超支化聚縮水甘油醚負(fù)載鹽酸阿霉素納米粒子的性能*

法孟梅，劉 旭，王藹廉，張遼云，姚 鑫

(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)化學(xué)科學(xué)學(xué)院， 北京 100049) (2017年2月14日收稿； 2017年4月21日收修改稿)

隨著醫(yī)藥業(yè)的發(fā)展，人們對(duì)藥物性能的要求也隨之提高。聚合物藥物載體在醫(yī)藥領(lǐng)域的地位正突飛猛進(jìn)地提升，對(duì)藥物載體的研究更是一項(xiàng)相當(dāng)重要的課題[1-3]。雙親性聚合物不僅具有良好的親水性，并且能通過(guò)疏水作用、靜電引力或共價(jià)鍵等作用力負(fù)載藥物，從而作為藥物載體引起廣泛關(guān)注[4-6]。但線性雙親聚合物如聚乙二醇由于結(jié)構(gòu)上的限制，負(fù)載率較低，并且在不同環(huán)境(如熱、氧化等)中膠束的穩(wěn)定性差[7-9]；又如樹狀大分子，雖結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，負(fù)載率更高，但合成步驟非常繁復(fù)，成本大大增加，并且不適用于腸胃外應(yīng)用[10-11]。這些都限制了其作為藥物載體的應(yīng)用。

超支化聚縮水甘油醚(HPG)作為藥物載體在結(jié)構(gòu)和性能上具有很大的優(yōu)勢(shì)[12-13]。HPG高度支化，具有三維球形結(jié)構(gòu)；有很好的生物相容性，體內(nèi)循環(huán)作用時(shí)間較長(zhǎng)，可被降解并排出體外，對(duì)機(jī)體幾乎沒(méi)有毒性；支化結(jié)構(gòu)內(nèi)部有較大的空腔，表面有大量的可衍生的端基，給藥物的負(fù)載提供了更多的空間和位點(diǎn)；可以利用活性聚合方法制備分子量可控的聚合物，并且只需一步合成，可以彌補(bǔ)線性雙親性聚合物和樹狀大分子的很多不足。在不要求精確分子結(jié)構(gòu)的情況下，作為納米藥物載體有很好的應(yīng)用前景[6]。目前，HPG被廣泛應(yīng)用于藥物載體領(lǐng)域，但更多的是利用其可衍生性，被用于需要特殊結(jié)合位點(diǎn)的藥物(如：順鉑)運(yùn)載體系，作為其載體中的“核”。鹽酸阿霉素(DOX)作為一種抗腫瘤藥物，在抗腫瘤領(lǐng)域起著不可或缺的作用，其自身的疏水性和所帶的正電荷都為它和HPG的相互結(jié)合提供了良好的條件，研究DOX在HPG載體中的負(fù)載及釋放性能，將為把HPG直接用作藥物載體的研究提供良好的理論基礎(chǔ)。

本文以縮水甘油為單體，采用陰離子聚合法一步合成分子量為5 000的HPG，將其作為藥物載體負(fù)載DOX。向載體中投入不同量的DOX后，用掃描電子顯微鏡對(duì)載藥納米粒子進(jìn)行表征，并用熒光法評(píng)價(jià)HPG對(duì)DOX的負(fù)載及釋放性能。結(jié)果表明，HPG對(duì)DOX有較好的負(fù)載性能，且具有一定的緩釋性和靶向釋放性，作為藥物載體具有很大的優(yōu)勢(shì)，為藥物載體的應(yīng)用提供了很好的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

三羥甲基丙烷(TMP)、甲醇鉀、縮水甘油，阿拉丁試劑有限公司；甲苯，國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司；DOX，北京華奉聯(lián)博化學(xué)材料有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、甘露醇，北京化學(xué)試劑公司；超純水(18.25 MΩ·cm)。

掃描電子顯微鏡：日立S-4800；納米粒度及Zeta電位分析儀：DelsaTMnano；冷凍干燥機(jī)：FD-1A-80；熒光分光光度計(jì)：HORIBA scientific FluoroMax-4；核磁共振儀：BrukerAvance 400；紅外光譜儀：VERTEX 70。

1.2 HPG的合成與表征

HPG的合成采用陰離子聚合法[14]合成含有大量羥基的HPG，合成路線如圖1所示。

圖1 HPG的合成路線圖Fig.1 Synthesis method of HPG

向裝有恒壓滴液漏斗、冷凝管、蒸餾裝置的100 mL三口燒瓶中加入0.12 g三羥甲基丙烷和30 mL甲苯，冷凍-抽真空-通氮?dú)庋h(huán)3次，攪拌0.5 h后，蒸餾除去甲苯。加入1 mL濃度為0.31 mol/L的甲醇鉀的甲醇溶液，攪拌0.5 h后，蒸餾除去甲醇。升溫至95 ℃，用恒壓滴液漏斗加入設(shè)計(jì)量的縮水甘油，控制滴速，12 h滴完。滴加完后繼續(xù)反應(yīng)12 h。加入適量甲醇溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇。最后產(chǎn)物在45 ℃下真空干燥，即得透明、粘稠、淡黃色的聚合物液體。將得到的聚合物用核磁共振儀(室溫，以d6-DMSO為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))和紅外光譜儀進(jìn)行表征。

1.3 藥物的負(fù)載及釋放性能

1.3.1 熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

分別配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 μg/mL(pH8.0,pH7.4,pH5.0各一份)的DOX溶液，用熒光光度計(jì)測(cè)定DOX最大發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 載藥納米粒子的制備

用pH8.0的緩沖溶液配制0.1 mg/μL的聚合物溶液和1 mg/mL的DOX溶液，分別取0.1、0.5、1.0 mL的DOX溶液與200 μL聚合物溶液混合，配成總量為20 mL的混合溶液，常溫下勻速攪拌30 min，隨后用透析袋透析4 h，除去未被負(fù)載的DOX，期間分別于0.5、1.5、2.5 h換水。透析結(jié)束后，每份樣品各取10 μL滴硅片，避光干燥后用掃描電子顯微鏡進(jìn)行表征。其余樣品用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥72 h，即得到固體載藥納米粒子。(由于DOX為光敏感性藥物，故有關(guān)DOX的所有操作都要注意避光)。取一定量?jī)龈珊蟮妮d藥納米粒子用pH8.0緩沖溶液溶解，用熒光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線算出載藥量。

1.3.3 藥物在不同pH值下的釋放

根據(jù)載藥量，在不同負(fù)載量的載體納米粒子的溶液中，取負(fù)載相同藥物量的載體納米粒子溶液，放入透析袋中，分別加入pH5.0和pH7.4的緩沖溶液作為透析液進(jìn)行藥物釋放。分別于1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60 h時(shí)取透析液3 mL，測(cè)定熒光強(qiáng)度。每次取樣后，重新補(bǔ)充3 mL緩沖溶液，使釋放系統(tǒng)保持體積恒定。計(jì)算釋放量時(shí)，都將前一次取的樣考慮在內(nèi)。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPG的表征

圖2是HPG的核磁氫譜。1HNMR (400 MHz, DMSO)δ4.86～4.27(m,28H),4.10(q,J=5.2 Hz,3H),4.07～3.67(m,13H),3.66～3.10(m,187H),2.50(s,12H),1.23(s,2H), 0.80(s,3H). 其中,化學(xué)位移為0.80×10-6的H是初始TMP上的CH3,化學(xué)位移為1.23×10-6的H是初始TMP上的CH2,2.50×10-6處是溶劑峰,化學(xué)位移為3.10～4.10×10-6的H是HPG中的CH2，4.27～4.86×10-6處是HPG中的羥基(-OH)峰。通過(guò)計(jì)算得到分子量為5 000。

圖2 HPG的核磁氫譜1HNMR譜圖Fig.2 1HNMR spectra of HPG

圖3是HPG的紅外光譜圖，在3 400 cm-1左右出現(xiàn)羥基的特征峰；1 100 cm-1左右出現(xiàn)明顯的烷基醚鍵(C—O—C)特征峰，證明醚化反應(yīng)的發(fā)生。綜合兩種圖譜，證明HPG的成功合成。

圖3 HPG的紅外光譜ATR-FTIR譜圖Fig.3 ATR-FTIR spectra of HPG

2.2 載藥納米粒子的表征

2.2.1 掃描電子顯微鏡表征

投入不同量的藥物后，HPG在掃描電子顯微鏡下均呈球形，如圖4所示。

(a)空白載體; (b)投入0.1 mgDOX; (c)投入0.5 mgDOX; (d)投入1.0 mgDOX圖4 空白載體及投入不同量DOX后的HPG的SEM圖Fig.4 SEM spectra of blank carrier and HPG loaded with different amounts of DOX

由于HPG內(nèi)部有疏水的空腔，外部有親水的分支，在溶液中可以通過(guò)疏水作用自組裝聚集成膠束，形成穩(wěn)定的分散[14]?？瞻纵d體的粒徑大約為0.5～1 μm(圖4(a))，加入0.1 mg DOX的載體粒徑大約為1～2 μm(圖4(b))，加入0.5 mg DOX的載體粒徑約為0.5～1.5 μm(圖4(c))，加入1.0 mg DOX的載體粒徑大都小于1 μm(圖4(d))。可以看出，投入藥物后，載藥膠束的粒徑先是增大，而后隨著投入DOX量的增加，又呈逐漸減小的趨勢(shì)。DOX的結(jié)構(gòu)(圖5)決定了藥物本身具有疏水性和正電性，使得DOX與具有疏水性和負(fù)電性的HPG之間存在著疏水作用和靜電引力。

圖5 鹽酸阿霉素結(jié)構(gòu)式Fig.5 Structural formula of DOX

載藥HPG粒徑增大主要是由于加入DOX后，DOX通過(guò)疏水作用被包覆在HPG分子的疏水空腔，使膠束間的疏水作用力減弱，體積變大；另一方面，隨著內(nèi)部空腔空間的減少，DOX和HPG間的靜電引力使DOX填充和吸附在HPG的分支結(jié)構(gòu)之間和表面層，也使膠束的粒徑增大。但膠束中疏水空腔有限，隨著DOX量的增加，空腔達(dá)到飽和，DOX與HPG的靜電引力逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，相互吸引作用的增強(qiáng)使得膠束聚集更加緊密，從而對(duì)內(nèi)部空腔的包覆也起到封閉作用，都使得納米粒子的粒徑隨之減小。如此，通過(guò)疏水作用和靜電作用的協(xié)同合作，DOX被包覆在載體中。

2.2.2 熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定負(fù)載量和包封率

圖6是負(fù)載不同量的DOX后測(cè)得的熒光發(fā)射曲線。用熒光分光光度法測(cè)定被藥物包覆后的DOX的熒光發(fā)射曲線后可見(jiàn)，被藥物負(fù)載后的DOX的最大發(fā)射波長(zhǎng)(圖6(a)、6(c)、6(d))與游離的DOX(圖6(b))相比，沒(méi)有發(fā)生位移，熒光曲線的峰形也沒(méi)有發(fā)生改變，且相同濃度的包覆后和未包覆的DOX熒光曲線不發(fā)生變化。

投入(a)0.1 mg；(b)0 mg；(c)0.5 mg；(d)1.0 mg DOX. 插圖：DOX在(A)pH8.0(B)pH7.4(C)pH5.0下的 熒光標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。圖6 負(fù)載不同量DOX的熒光曲線圖Fig.6 Fluorescence spectra of HPG loaded with different amounts of DOX

分析結(jié)果說(shuō)明，HPG的包覆沒(méi)有對(duì)DOX的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而不會(huì)因載體的包覆對(duì)DOX的活性產(chǎn)生影響。取最大發(fā)射波長(zhǎng)(590 nm)處的熒光強(qiáng)度，然后從pH的熒光標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中算出對(duì)應(yīng)濃度，進(jìn)而可以計(jì)算出HPG對(duì)DOX的載藥量和包封率。載藥量和包封率的計(jì)算公式如下：

載藥量和包封率的計(jì)算結(jié)果如表1所示。從結(jié)果看出，隨著投入藥物量的增加，載體對(duì)藥物的包封率逐漸減少，載體的載藥量逐漸增加。

表1 投入不同量藥物后的載藥量和包封率

當(dāng)藥物將載體的疏水空腔充滿后，其余增加的藥物幾乎都是以靜電吸引的方式填充在載體的分支結(jié)構(gòu)之間或載體的表面層。隨著投入藥量的增加，雖然負(fù)載的藥物增多，載藥量增加；但是由于正負(fù)電荷引力導(dǎo)致的膠束半徑的縮小，使得靜電吸引的藥物相對(duì)增加量下降，故而載體的包封率隨著投入藥量的增加呈現(xiàn)相對(duì)減小的趨勢(shì)。

2.2.3 藥物在不同pH值下的釋放行為

在pH8.0的弱堿性條件下，膠束穩(wěn)定存在。但在腫瘤等病灶區(qū)域，環(huán)境呈弱酸性，聚集膠束在酸性條件下較為敏感，親水基團(tuán)的質(zhì)子化可使聚集膠束之間的斥力增加，導(dǎo)致膠束分散[15]。為了模擬正常體液和病變細(xì)胞周圍的環(huán)境，分別用pH7.4和pH5.0緩沖溶液作為透析液對(duì)藥物進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)。藥物從超支化聚合物載體中的釋放有幾種常見(jiàn)的機(jī)制：一是從聚合物載體的表面釋放；二是通過(guò)聚合物載體的微通道擴(kuò)散；三是通過(guò)聚合物載體的降解而釋放[16]。DOX從HPG中的釋放主要是依靠前兩種機(jī)制進(jìn)行，負(fù)載不同量藥物的載體在不同pH值下的DOX釋放情況如圖7所示。

加入0.1 mgDOX的納米粒子在(a)pH7.4和(a′)pH5.0中釋放， 加入0.5 mgDOX的納米粒子在(b)pH7.4和(b′)pH5.0中釋放， 加入1.0 mgDOX的納米粒子在(c)pH7.4和(c′)pH5.0中釋放。圖7 負(fù)載不同量DOX的載體在不同pH值下的釋放圖Fig.7 Releasing behavior of drug carrier in different pH conditions

從圖中可以看出，在不同pH值的緩沖溶液中，均出現(xiàn)藥物釋放行為。釋放的初期出現(xiàn)一段爆發(fā)釋放過(guò)程，釋放初始，由于pH降低，載體的羥基質(zhì)子化，所帶正電荷增多，載體和藥物之間的靜電引力減弱，使得聚集在HPG表面層的藥物，或者與載體結(jié)合力較弱的藥物，在高濃度差下短時(shí)間內(nèi)快速釋放。爆發(fā)釋放過(guò)后，進(jìn)入緩慢釋放階段，這個(gè)階段是隨著載體表層藥物的釋放，讓載體的分支間結(jié)合越來(lái)越疏松，膠束分散，使得包覆在內(nèi)部藥物通過(guò)聚合物載體分支間的空隙(微通道)緩慢擴(kuò)散的過(guò)程。對(duì)比負(fù)載不同藥物量的載體釋放曲線可以看出，在釋放時(shí)間達(dá)到約24 h時(shí)，負(fù)載量小的載體釋放量已經(jīng)趨于平穩(wěn)，系統(tǒng)接近平衡狀態(tài)；而負(fù)載量大的載體釋放量仍處于上升趨勢(shì)，還沒(méi)有達(dá)到最大釋放量，說(shuō)明通過(guò)調(diào)節(jié)負(fù)載藥物的量可以使載體具有一定的緩釋性能。三組曲線顯示的藥物在pH5.0條件下的釋放量均高于在pH7.4條件下的釋放量，這也充分說(shuō)明載體具有一定的靶向釋放性能，這一點(diǎn)有利于在腫瘤病灶區(qū)域的靶向治療。并且比較相同負(fù)載量的載體在兩種pH條件下的釋放量之間的差別可以看出，投入0.5 mg DOX的載體在兩種pH條件下的釋放量差值最大，說(shuō)明這種載藥體系最適合用于抗腫瘤藥物阿霉素的運(yùn)載。這個(gè)工作也說(shuō)明通過(guò)控制不同的載體和藥物投放比例，有希望篩選出兼具高負(fù)載量和高靶向性的更佳的藥物負(fù)載量。

3 結(jié)論

本文成功合成HPG并將其作為藥物載體，負(fù)載不同量的DOX，對(duì)載體的負(fù)載和釋放性能進(jìn)行針對(duì)性研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HPG的一步法合成簡(jiǎn)單，對(duì)DOX具有良好的負(fù)載能力，主要是通過(guò)疏水作用和靜電作用的協(xié)同負(fù)載藥物，載藥量可達(dá)7.25%。并且具有一定的環(huán)境敏感性和緩釋性能，藥物可持續(xù)釋放20 h以上，通過(guò)調(diào)節(jié)載藥量可以篩選出高載藥量和高靶向性的藥物載體比例。HPG作為藥物載體在醫(yī)藥抗腫瘤方面有非常廣闊的前景。