非洲豬瘟病毒CRISPR/Cas9敲除技術(shù)研究進(jìn)展

任 名，郭曉宇，鄔 靜，李金祥，朱鴻飛，陳鴻軍

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長沙410128；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

非洲豬瘟（african swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種急性、烈性、高度接觸性的傳染病，發(fā)病率高，死亡率可高達(dá)100%，一經(jīng)確診必須全部撲殺。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Office international des é pizooties，OIE）將ASF列為必須報(bào)告動(dòng)物疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病，是重點(diǎn)防控的外來病。2018年8月3日，中國遼寧省沈陽市確診中國首例非洲豬瘟疫情，疫點(diǎn)內(nèi)913頭生豬已經(jīng)全部撲殺和無害化，消毒工作全面展開[1]。雖然國內(nèi)在此之前無非洲豬瘟疫病例報(bào)告，但相關(guān)防控以及疫苗研制工作一直在推進(jìn)。研究人員在免疫佐劑、弱毒疫苗、DNA疫苗和亞單位疫苗（P72、P30、P54、P12）方面已進(jìn)行了大量的工作[2]，但遺憾的是，臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示這些疫苗均不能提供良好的保護(hù)效率。近期研究發(fā)現(xiàn)通過建立非洲豬瘟病毒CRISPR/Cas9基因敲除操作技術(shù)平臺(tái)，將為非洲豬瘟病毒基因功能研究和毒力基因缺失的新型弱毒疫苗研究提供便捷的工具。

1 傳統(tǒng)ASFV疫苗研究進(jìn)展

目前國內(nèi)外已經(jīng)研制出了ASFV滅活疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗、同源重組弱毒疫苗以及其他新型疫苗，但這幾種疫苗都存在不同程度的局限性[3]。

1.1 滅活疫苗 滅活疫苗是最經(jīng)典最早期的疫苗研制方式。非洲豬瘟病毒剛被發(fā)現(xiàn)時(shí)，研究人員就已開始研制滅活疫苗。然而，至今為止，使用或不使用佐劑都不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效保護(hù)性反應(yīng)，經(jīng)加熱、復(fù)方碘溶液、甲苯、福爾馬林、結(jié)晶紫、β-丙內(nèi)酯、乙酰氮丙啶和縮水甘油醛處理的ASFV滅活疫苗雖部分能刺激豬產(chǎn)生抗體，但即使借助佐劑仍無法抵御ASFV的攻擊[3]。

1.2 亞單位疫苗 亞單位疫苗的研究策略主要是將具有中和表位的ASFV保護(hù)性抗原基因在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)，然后將產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽遞呈給抗原遞呈細(xì)胞，以誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗ASFV中和抗體。ASFV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白有很多?；謴?fù)期豬血清抗體檢測顯示P72、P30和P54為感染過程中引起體液免疫應(yīng)答最重要的3個(gè)抗原蛋白[4-9]。針對(duì)P72和P54的抗體可以阻止病毒吸附，針對(duì)P30的抗體可以阻止病毒內(nèi)吞[7]。但目前研究結(jié)果顯示，將這3個(gè)蛋白質(zhì)作為ASF亞單位疫苗僅可提供部分保護(hù)或沒有保護(hù)[10,11]。

1.3 DNA疫苗 DNA疫苗又稱核酸疫苗。作為新一代的疫苗研制方向，ASFV的相關(guān)研究工作也已經(jīng)在開展。Argilaguet等[12]利用真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-PQ表達(dá)P30和P54，結(jié)果顯示，該DNA疫苗免疫豬后無法抵御強(qiáng)毒株的攻擊。隨后，該實(shí)驗(yàn)室又進(jìn)一步將ASFV血凝素蛋白基因和泛素基因（ubiquitin）連入上述DNA疫苗中，結(jié)果仍不能達(dá)到完全保護(hù)的功效[13]。

1.4 同源重組弱毒疫苗 弱毒疫苗通常能賦予機(jī)體針對(duì)同源病毒的相對(duì)保護(hù)力，但針對(duì)異源病毒的保護(hù)力弱甚至沒有保護(hù)力，同時(shí)弱毒疫苗還存在造成潛伏感染和毒力返強(qiáng)的可能性。對(duì)于弱毒疫苗的研制，同源重組一直是ASFV基因缺失的主導(dǎo)技術(shù)。但該方法的同源效率非常低，且需要經(jīng)過多輪純化才能去除野生型病毒。目前科學(xué)家們已利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了多種基因敲除的ASFV，具體研究進(jìn)展見文獻(xiàn)[14]，在此不再贅述。重組致弱疫苗不僅可以提供良好的免疫保護(hù)，而且由于復(fù)制缺陷的特點(diǎn)，將顯著降低疫苗毒株返強(qiáng)可能性和毒副作用。然而，由于大部分單一基因缺失毒株的毒力仍難以穩(wěn)定致弱，這類疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段，至今很難應(yīng)用于臨床免疫防控[15]。

1.5 細(xì)菌染色體組技術(shù)（bacterial artificial chromosome，BAC） 由于ASFV的病毒DNA兩端存在可變區(qū)，基因組DNA末端交叉連接成環(huán)形，病毒粒子含依賴于DNA的RNA多聚酶，而該聚合酶的亞基種類至今尚未全面了解[16]，因此，至今難以在該病毒中使用細(xì)菌染色體組技術(shù)。

2 CRISPR/Cas9敲除技術(shù)在ASFV疫苗研究中的應(yīng)用

2.1 CRISPR/Cas9敲除技術(shù) CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats），被稱為規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)，是一種來自細(xì)菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機(jī)制。在細(xì)菌及古細(xì)菌中，CRISPR系統(tǒng)共分成3類，其中Ⅰ類和Ⅲ類需要多種CRISPR相關(guān)蛋白（Cas蛋白）共同發(fā)揮作用，而Ⅱ類系統(tǒng)只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應(yīng)用提供了便利條件。目前，來自化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。Cas9蛋白含有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結(jié)合成復(fù)合物，然后通過前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motifs, PAM）結(jié)合并侵入DNA，形成RNA-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對(duì)目的DNA雙鏈進(jìn)行切割，使DNA雙鏈斷裂。由于PAM序列結(jié)構(gòu)簡單（5'-NGG-3'），幾乎可以在所有基因中找到大量靶點(diǎn)。迄今為止，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已廣泛用于動(dòng)、植物和微生物的基因組改造?？蒲腥藛T已經(jīng)使用CRISPR系統(tǒng)編輯了多種病毒，例如I型單純皰疹病毒[17]，Epstein-Barr病毒[18]，偽狂犬病毒[19]和牛痘病毒[20]等。2018年，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已開始用于非洲豬瘟病毒的基因組改造，且敲除效率得到顯著提升[22]。

2.2 CRISPR可以高效構(gòu)建重組ASFV并易于重組病毒的純化 ASFV對(duì)穩(wěn)定細(xì)胞系適應(yīng)后，會(huì)引起病毒基因組的大部分區(qū)域自發(fā)缺失，導(dǎo)致病毒毒力嚴(yán)重致弱，喪失對(duì)同源親本毒株攻擊的保護(hù)能力。因此，為了保持病毒基因組的穩(wěn)定性，必須在豬巨噬細(xì)胞的原代細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生重組ASFV。重組ASFV的構(gòu)建通常依靠通過靶向基因的兩側(cè)向ASFV導(dǎo)入含有同源重組臂的質(zhì)粒，并用質(zhì)粒中的報(bào)告基因取代靶向基因。這種同源重組方法，尤其是在豬巨噬細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行的同源重組方案，重組效率非常低，野生病毒背景高，難以純化重組ASFV，需要進(jìn)行多輪空斑純化或有限稀釋[21,22]。

2018年，Borca等[23]CRISPR/Cas9誘導(dǎo)Cas9雙鏈斷裂ASFV基因組中8-DR的開放閱讀框（open reading flame，ORF），在豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophages，PAM）中從Georgia07毒株的基因組中刪除非必需基因8-DR，并用紅色熒光蛋白（red fluorecent protein，RFP）基因替代[24]。敲入質(zhì)粒中包含左臂8-DR ORF上游區(qū)域（72 169 bp～73 369 bp）和右臂8-DR ORF的下游區(qū)域（74 454 bp～75 653 bp），插入片段為RFP和Blasticidin基因（圖1）。設(shè)計(jì)相關(guān)gRNAs，克隆入pCAS-Guide載體（來自Blue Heron Biotech公司）中。隨后，在感染野生病毒的PAM細(xì)胞中，將兩種8DR靶向gRNAs載體與敲入載體共轉(zhuǎn)染，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)后，在轉(zhuǎn)染后24 h，檢測到約4log10TCID50的重組ASFV。與傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)相比，通過CRISPR/Cas9獲得的重組病毒低于滴定檢測限（＜0.5Log10TCID50），但通過細(xì)胞盲傳，可以檢測到熒光表達(dá)，獲得重組病毒。結(jié)果表明該方法有效構(gòu)建了ASFV重組病毒，通過對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用CRISPR/Cas9相對(duì)于同源重組方法，能夠顯著提升重組效率，并易于重組病毒的純化。因此，使用CRISPR技術(shù)編輯ASFV基因組已經(jīng)成為可能[23]。

采用有限稀釋法對(duì)CRISPR/Cas9敲除的ASFV Georgia病毒進(jìn)行純化，利用感染后熒光細(xì)胞來監(jiān)測純化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)明顯增加重組病毒重組效率，比使用傳統(tǒng)同源重組方法的純化過程更容易，僅經(jīng)過5次有限稀釋，即可獲得純化子，這比使用傳統(tǒng)的同源重組方法純化ASFV所需的時(shí)間縮短很多[24-26]。

圖1 ASFV重組位點(diǎn)設(shè)計(jì)Fig. 1 ASFV recombination site design

2.3 pX330-ΔNLS1/ 2neoR載體構(gòu)建以及穩(wěn)定表達(dá)gRNA野豬肺細(xì)胞系建立

2.3.1 pX330-ΔNLS1/ 2neoR載體構(gòu)建 為了鑒定和克隆ASFV基因組中合適的CRISPR/Cas9靶序列，需要構(gòu)建合適的載體。有研究人員使用載體質(zhì)粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas920[27]。該載體質(zhì)粒最初被設(shè)計(jì)用于編輯哺乳動(dòng)物基因組，在Cas9 ORF的兩端編碼核定位信號(hào)（nuclear localization signal, NLS）。由于ASFV主要在受感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，因此需去除Cas9的NLS[28]。在去除兩端NLS之后，插入新霉素抗性基因，從而構(gòu)建獲得pX330-ΔNLS1/2neoR載體。NLS-less Cas9載體已被成功應(yīng)用于痘苗病毒的定向突變[29]。

2.3.2 穩(wěn)定表達(dá)gRNA的野豬肺細(xì)胞系（wild boar lung cell line, WSL）建立 靶向P72和核酸酶的gRNA序列插入至pX330-ΔNLS1/2neoR載體中，將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染野豬肺細(xì)胞系（WSL），新霉素抗性篩選細(xì)胞，通過Western blot、PCR和基因組DNA測序檢測Cas9表達(dá)。結(jié)果表明，特異性gRNA在多次（＞50）傳代中穩(wěn)定表達(dá)，且未發(fā)生Cas9核酸酶的脫靶反應(yīng)[30]。在WSL中，ASFV復(fù)制明顯受到抑制。CRISPR/Cas9系統(tǒng)還有助于從病毒基因組中特異性地刪除CP204L（P30）和其他必需的或非必需的ASFV基因。必需基因敲除時(shí)，為了避免病毒不能復(fù)制，可以通過共轉(zhuǎn)染基因表達(dá)質(zhì)粒的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)來彌補(bǔ)。該策略不僅有助于闡明病毒基因功能，也適合作為減毒或單循環(huán)活疫苗。

3 展望

隨著首例非洲豬瘟在國內(nèi)發(fā)生，養(yǎng)豬業(yè)將受到巨大的威脅，非洲豬瘟的基礎(chǔ)致病性研究和儲(chǔ)備性疫苗的研究工作已經(jīng)迫在眉睫。而CRISPR也許就是打開ASFV疫苗研制這扇門的一把鑰匙，CRISPR技術(shù)的應(yīng)用為非洲豬瘟病毒的基礎(chǔ)致病性研究帶來了曙光，也為研制非洲豬瘟基因缺失活疫苗提供了新的研究思路，更多ASFV基因的敲除研究工作正在進(jìn)行之中。