PCR熔解曲線法在結(jié)核分枝桿菌耐藥性測(cè)定的臨床價(jià)值

李春燕 傅紅梅 李嫣紅 譚毅剛 劉 欣

世界衛(wèi)生組織在1992年將同時(shí)耐異煙肼和利福平的結(jié)核病定義為耐多藥結(jié)核病，耐多藥結(jié)核病存在治療周期長(zhǎng)、高治療成本和低治愈率等問題[1]。快速地對(duì)分枝桿菌異煙肼及利福平耐藥性測(cè)定，對(duì)治療方案的制定和結(jié)核病流行非常重要的意義。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，開發(fā)出了多種快速、客觀、準(zhǔn)確的耐藥基因檢測(cè)新診斷方法，如線性探針技術(shù)、基因芯片技術(shù)及探針熔解曲線技術(shù)等[2]。

近年來已有一些實(shí)驗(yàn)室的研究分析熔解曲線技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的測(cè)定。本文從臨床應(yīng)用角度觀察，對(duì)PCR熔解曲線法結(jié)果總結(jié)，以培養(yǎng)法藥敏試驗(yàn)作為金標(biāo)準(zhǔn)，分析熔解曲線法檢測(cè)利福平、異煙肼耐藥性的敏感度和特異度,探討其在耐藥結(jié)核病的診斷意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

納入廣州市胸科醫(yī)院2016年6月-2016年11月住院期間痰涂片找到分枝桿菌的200例患者，其中男149例，女51例，年齡16～85歲，其中初治患者147例，復(fù)治患者53例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的收集 對(duì)以上200例患者痰涂片抗酸染色陽性的痰標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)，使用BACTECTMMGIT960TM全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀。痰標(biāo)本分離培養(yǎng)按照中國防癆協(xié)會(huì)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[3]進(jìn)行。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 對(duì)分離培養(yǎng)出的菌株進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的菌種鑒定并進(jìn)行異煙肼、利福平等藥敏實(shí)驗(yàn)，操作均按照中國防癆協(xié)會(huì)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。

1.2.3 PCR熔解曲線法檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥性 按照PCR熔解曲線法結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測(cè)試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)和異煙肼耐藥突變檢測(cè)試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)說明書操作。簡(jiǎn)述如下：①配制PCR反應(yīng)液。PCR反應(yīng)液配液標(biāo)準(zhǔn)：取n×19.6 μl INH或RIF PCR Mix A和n×0.4 μl TB酶混合液加入到1.5 ml離心管中，振蕩混勻，3 000 g離心數(shù)秒；另取n×19.6 μl INH或RIF PCR Mix B和n×0.4 μl TB酶混合液加入到1.5 ml離心管中，振蕩混勻，3 000 g離心數(shù)秒。②樣品提取及加樣。液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的結(jié)核分枝桿菌取1 ml，10 000 g離心15 min，丟棄上清液并在250 μl TBDNA提取液中重懸細(xì)菌；封口膜封口，99℃加熱20 min，14 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清到新的1.5 ml離心管，上清為PCR擴(kuò)增模版；用微量加液器向每支PCR薄壁反應(yīng)管中加入相應(yīng)提取樣品或陰/陽性對(duì)照品5 μl；將加入模版的PCR薄壁反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至PCR擴(kuò)增區(qū)，放入PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熔解分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 熔解曲線法以培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算靈敏度和特異度，見表1。

表1 熔解曲線法和培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)比較

注：靈敏度=A/(A+C)×100% 特異度=D/(B+D)×100% 一致性=(A+D)/(A+B+C+D)×100%

使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS19.0版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P<0.05為檢驗(yàn)水平，對(duì)熔解曲線法和培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼的耐藥性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)及培養(yǎng)菌鑒定結(jié)果

見表2。

表2 核酸檢測(cè)及培養(yǎng)菌鑒定結(jié)果 (n)

2.2 分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)的結(jié)果

PCR熔解曲線法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌核酸陽性的病例共175例，其中初治患者134例，復(fù)治患者41例。

2.2.1 初治134例患者中，痰培養(yǎng)有結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的有106例，此106例納入一致性分析(見表3、表4)。

初治患者中痰培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)提示利福平、異煙肼均耐藥(MDR)的共有7例，其中熔解曲線法檢測(cè)利福平、異煙肼均耐藥的6例，1例為利福平耐藥而異煙肼敏感。

2.2.2 復(fù)治41例患者中，痰培養(yǎng)有結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的有36例，此時(shí)36例納入一致性分析(見表5、表6)。

表3 初治患者耐藥性測(cè)定 (n)

注：R表示耐藥S表示敏感

表4 初治患者熔解曲線法檢測(cè)耐藥的靈敏度,特異度,陽性預(yù)測(cè)值,陰性預(yù)測(cè)值 (%)

注：1)表示P值< 0.001

表5 復(fù)治患者耐藥性測(cè)定 (n)

注：R表示耐藥S表示敏感

表6 復(fù)治患者熔解曲線法檢測(cè)耐藥的靈敏度,特異度,陽性預(yù)測(cè)值,陰性預(yù)測(cè)值 (%)

注：1)表示P值< 0.001

復(fù)治患者中痰培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)示利福平、異煙肼均耐藥(MDR)的有15例，其中6例PCR熔解曲線法檢測(cè)出利福平、異煙肼均耐藥， 6例PCR熔解曲線法檢測(cè)利福平耐藥異煙肼敏感，3例PCR熔解曲線法檢測(cè)利福平及異煙肼均敏感。

3 討論

結(jié)核分枝桿菌耐藥性呈逐年上升趨勢(shì), 異煙肼和利福平作為主要抗結(jié)核一線藥物, 其耐藥性檢測(cè)對(duì)于臨床結(jié)核病藥物治療具有重要意義。根據(jù)本文臨床觀察分析，在初治患者中，PCR溶解曲線法與培養(yǎng)藥敏法相比，熔解曲線法在分枝桿菌檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥上具有很高的靈敏性和特異性，檢測(cè)異煙肼、利福平耐藥性的結(jié)果高度一致，PCR熔解曲線法可應(yīng)用于臨床利福平和異煙肼耐藥的快速檢測(cè)和篩查[4]。在復(fù)治菌陽患者中， PCR熔解曲線法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥情況與培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)也高度一致，可應(yīng)用于臨床利福平耐藥的快速檢測(cè)和篩查。同時(shí)結(jié)果顯示在初治患者中熔解曲線法檢測(cè)出利福平耐藥的共有8例，其中7例培養(yǎng)藥敏為MDR，復(fù)治患者中熔解曲線法檢測(cè)出利福平耐藥的有15例，其中12例培養(yǎng)藥敏為MDR。PCR熔解曲線法檢測(cè)出利福平耐藥，不排除耐多藥可能，建議根據(jù)病情及時(shí)調(diào)整抗結(jié)核方案，盡早按耐多藥結(jié)核方案治療。

但是復(fù)治患者PCR熔解曲線技術(shù)檢測(cè)異煙肼耐藥性與培養(yǎng)藥敏法相比，熔解曲線法檢測(cè)檢測(cè)出異煙肼耐藥性的靈敏度只有35%，一致率只有55.56%?？紤]可能原因：①復(fù)治的肺結(jié)核患者經(jīng)反復(fù)使用含異煙肼方案抗結(jié)核治療，治療過程中藥物選擇壓的作用下產(chǎn)生突變，出現(xiàn)一些核酸序列改變，有些核酸序列改變并不引起氨基酸改變；而熔解曲線法只是篩查核酸序列而不是氨基酸序列，有些不引起氨基酸改變的突變也會(huì)被判斷為突變型，故報(bào)告為突變的結(jié)果并不絕對(duì)表示耐藥。②結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼的耐藥機(jī)制尚未完全明確，耐藥突變所涉及的基因、位點(diǎn)、突變類型繁多，復(fù)治患者在治療過程中出現(xiàn)的耐藥突變更復(fù)雜，熔解曲線法僅檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌由ahpC啟動(dòng)子區(qū)(-44～-30以及-15～3位點(diǎn))、inhA94密碼子、inhA啟動(dòng)子區(qū)(-17～-8)位點(diǎn)和katG315密碼子突變引起的耐藥，由其他基因或者基因區(qū)引起的突變以及其他異煙肼耐藥機(jī)制引起的耐藥不能檢測(cè)。探針未完全包含耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌的基因突變區(qū)，為提高檢測(cè)靈敏度還需覆蓋更多基因突變區(qū)[5]。③本組復(fù)治患者的樣本量較小，也是造成結(jié)果差異的原因，需要擴(kuò)大標(biāo)本量研究。根據(jù)結(jié)果對(duì)PCR熔解曲線檢測(cè)耐異煙肼的復(fù)治患者，仍有異煙肼敏感可能，而熔解曲線檢測(cè)異煙肼敏感的復(fù)治患者，也可能是耐藥。故對(duì)于復(fù)治患者，檢測(cè)到單純異煙肼耐藥，需結(jié)合臨床療效再判斷；合并利福平耐藥，考慮MDR，盡早予耐多藥方案治療。

本組中有部分痰培養(yǎng)陰性，考慮因?qū)嶒?yàn)室因素對(duì)細(xì)菌的損傷及細(xì)菌自身活性因素等多方面影響，痰培養(yǎng)可出現(xiàn)痰涂片陽性培養(yǎng)陰性(SPCN現(xiàn)象)[6]。部分培養(yǎng)陽性卻沒有藥敏結(jié)果，考慮由于含雜菌或菌量較少不適宜藥敏。PCR熔解曲線分析檢測(cè)的是核酸序列，細(xì)菌的損傷及活性下降對(duì)結(jié)果影響較少，故探針熔解曲線分析更能準(zhǔn)確的檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)十分緩慢，培養(yǎng)藥敏法需要較長(zhǎng)時(shí)間才能獲取藥敏結(jié)果，常常造成MDR-TB 的傳播和患者治療的延遲[5]。而PCR熔解曲線分析技術(shù)檢測(cè)能快速檢測(cè)出結(jié)果，可在患者出院前提供了耐藥檢測(cè)的結(jié)果。與培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)相比, PCR熔解曲線檢測(cè)技術(shù)在應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥的快速檢測(cè)時(shí)有較高的陽性檢出能力, 同時(shí)更加簡(jiǎn)便、快速[7]。

綜上所述，與培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)相比，PCR熔解曲線法檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快速，準(zhǔn)確性高，可用于初治患者利福平、異煙肼耐藥性的快速檢測(cè)和復(fù)治患者利福平耐藥性的快速檢測(cè)，并可用于MDR-TB快速篩查，可指導(dǎo)臨床用藥；但對(duì)復(fù)治患者異煙肼耐藥檢測(cè)靈敏度不夠，為提高檢測(cè)靈敏度還需覆蓋更多基因突變區(qū)。