抗瘧先導(dǎo)物MMV007978對(duì)擬南芥的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系

宣 靜 編譯

(上海市農(nóng)藥研究所，上海 200032)

雜草與栽培植物競(jìng)爭(zhēng)資源，大大地降低了作物的生產(chǎn)率，持續(xù)威脅著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)主要以除草劑防治雜草，顯著增加作物產(chǎn)量。然而雜草對(duì)除草劑產(chǎn)生抗性，在許多情況下對(duì)多種作用機(jī)制的除草劑發(fā)展了抗性，使得雜草的防除成為重大挑戰(zhàn)，特別是在幾十年來沒有新作用機(jī)制除草劑上市的情況下。在1957-2016年共有479個(gè)抗性雜草案例被報(bào)道，同時(shí)對(duì)2種或2種以上除草劑產(chǎn)生抗性的雜草數(shù)量極大的增加(www.weedscience.org)。據(jù)估全球70億人口每年仍在不斷增加，預(yù)期在2050年達(dá)到92億，需求的食物將增加70%。氣候的變化對(duì)全球的影響和不斷增長(zhǎng)的人口對(duì)可耕地競(jìng)爭(zhēng)將都會(huì)對(duì)糧食生產(chǎn)造成挑戰(zhàn)。

與瘧疾有關(guān)的寄生性瘧原蟲和植物有共同的進(jìn)化關(guān)系。它們過去進(jìn)化特點(diǎn)為瘧原蟲和其他頂復(fù)合器門寄生蟲體內(nèi)保留了退化的、類植物非光合質(zhì)體的質(zhì)體樣細(xì)胞器，定名為apicoplast。有趣的是，植物和瘧原蟲間的這種關(guān)系進(jìn)一步得到了可作為抗瘧疾化合物的商業(yè)化除草劑的強(qiáng)調(diào)，這表明這兩個(gè)生物具有相似的生物靶標(biāo)。最近，筆者研究表明許多抗瘧疾藥以模式植物擬南芥為防治對(duì)象試驗(yàn)時(shí)為有效除草活性化合物。

Medicines for Malaria Venture(MMV)提供了豐富的抗瘧疾先導(dǎo)化合物資源，想法設(shè)法促進(jìn)經(jīng)濟(jì)有效抗瘧疾藥物的研究和開發(fā)(www.mmv.org)。此組織提供了類藥性和類探針化合物(probe-like compound)庫，被名命為“Malaria Box”，其中的化合物對(duì)紅內(nèi)期惡性瘧原蟲(P. falciparum)有活性。這些化合物是簡(jiǎn)單的、結(jié)構(gòu)多樣分子，缺少一般毒性，具有好的理化特性。以前筆者研究表明Malaria Box中的一些先導(dǎo)化合物也具有除草活性，其中MMV006188在土壤和溫室研究中有活性，是除草活性和新作用機(jī)制開發(fā)的新化學(xué)骨架。因此，筆者對(duì)Malaria Box中其他物質(zhì)進(jìn)行了開發(fā)，評(píng)估其除草活性。如果得到有用的苗頭化合物(hit)，這些物質(zhì)會(huì)被進(jìn)行一系列的結(jié)構(gòu)修飾；化合物也用于生理試驗(yàn)以研究作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 用瓊脂板預(yù)選有除草活性的MMV化合物

用70%乙醇對(duì)擬南芥生態(tài)型Col-0種子表面消毒3 min，然后用100% 乙醇消毒1 min，浸入無菌水中3 min。消毒后把種子再懸浮于0.1%無菌瓊脂中，置于黑暗、4℃條件下3 d，打破種子的休眠，同時(shí)發(fā)芽。在冷的條件下種子層積催芽后，種植于96孔板中，每孔中有250 μL培養(yǎng)基[1%葡萄糖、2%瓊脂、0.45% Murashige & Skoog鹽和維生素、0.3% 2-(N-嗎啉基)-乙磺酸(MES)(體積比)，pH 5.7]、適宜濃度除草劑、MMV化合物(都溶解于二甲亞砜，DMSO)。所有化合物的測(cè)試濃度80 μM。為了避免污染，用有孔膠帶密封96孔板。在16 h光/8 h暗，60%相對(duì)濕度(RH)，22 ℃培養(yǎng)室種子發(fā)芽一周，然后拍照。以肉眼評(píng)估化合物的除草活性。

1.2 化合物處理種植于土壤中的擬南芥

把約30顆擬南芥Col-0種子種植于裝有育苗基質(zhì)和愛爾蘭泥炭(Bord na Mona Horticulture Ltd,Newbridge，Ireland)的盆(63×63×59 mm)中。在種植前預(yù)濕土壤到飽和，在試驗(yàn)過程中澆水保持充足的濕度。土壤中不添加肥料。在無光、4 ℃條件下冷處理種子3 d，發(fā)芽，然后在16 h光/8 h暗，60%相對(duì)濕度(RH)，22 ℃培養(yǎng)室培養(yǎng)。把商業(yè)化除草劑和類似物化合物溶解于DMSO，配制成20 mg/mL溶液，在處理前用水稀釋。在最終濃度為200 μL/L的溶液中加表面活性劑 Brushwet (SST Dandenong,Australia)。以下商業(yè)化除草劑活性成分為陽性對(duì)照：氟樂靈、氨磺樂靈、麥草畏和烯草酮；溶劑DMSO為陰性對(duì)照，因?yàn)镈MSO被用于制備所有儲(chǔ)備溶液。用吸液管分別吸取每個(gè)化合物的500μL 0、25、50、100、200或400 mg/L處理溶液處理種子(芽前)或種苗(芽后)；以上用量分別對(duì)應(yīng)于劑量約有效成分35、70、140、280和560 g/hm2。盆中土壤(干燥土壤)密度約為0.29 g/cm3，芽前處理土壤中除草劑溶液的量為10 μL/g土壤，芽后處理為20 μL/g，因?yàn)樵谘壳笆┯靡淮?0.5 mL)，芽后施用2次(1.0 mL)。托盤移入培養(yǎng)室的第1 d被作為0 d，這個(gè)時(shí)間只進(jìn)行芽前處理。在第3 d和第6 d芽后處理2次，一直培養(yǎng)16 d，然后拍照。用肉眼首先評(píng)估每個(gè)化合物的除草活性，對(duì)有很好除草活性的化合物，用3個(gè)濃度重復(fù)3次進(jìn)行試驗(yàn)。用綠葉表面積法確定生長(zhǎng)抑制活性。

1.3 MMV007978衍生物

所有 MMV007978衍生物從商業(yè)賣主購買(Ambinter，Orleans; France 或 AKos，Steinen,德國(guó))，溶解于DMSO配制成20 mg/mL溶液，用于盆栽試驗(yàn)或溫室和生理研究。

1.4 溫室研究

溫室研究在德國(guó)標(biāo)準(zhǔn)溫室中進(jìn)行。培養(yǎng)容器為塑料花盆，裝有含有3%的腐殖質(zhì)的壤砂土。對(duì)于芽后處理，不同的試驗(yàn)植物首先分別育苗，在處理前幾天把苗移栽到試驗(yàn)容器中。對(duì)于禾本科植物，每盆種 10～20株，但對(duì)于較大的闊葉品種[反枝莧(Amaranthus retroflexus)、苘麻(Abutilon theophrasti)]，每盆1株。根據(jù)植物習(xí)性，當(dāng)植物長(zhǎng)到3～10 cm時(shí)，用化合物處理?；衔镏刑砑?.6 mL環(huán)己酮+Wettol EM31(體積4∶1)乳化，用去離子水和2%表面活性劑(Dash HC，BASF SE, Ludwigshafen, Germany)稀釋到相應(yīng)噴霧量，用超聲噴嘴噴霧器給植物噴霧。劑量對(duì)應(yīng)于2、1、0.5 kg/hm2，應(yīng)用量為750 L/hm2。在15～22 ℃培養(yǎng)21 d。用肉眼評(píng)估植物的癥狀，并與對(duì)照對(duì)比。

1.5 生理測(cè)試

用已報(bào)道的方法進(jìn)行生理學(xué)研究。以葉綠素?zé)晒鉃楣夂匣钚缘闹甘疚?，在化合物處理?和24 h用 Imaging-PAM-M-Series 調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)測(cè)量。

2 結(jié)果和討論

2.1 Malaria Box 化合物對(duì)96孔板中擬南芥種子作用和苗頭化合物對(duì)土壤中種子或苗影響的分析

首先，筆者研究了Malaria Box中80個(gè)化合物以80 μM對(duì)瓊脂中擬南芥種子發(fā)芽影響的篩選。在測(cè)試的這些化合物中 9個(gè)具有除草活性(圖 1A)。9個(gè)苗頭化合物的表型影響為延緩苗的發(fā)育(B、D、G和 I)、胚根出現(xiàn)后生長(zhǎng)受抑制(A和 C)、褪綠/白化苗(E和 H)、萌發(fā)受抑制(F)。用聚類分析法比較了334個(gè)商業(yè)化除草劑與9個(gè)被選苗頭化合物的2個(gè)理化特性(例如Log P、Log S、摩爾質(zhì)量)(圖1B)。也直接比較它們的理化特性與除草劑的平均情況。

所有的苗頭化合物的特性與商業(yè)除草劑的一致。由于苗頭化合物 A、E和 H商業(yè)購買不到，F(xiàn)(MMV000972)缺少適于修飾的結(jié)構(gòu)，只有B、C、D、G和I被進(jìn)一步研究了對(duì)土壤種植擬南芥的活性(圖 1C)。研究了這些被選的苗頭化物芽前(種子)和芽后(苗)在0～400 mg/L濃度對(duì)擬南芥的除草活性。有趣的為當(dāng)應(yīng)用于土壤后只有苗頭化合物G有除草活性。土壤和瓊脂試驗(yàn)間發(fā)現(xiàn)的差異與以前的研究結(jié)果相一致，這是由于植物沒有能力從土壤中吸收化合物或降解物。

2.2 對(duì)MMV007978骨架的評(píng)估

為了以有效的方式評(píng)估苗頭化合物 G(MMV007978，圖1D)結(jié)構(gòu)的哪部分決定其除草活性的大小，筆者購買了類似物，保留了類似物的二乙氧基苯基核心結(jié)構(gòu)，但對(duì)噻吩基進(jìn)行了修飾。對(duì)得到的所有類似物進(jìn)行了首次分析以確保其保持商業(yè)除草劑相似的理化特性。測(cè)定了MMV007978的22個(gè)衍生物對(duì)土壤種植的擬南芥芽前和芽后活性，以MMV007978、DMSO和8個(gè)商業(yè)化除草劑為對(duì)照(圖2)。與預(yù)期一樣，8個(gè)商業(yè)化除草劑以不同劑量對(duì)擬南芥有除草活性。22個(gè)類似物中，化合物3、6、9、10、15、19和 22在視覺上的除草癥狀相似于MMV007978。對(duì)這些化合物和MMV007978又重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)，測(cè)定了它們對(duì)擬南芥生長(zhǎng)的抑制作用，確定這些化合物與其母體化合物的除草活性大小。如果母體分子和其所有衍生物(圖2)沒有芽前活性或芽前活性低，進(jìn)一步測(cè)試被選類似物的芽后活性，試驗(yàn)濃度100、200和400 mg/L (圖3)。與預(yù)期的一樣，所有類似物都具有抑制作用，濃度為200 mg/L時(shí)抑制率為37.5%～90.3%，濃度為400 mg/L時(shí)抑制率為69.3%～94.3%(圖3A)。濃度為100 mg/L時(shí)，化合物9、10、19和22比MMV007978顯著有效，最高濃度時(shí)，被選類似物的活性沒有 MMV007978的活性高(圖3B)。

反之，如化合物1、2和8等具有較小的基本結(jié)構(gòu)單元或12、13、14和21具有較大的基本結(jié)構(gòu)單元，它們沒有活性。環(huán)有5個(gè)或6個(gè)原子時(shí)對(duì)活性重要，總的來說因?yàn)榫哂羞@樣大小的基本結(jié)構(gòu)的化合物有活性。有意思的是，環(huán)中雜原子的數(shù)量增加化合物的活性會(huì)減弱，如化合物 16和 17，雜原子換為電負(fù)性氮原子也會(huì)使化合物活性下降。

2.3 對(duì)抑制作物田雜草的活性

為了進(jìn)一步探究MMV007978的活性，評(píng)估了其對(duì)6種作物田雜草的活性，這些雜草有雙子葉和單子葉雜草(圖 4A)。MMV007978在低劑量對(duì)反枝莧(Amaranthus retroflexus)和狗尾草(Setaria viridis)有強(qiáng)的抑制活性，較高濃度對(duì)稗草的生長(zhǎng)有強(qiáng)的抑制活性。對(duì)其他雜草只有最高濃度才有影響。

2.4 生理作用

用生理生測(cè)法研究了MMV007978的作用，以確定此化合物的作用機(jī)制(圖 4B)。MMV007978對(duì)非自養(yǎng)粟豬殃殃(Galium mollugo)的細(xì)胞分裂生長(zhǎng)有輕微影響，濃度為100 μM時(shí)抑制率為30%，此濃度時(shí)對(duì)光氧的單細(xì)胞綠藻(Scenedesmus obliquus)和稀脈浮萍(Lemna paucicostata)的生長(zhǎng)有大的影響，10 μM時(shí)只有輕微影響。葉片綠色加深表明此化合物不直接影響光合作用。化合物對(duì)分離的白芥子(Sinapis alba)嫩芽幾乎沒有作用。Lepidum sativum在無光下發(fā)芽和在光下生長(zhǎng)受到 60%的抑制(化合物濃度100 μM)，化合物對(duì)根的發(fā)育有明顯的作用?；衔餄舛葹?00和10 μM時(shí)對(duì)離體光系統(tǒng)II的光合電子運(yùn)輸(Hill reaction)有 45%的抑制作用。MMV007978對(duì)Lepidum sativum胚軸中表皮功能、鵝草(G. aparine)中二氧化碳同化作用、粟豬殃殃細(xì)胞懸浮液的呼吸、稀脈浮萍葉中葉綠素?zé)晒狻⑾∶}浮萍根中活性氧(ROS)的產(chǎn)生或浮萍根中線粒體功能沒有影響。

圖1 從Malaria Box確定的苗頭化合物MMV007978

圖2 對(duì)MMV007978的結(jié)構(gòu)-活性分析

圖3 MMV007978和有除草活性類似物芽后應(yīng)用對(duì)擬南芥生長(zhǎng)的影響

這些結(jié)果表明MMV007978對(duì)細(xì)胞分裂有直接抑制作用，因此抑制萌發(fā)過程。對(duì)希爾反應(yīng)的作用好像只發(fā)生于離體系統(tǒng)，但如葉綠素?zé)晒馍鷾y(cè)結(jié)果一樣不直接抑制活體光合作用。比較 MMV007978和已知的商業(yè)化除草劑的作用發(fā)現(xiàn)它們之間沒有直接的相似性。僅有的相似情況為氯苯胺靈和MMV007978對(duì)異養(yǎng)細(xì)胞和在萌發(fā)測(cè)試中有相似的作用，以及如對(duì)葉綠素?zé)晒饣钚杂袕?qiáng)的影響所表明抑制活體光合作用。MMV007978的作用機(jī)制為與細(xì)胞骨架相互作用，也抑制光合作用。以前的研究表明MMV007978對(duì)許多動(dòng)物、真菌和微生物沒有毒性，但對(duì)多個(gè)發(fā)育階段的瘧原蟲、柏氏瘧原蟲動(dòng)合子和肺感染有抗瘧疾活性。最近對(duì)Malaria Box化合物代謝對(duì)瘧原蟲的影響研究表明MMV007978影響P-型ATP酶4(PfATP4, PF3D7_1211900)，此酶是一些spiroindolone的靶標(biāo)?，F(xiàn)在還缺少證據(jù)直接證實(shí) MMV007978是這種作用機(jī)制，但瘧原蟲中與PfATP4有30%～33%一致性的蛋白質(zhì)可用于直接研究MMV007978的作用機(jī)制?？偟膩碚f，MMV007978具有化學(xué)新穎性，作為除草劑具有獨(dú)特的生理作用，低毒，是可進(jìn)一步研究的有吸引力的物質(zhì)。

(A) 劑量(kg·hm－2) 苘麻 反枝莧 大穗看麥娘 野燕麥 稗草 狗尾草2.0 90 90 25 60 95 100 1.0 0 90 0 0 75 90 0.5 0 90 0 0 0 70

圖4 MMV007978的除草活性試驗(yàn)和生理作用

2.5 總結(jié)

食品安全是21世紀(jì)最緊迫問題之一，需要新除草劑，特別是新作用機(jī)制的除草劑。本文筆者研究表明抗瘧疾藥物候選物MMV007978也具有除草活性，證實(shí)了許多抗瘧疾藥物有除草活性的推測(cè)；對(duì)化合物活性重要的基本結(jié)構(gòu)單元對(duì)選擇的單和雙子葉雜草的除草活性重要，具有目前已知除草劑沒有的生理作用。按照設(shè)想此結(jié)構(gòu)骨架的開發(fā)將導(dǎo)致新除草劑的發(fā)現(xiàn)。

2019年起歐盟禁用農(nóng)藥320種

2019年1月1日起，歐盟將正式禁止含有化學(xué)活性物質(zhì)的320種農(nóng)藥在境內(nèi)銷售，其中涉及我國(guó)正在生產(chǎn)、使用及銷售的農(nóng)藥有62個(gè)品種(具體名單見http://www.chinapesticide.org.cn/hydt/11285.jhtml)。由于這些農(nóng)藥目前已廣泛應(yīng)用于水果、茶葉、蔬菜、谷物等生產(chǎn)中，因此使用這些農(nóng)藥的農(nóng)產(chǎn)品在出口歐盟時(shí)，就可能被退貨或銷毀。