié)合彩色多普勒超聲檢查結(jié)果初步探討糖尿病下肢動脈中膜鈣化的可能影響因素，為臨床糖尿病下肢動脈中膜鈣化的有效干預(yù)提供參考依據(jù)。

1 研究對象

選擇在中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院內(nèi)分泌科住院患者、門診患者共400例。

納入標準：年齡30～80歲；同意參與本次研究。

排除標準：①急性高血壓、急性心肌梗死、心力衰竭、腦血管意外、手術(shù)等應(yīng)激狀態(tài)，或有感冒、肺炎等明確嚴重感染性疾??；②嚴重腎功能不全長期規(guī)律行血液透析或腹膜透析者；③嚴重肝功能障礙；④有既往服用避孕藥、糖皮質(zhì)激素等藥物史；⑤1型糖尿病、特殊類型糖尿??；⑥明確腫瘤病史。

2 研究方法

2.1 入選對象記錄資料

2.1.1 臨床資料及體格檢查 包括姓名、年齡、性別、身高、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Indes, BMI)、腰圍、臀圍、腰臀比、收縮壓(Systolic Pressure，SBP)、舒張壓(Diastolic Pressure，DBP)、高血壓病史、吸煙史，糖尿病病程。

2.1.2 實驗室檢查結(jié)果 糖基化血紅蛋白(Glycosylated Hemoglobin，HbA1c)、空腹血葡萄糖(0-hour Fasting Plasma Glucose, GLU-0 h)、餐后2小時血葡萄糖(2-hour Postprandial Plasma Glucose, GLU-2 h)、血尿素氮(Blood Urea Nitrogen, BUN)、血鈣(Serum Calcium, Ca)、血磷(Serum Phosphate, P)、血肌酐(Serum Creatinine, SCr)、血尿酸(Uric Acid, UA)、膽固醇(Cholesterol, CHOL)、甘油三酯(Triglyceride, TG)、高密度脂蛋白膽固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol, LDL-C)、超敏C反應(yīng)蛋白(High Sensitivity C-reactive Protein, hCRP)。

2.2 下肢動脈彩色多普勒超聲檢測

采用Esaote MyLab 60(2)彩色多普勒超聲儀器，高頻探頭，頻率4～13 MHz，由2位具有豐富下肢動脈彩超檢測經(jīng)驗的超聲科醫(yī)師負責為所有患者檢測雙側(cè)股淺動脈、脛前動脈、脛后動脈、足背動脈，觀察平行于動脈走行截圖。

3 主要診斷標準

3.1 估算腎小球濾過率(Estimated Glomerular Filtration Rate, eGFR)及慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease, CKD)

估算腎小球濾過率使用MDRD公式 eGFR(mL/min·1.73 m2)=170×(Scr)-0.999×(Age)-0.176×(BUN)-0.17×(ALB)+0.318×0.762(女性)[4]； 按照美國腎臟病基金會K/DOQI專家組對CKD分期的建議分期：CKD1期，eGFR水平為≥90；CKD2期，eGFR水平60～89；CKD3期，eGFR水平為30～59；CKD4期， eGFR水平為15～29；CKD5期， eGFR水平為<15。CKD1-2期合并尿蛋白陽性、CKD3期或以上考慮存在慢性腎臟病。

3.2 彩超指標及動脈中膜鈣化診斷標準

動脈中膜鈣化在超聲下表現(xiàn)為血管壁內(nèi)連續(xù)、平滑、線性的高回聲，內(nèi)膜鈣化表現(xiàn)為斑片狀突出于管腔、不聯(lián)系、不規(guī)則高回聲，容易相鑒別(詳見圖1、圖2)。參考Liu KH等[5]研究方法，每條動脈截取病變部位4 cm作為單位觀察長度，依據(jù)該觀察長度里中膜鈣化長度評分：0分(未見中膜鈣化)，1分(0.1 cm3 cm)(詳見圖3、圖4)。由于截圖中血管為雙側(cè)管壁平行圖形，若在雙側(cè)血管壁同一水平出現(xiàn)的鈣化考慮為同一部位鈣化(只需計分1次)、雙側(cè)管壁不同水平鈣化則考慮為非同一處鈣化(累積計分)。每條血管測多段單位觀察長度，以動脈中膜鈣化最為嚴重部分作該段血管評分。單側(cè)動脈中膜鈣化評分為0～4分，雙側(cè)動脈中膜鈣化總分則可為0～8分。取雙側(cè)動脈中膜鈣化總分作為該血管水平中膜鈣化嚴重程度評分，并將1～4分定為輕度中膜鈣化、5～8分定位重度中膜鈣化。若患者單側(cè)肢體因糖尿病足敷料包扎、截肢等原因未行超聲檢測，則不予計算雙側(cè)動脈中膜鈣化總分且不予嚴重程度評分。

注：箭頭所指為鈣化部分

注：箭頭所指為鈣化部分

圖3 53歲女性，左側(cè)足背動脈正常血管壁，中膜鈣化嚴重程度評分為0分

注：箭頭所指為測量中膜鈣化部分

圖4 a.56歲男性左側(cè)脛前動脈，l鈣化長度≤1 cm，中膜鈣化嚴重程度評分為1分；b.61歲男性左側(cè)脛前動脈，1 cm3 cm，膜鈣化嚴重程度評分為4分

4 統(tǒng)計學方法

5 結(jié)果

5.1 總體患者一般資料

研究對象平均年齡(59.1±11.1)歲，男性220例(占55.0%)，彩色多普勒超聲檢出動脈中膜鈣化者共207例(占51.8%)，詳見表1。依據(jù)OGTT結(jié)果分為糖尿病足(DM group)和糖耐量正常組(NGT group)，下肢動脈中膜鈣化檢出率高；依據(jù)下肢動脈是否檢出中膜鈣化分為中膜鈣化組與無鈣化組，結(jié)果顯示兩組之間年齡、體質(zhì)量指數(shù)、血肌酐、高密度脂蛋白膽固醇、估算腎小球濾過率比例差異有統(tǒng)計學意義，而收縮壓、血鈣水平間差異有較明顯趨勢，然分析結(jié)果無統(tǒng)計學意義。各指標水平中體質(zhì)量指數(shù)、估算腎小球濾過率為無鈣化組高，其余為鈣化組高，詳見表2。糖尿病患者膝下動脈中膜鈣化檢出率高于比膝上動脈(37.7% vs. 31.6%,P<0.001)。另外，糖尿病患者重度中膜鈣化檢出率也高于糖耐量正常組，詳見表3。

表1 本研究患者總體資料 n(%)

注：1)為中位數(shù)(四分位數(shù)間距P25～P75)表示

表2 糖尿病患者下肢動脈中膜鈣化組與無鈣化組基本資料比較

注：1)P有統(tǒng)計學意義，2)為中位數(shù)(四分位數(shù)間距P25～P75)表示,3)單位為mL·min·1.73m-2

表3 糖尿病組與糖耐量正常組不同動脈中膜鈣化嚴重程度比較 n(%)

5.2 糖尿病患者下肢動脈中膜鈣化發(fā)生的影響因素分析

以有無下肢動脈中膜鈣化為因變量行Logistic回歸分析，得出糖尿病是下肢動脈中膜鈣化發(fā)生的獨立危險因素(Odds Ratio,OR), 3.1; 95%(Confidence Interval,CI), 1.6～5.7,P<0.05。將表2中變量與有無下肢動脈中膜鈣化行Spearman秩相關(guān)分析，得出年齡、體質(zhì)量指數(shù)、收縮壓、血肌酐、血鈣、高密度脂蛋白膽固醇、估算腎小球濾過率、與有無下肢動脈中膜鈣化相關(guān)；再使用單因素Logistic回歸分析后年齡、體質(zhì)量指數(shù)、血鈣、高密度脂蛋白膽固醇符合P<0.10，取上述變量放置于同一回歸模型中，以有無下肢動脈中膜鈣化為因變量行多因素Logistic回歸分析，校正年齡、體質(zhì)量指數(shù)、性別后，年齡、高密度脂蛋白膽固醇與下肢動脈中膜鈣化仍存在關(guān)聯(lián)(詳見表4)。提示糖尿病患者中增齡、低高密度脂蛋白膽固醇血癥可能與下肢動脈中膜鈣化的發(fā)生相關(guān)。相同步驟觀察表2中變量與下肢動脈重度中膜鈣化的關(guān)系，最終取得收縮壓放置于同一回歸模型，以下肢動脈重度中膜鈣化作為因變量行多因素Logistic回歸分析，校正年齡、體質(zhì)量指數(shù)、性別后收縮壓與下肢動脈重度中膜鈣化仍存在關(guān)聯(lián)(詳見表5)。提示高收縮壓可能是下肢動脈重度中膜鈣化發(fā)生的影響因素。

表4 糖尿病下肢動脈中膜鈣化發(fā)生的影響因素篩查

注：1)P有統(tǒng)計學意義，其中r值為相關(guān)系數(shù)，B值為回歸系數(shù)

表5 糖尿病下肢動脈重度中膜鈣化發(fā)生的影響因素篩查

注：1)P有統(tǒng)計學意義，其中r值為相關(guān)系數(shù)，B值為回歸系數(shù)

5.3 下肢動脈中膜鈣化與內(nèi)膜鈣化

用彩色多普勒超聲觀察下肢動脈中膜鈣化的同時亦收集了內(nèi)膜鈣化的數(shù)據(jù)，彩色多普勒超聲檢出下肢動脈內(nèi)膜鈣化有193例(64.8%)。進一步行Spearman秩相關(guān)分析得出兩者之間存在正性相關(guān)關(guān)系(r= 0.56，P<0.001)，提示兩者的發(fā)生存在著伴隨關(guān)系(詳見表6)。

表6 下肢動脈內(nèi)膜鈣化與中膜鈣化發(fā)生的相關(guān)性分析

注：1)P有統(tǒng)計學意義

6 討論

下肢血管病變的防治越來越引起人們的重視。本團隊既往研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者下肢動脈中膜鈣化檢出率高，糖尿病是下肢動脈中膜鈣化發(fā)生的獨立危險因素。糖尿病下肢動脈中膜鈣化是糖尿病患者下肢血管病變的重要表現(xiàn)，也是引起糖尿病患者下肢缺血、缺氧的重要原因，應(yīng)引起高度重視，須及早診斷并予有效干預(yù)治療。

動脈中膜鈣化的發(fā)生機制仍未明確，其起始于中膜的彈性纖維，鈣化環(huán)境多無脂質(zhì)沉淀[2]。中膜鈣化可獨立于內(nèi)膜鈣化存在，兩者的發(fā)生機制不完全一致。除了鈣磷代謝紊亂、細胞凋亡、細胞外基質(zhì)降解等可能機制外，目前研究關(guān)注的觀點認為動脈中膜鈣化形成是彈性纖維鈣化、成骨信號分子上調(diào)促進血管壁內(nèi)具有分化成骨或軟骨細胞潛在能力的間充質(zhì)細胞遷移增殖并向成骨細胞表型轉(zhuǎn)化，介導異位骨形成的主動調(diào)節(jié)過程[1, 6-7]。而了解糖尿病下肢動脈中膜鈣化發(fā)生及嚴重程度改變的危險因素，對指導治療有重要的臨床意義。

本團隊既往研究已發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病為下肢動脈中膜鈣化發(fā)生的獨立危險因素。進一步分析結(jié)果提示增齡、高收縮壓、低高密度脂蛋白膽固醇血癥、進展的慢性腎臟病等影響因素可能參與了糖尿病患者下肢動脈中膜鈣化發(fā)生以及鈣化嚴重程度向重度中膜鈣化發(fā)展。

動脈中膜鈣化的形成傳統(tǒng)機制主要一下幾條：①細胞凋亡增多，凋亡小體形成：體外實驗發(fā)現(xiàn)，凋亡的細胞刺激鈣化的發(fā)生[6, 8]；②鈣磷代謝異常：體外實驗表明鈣、磷可誘導促進細胞凋亡，也會促進細胞外基質(zhì)礦化[6, 8]；③基質(zhì)的降解或成分改變：血管壁細胞外基質(zhì)對血管有著保護作用，且基質(zhì)與血管壁細胞之間的相互作用，可影響細胞的遷移、分化功能，其組成和表達的變化參與血管鈣化進程的主動調(diào)節(jié)[6, 9]。目前研究關(guān)注的主要機制認為動脈中膜鈣化是在機體雙向調(diào)節(jié)因素失衡狀態(tài)下，成骨信號傳導通路激活，具有分化成骨或軟骨細胞潛在能力的間充質(zhì)細胞(包括血管平滑肌細胞、鈣化的血管壁細胞、周皮細胞、循環(huán)肝細胞)遷移增殖并向成骨細胞表型轉(zhuǎn)化，并具備分泌堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)、合成血管中膜鈣化主要成分——羥磷灰石結(jié)晶的能力，于血管壁逐漸發(fā)展成板狀的類骨質(zhì)[1-2]。傳統(tǒng)成骨信號傳導通路——骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins, BMPs)信號通路與Wnt信號通路，在骨形成過程中，能夠促進成骨細胞分化，促進成骨細胞分泌的細胞外基質(zhì)礦化[10-12]。在動脈管壁中上述兩條信號通路激活可以使間充質(zhì)細胞分化成為成骨細胞，介導血管鈣化形成；細胞實驗中抑制上述通路信號傳導可有效控制動脈中膜鈣化的發(fā)生發(fā)展[11, 13-14]。外周血核因子κB受體因子(Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B,RANK)是破骨細胞表面分泌的Ⅰ型膜蛋白，通過與其上游配體RANKL相互作用調(diào)節(jié)破骨細胞的分化、激活及存活；骨保護素(Osteoprotegerin, OPG)則是由成骨細胞分泌，作為誘捕受體與RANKL結(jié)合，抑制RANK信號傳導[15]。研究發(fā)現(xiàn),在多種炎癥因子的刺激與作用下，血管內(nèi)皮細胞可分泌RANKL，激活血管平滑肌細胞成骨化分化，并與RANK相互作用，促進新生血管形成及動脈鈣化[15-16]。

本次研究中糖尿病患者中糖尿病病程、血糖控制情況(如糖基化血紅蛋白、靜脈血葡萄糖等)、血胰島素水平、炎癥指標(超敏C反應(yīng)蛋白)等均未得出與下肢動脈中膜鈣化的相關(guān)關(guān)系，考慮原因為本研究屬于橫斷面研究，不能完全體現(xiàn)既往病程中各項變量的水平，而下肢動脈中膜鈣化的發(fā)生發(fā)展是一個慢性的過程。另外，糖尿病患者下肢動脈中膜鈣化的發(fā)生發(fā)展還可能與高血糖“代謝記憶”有關(guān)。由于中國人群普遍缺乏體檢意識及醫(yī)從性差，糖尿病發(fā)現(xiàn)晚、血糖控制欠佳，故病情控制后下肢動脈中膜鈣化仍可發(fā)生或繼續(xù)發(fā)展[17]。因此，相關(guān)變量與下肢動脈中膜鈣化的關(guān)系有待進一步前瞻性研究再予分析。

增齡導致動脈中膜鈣化發(fā)生發(fā)展的可能原因有隨著年齡增長，管壁內(nèi)彈性纖維退行性變發(fā)生礦化，平滑肌細胞凋亡增多、凋亡小體形成；另一方面，年齡也反映了動脈中膜在其他影響因素中的累積暴露[18]。

高血壓患者(尤其是高腎素型高血壓)常存在腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)功能障礙，醛固酮可通過刺激Wnt信號通路誘導動脈管壁血管平滑肌細胞成骨樣轉(zhuǎn)變[19]。本研究糖尿病患者只有高收縮壓與下肢動脈重度中膜鈣化的發(fā)生相關(guān)，舒張壓、高血壓病史等均無提示其與下肢重度中膜鈣化之間存在相關(guān)關(guān)系。原因考慮可能由于本研究中入組對象大部分存在動脈硬化、血管彈性減弱導致舒張壓不高；而高血壓患者病程、是否服用藥物治療、治療效果等混雜因素存在，需要完善資料、跟蹤隨訪，以改善樣本偏性后再行進一步分析。

脂肪代謝紊亂也是糖尿病病理生理特點，高密度脂蛋白膽固醇降低為主要表現(xiàn)之一。既往研究認為，高密度脂蛋白膽固醇具有抗動脈硬化作用；體外細胞實驗顯示未發(fā)生氧化修飾的高密度脂蛋白膽固醇可有抑制血管鈣化的作用[20]。同時，高密度脂蛋白膽固醇水平降低常伴有血循環(huán)中瘦素水平升高，瘦素水平升高可上調(diào)BMPs成骨信號通路，刺激血管壁平滑肌細胞分化為成骨細胞，介導血管鈣化形成[2]。

糖尿病患者常合并腎損害，慢性腎臟病患者常伴有鈣磷代謝異常，血磷水平升高可促進血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化[2]。另外，慢性腎臟病患者常合并骨質(zhì)疏松癥。RANK/RANKL/OPG之間的平衡是維持機體內(nèi)鈣分配穩(wěn)定的重要機制之一。機體內(nèi)鈣的分配不平衡可導致其從骨質(zhì)轉(zhuǎn)移至動脈壁形成異位鈣化，同時血管內(nèi)皮細胞分泌RANKL可激活血管平滑肌細胞成骨化分化，并與RANK相互作用促進動脈中膜鈣化形成[15, 21]。

本研究中，下肢動脈中膜鈣化組血鈣水平較無鈣化組低(P=0.05)，但回歸分析結(jié)果無統(tǒng)計學意義，提示本研究結(jié)果未顯示血鈣水平與糖尿病下肢動脈中膜鈣化的發(fā)生之間存在關(guān)聯(lián)。既往研究通過動物實驗、細胞實驗證實，嚴重的動脈鈣化往往伴隨升高的血鈣濃度，而細胞內(nèi)、外鈣濃度升高可誘導血管壁平滑肌細胞成骨樣轉(zhuǎn)變，促進血管鈣化[22]。然而也有研究發(fā)現(xiàn)，鈣磷代謝異常并非糖尿病中膜鈣化的發(fā)生的必要因素[23]。因此，血鈣與糖尿病下肢動脈中膜鈣化間關(guān)系有待擴大樣本量、排除如腎功能等因素影響后再行分析。

另外，吸煙、男性、高血尿酸水平等均有研究發(fā)現(xiàn)與動脈內(nèi)膜鈣化或全血管壁鈣化(包含內(nèi)膜鈣化及中膜鈣化)的發(fā)生相關(guān)[24-25]。但本研究結(jié)果未顯示上述變量與下肢動脈中膜鈣化發(fā)生之間存在關(guān)聯(lián)。考慮本次研究為橫斷面研究、整體樣本數(shù)量少、入組對象男性比例多等情況，須進一步擴大樣本量分析再行分析上述指標是否糖尿病患者下肢動脈中膜鈣化發(fā)生發(fā)展的危險因素。

本研究還發(fā)現(xiàn)下肢動脈中膜鈣化的發(fā)生與內(nèi)膜鈣化存在正性相關(guān)關(guān)系。動脈內(nèi)膜鈣化發(fā)生發(fā)展機制與動脈中膜鈣化不完全一致，但兩者之間存在共享機制。糖尿病共同的病理生理因素刺激作用可加快病變進展，兩者在下肢動脈病變的發(fā)生發(fā)展中可能起著協(xié)同的作用。

7 結(jié)論

增齡、高收縮壓、低高密度脂蛋白膽固醇血癥等影響因素可能參與了糖尿病患者下肢動脈中膜鈣化發(fā)生以及鈣化嚴重程度向重度中膜鈣化發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病下肢動脈中膜鈣化影響因素提醒臨床上可予以相應(yīng)的防治措施，然其中的作用機制尚不明確，有待完善前瞻性及動物、細胞學實驗研究后進一步明確。糖尿病下肢動脈內(nèi)膜鈣化與中膜鈣化發(fā)生發(fā)展的具體關(guān)系及兩者對糖尿病下肢動脈病變、糖尿病足病情發(fā)展、預(yù)后的影響有待進一步前瞻性研究。