消融左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)對犬急性心肌缺血后縫隙連接蛋白43表達(dá)的影響*

劉珊 魯志兵 羅達(dá) 余小梅 王曉瑩 瞿唯一 胡慧慧 馬瑞松 江洪

惡性室性心律失常是導(dǎo)致急性心肌梗死(簡稱心梗)患者猝死的主要原因?；A(chǔ)研究證實(shí)交感神經(jīng)活性增強(qiáng)及副交感神經(jīng)活性抑制是誘發(fā)室性心律失常的重要原因[1-3]。目前普遍認(rèn)為抑制交感神經(jīng)活性或增強(qiáng)副交感神經(jīng)活性可預(yù)防心梗后室性心律失常的發(fā)生。

縫隙連接蛋白43(Cx43)是心室肌縫隙連接通道的主要蛋白，有助于心肌細(xì)胞電化學(xué)偶聯(lián)和機(jī)械穩(wěn)定[4]。Cx43的含量、分布及自身磷酸化狀態(tài)的改變可影響縫隙連接的電化學(xué)偶聯(lián)，進(jìn)而誘發(fā)心律失常[5]。在器質(zhì)性心臟病中，改善Cx43的含量及分布可維持心電穩(wěn)定性，恢復(fù)正常心臟功能[6]。已有研究證實(shí)低強(qiáng)度迷走神經(jīng)刺激可通過抑制急性心梗后Cx43的丟失發(fā)揮抗心律失常的作用[7]。筆者制造急性心梗模型來探索消融左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)(left stellate ganglion,LSG)發(fā)揮抗室性心律失常的作用是否與調(diào)控Cx43的表達(dá)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年雜種犬18只，體重14～22 kg，均為雄性，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物中心提供。戊巴比妥鈉30 mg/kg前肢靜脈麻醉，以后每小時(shí)追加2 mg/kg維持麻醉狀態(tài)。氣管插管接動(dòng)物呼吸機(jī)，靜脈滴注生理鹽水補(bǔ)液?？照{(diào)控制在25 ℃～30 ℃，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，犬下方放置電熱板以維持犬正常體溫。持續(xù)記錄體表心電圖(Lead7000，四川錦江電子公司)。

18只成年雜種犬隨機(jī)分為三組：①假手術(shù)組(SO組,n=6)：開胸，游離LSG而不予以消融，分離左冠狀動(dòng)脈并穿線，但不結(jié)扎；②心梗組(MI組，n=6)：制造心梗模型；③消融組(n=6)：消融LSG 30 min后再造急性心梗模型。

1.2消融LSG 消融組左側(cè)第2肋間開胸暴露LSG,使用高頻電刺激(頻率20 Hz，脈寬2 ms，電壓15 V)進(jìn)行LSG功能定位，高頻刺激能使血壓迅速上升即確認(rèn)為LSG。消融功率設(shè)定為35 W，消融時(shí)間不短于1 min，消融過程中持續(xù)生理鹽水沖洗導(dǎo)管頭端。LSG消融成功的標(biāo)志為同樣電壓刺激無法使血壓上升[8]。其余兩組左側(cè)第2肋間開胸游離LSG后，將大頭消融電極(3.5 mm)置于LSG表面但不予以射頻能量。

1.3心梗模型的建立 各組均經(jīng)左側(cè)第4肋間開胸，剪開心包，暴露心臟。分離冠狀動(dòng)脈第一對角支之上的左前降支近端，于其下穿入兩根3-0絲線，SO組僅穿線不結(jié)扎，MI組及消融組采用兩部法結(jié)扎左前降支建立急性心梗模型。首先于第一道結(jié)扎線上放入粗導(dǎo)絲，結(jié)扎左前降支后抽出導(dǎo)絲進(jìn)行缺血預(yù)適應(yīng)20 min，而后將第二道結(jié)扎線扎緊。結(jié)扎成功的標(biāo)準(zhǔn)：心肌缺血區(qū)局部發(fā)紺，同步Ⅱ?qū)?lián)ECG顯示ST段明顯改變(≥0.1 mV抬高或壓低)，心梗期間出現(xiàn)室性心律失常。

1.4心率變異性的記錄 采用LabChart多道生理記錄儀(澳大利亞ADInstruments公司)記錄消融前及消融30 min內(nèi)的動(dòng)態(tài)心電圖，利用配套的分析軟件分析各5 min時(shí)段的心率變異性(HRV)，以評估心臟自主神經(jīng)活性的變化。其中高頻(HF)反映副交感神經(jīng)活動(dòng)的指標(biāo)，低頻(LF)和LF/HF比值反映交感神經(jīng)活動(dòng)的指標(biāo)。

1.5室性心律失常的觀察 心電圖連續(xù)監(jiān)測犬急性心梗后1 h的室性心律失常事件。SO組分離左前降支并穿線后持續(xù)記錄1 h心電圖。室性早搏(簡稱室早)：提前發(fā)生的QRS波群,無P波；QRS波形寬闊畸形,較正常高且時(shí)間長；T波與QRS波群主波方向相反。成對室早指2個(gè)連續(xù)出現(xiàn)的室早，室性心動(dòng)過速(簡稱室速)為3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)出現(xiàn)的室早，心室顫動(dòng)(簡稱室顫)指心電圖上可見心室顫動(dòng)波，伴動(dòng)脈血壓消失。

1.6總Cx43蛋白及磷酸化Cx43蛋白的檢測 應(yīng)用Western blot分析總Cx43蛋白(T-Cx43)及磷酸化Cx43 (P-Cx43)的表達(dá)量，相應(yīng)的一抗分別為羊Cx43多克隆抗體(AB0016-200，sicgen公司)及兔磷酸化Cx43多克隆抗體(bs-3098R，北京博奧森公司)。檢測方法如以前研究所述，以內(nèi)參GADPH條帶光密度值作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算T-Cx43和P-Cx43蛋白表達(dá)的相對量。

1.7Cx43 mRNA表達(dá)的檢測 安樂死處死動(dòng)物后，于左前降支結(jié)扎處取心肌顏色為蒼白與暗紅交界處的整層缺血心肌，厚約2 cm。Trizol一步法提取總RNA并用DNA酶處理，按試劑盒說明一步法逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。Cx43 RNA雙向引物由武漢金開瑞生物工程有限公司提供。Cx43上游引物：5′-TGT ACG CTT CTG GGT CCT GC-3，；下游引物：5′-CCT TGC CGT GCT CTT CAA TT-3′。用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，以內(nèi)參GAPDH mRNA條帶光密度值作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算Cx43 mRNA表達(dá)的相對量。

2 結(jié)果

2.1消融前后HRV的比較 消融前SO組與消融組HF、LF及LF/HF無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。SO組消融前后HF、LF及LF/HF無明顯改變(P均>0.05)。與消融前相比，消融組消融后HF顯著升高，LF值及LF/HF值顯著降低(P均<0.05)。見表1。

表1 消融LSG對HRV的影響

注：與同組消融前比較，*P<0.05

2.2三組室性心律失常事件的比較 三組室性心律失常發(fā)生示意圖見圖1。SO組無室性心律失常事件發(fā)生。與SO組相比，MI組室性心律失常發(fā)生明顯增加。與MI組相比，消融組單發(fā)室早、成對室早、室速的次數(shù)和室速持續(xù)時(shí)間明顯降低(P均<0.05)。MI組有1只于結(jié)扎左前降支后出現(xiàn)室顫，消融組均未發(fā)生室顫。見表2。

2.3各組P-Cx43和T-Cx43的表達(dá) 與SO組相比，MI組P-Cx43、T-Cx43顯著降低(P均<0.05)。與MI組相比，消融組P-Cx43和T-Cx43較MI組明顯升高(P均<0.05)，但與SO組比較，無明顯差異(P均>0.05)。見圖2，表3。

圖1 三組典型的心電圖表現(xiàn)

組別n單發(fā)室早/個(gè)成對室早/個(gè)室速/次室速持續(xù)時(shí)間/s室顫/只SO組600000MI組6286(142～476)13(6～16)7(1～12)4.3(3.2～4.9)1(16.67%)消融組613(4～19)*1(0～1)*0(0～2)*0.9(0.7～1.2)*0

注：與MI組比較，*P<0.05

2.4三組Cx43 mRNA的表達(dá) 與SO組相比，MI組Cx43 mRNA顯著降低(P=0.00)；消融組Cx43 mRNA較MI組明顯升高(P=0.00)，但與SO組相比，無差異(P=0.068),見表3。

圖2 三組P-Cx43和T-Cx43的表達(dá)

3 討論

LSG是交感神經(jīng)支配心臟的重要組成部分，基礎(chǔ)研究及臨床實(shí)驗(yàn)已證實(shí)LSG阻滯或消融可有效降低心梗后室性心律失常事件及心臟猝死的發(fā)生[9-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明消融LSG可通過降低交感神經(jīng)活性，增強(qiáng)副交感神經(jīng)活性，進(jìn)而抑制急性心梗后室性心律失常的發(fā)生，與以往研究結(jié)果一致。但消融LSG發(fā)揮抗心律失常作用的具體機(jī)制尚不明確，可能與降低交感神經(jīng)活性，改善電生理性質(zhì)，

表3 三組P-Cx43、T-Cx43及 Cx43 mRNA的表達(dá)

注：與SO組比較，*P<0.05；與MI組比較，#P<0.05

改善心電傳導(dǎo)等因素有關(guān)。

Cx43是哺乳動(dòng)物心室肌縫隙連接通道含量最豐富的連接蛋白，主要在閏盤以端-端分布為主[11]。生理狀態(tài)下，大部分心肌細(xì)胞的Cx43為P-Cx43。心肌缺血后，細(xì)胞代謝和能量產(chǎn)生障礙，閏盤處Cx43發(fā)生再分布和快速去磷酸化可減慢傳導(dǎo)速度、增加傳導(dǎo)的各向異性、發(fā)生折返性電活性，最終導(dǎo)致室性心律失常的發(fā)生[12-13]。Hu等[14]研究發(fā)現(xiàn)刺激交感神經(jīng)促進(jìn)室性心律失常的發(fā)生，可能與激活β腎上腺素受體進(jìn)而促進(jìn)Cx43的降解有關(guān)。此外，他們發(fā)現(xiàn)刺激迷走神經(jīng)一方面可通過抑制急性心梗后Cx43的去磷酸化，增加P-Cx43的表達(dá)；另一方面可通過改善Cx43的分布，發(fā)揮抗室性心律失常的作用[15]。近期Yang等[16]在心梗鼠模型上將Sema3a注入LSG，2周后發(fā)現(xiàn)交感神經(jīng)再生明顯減弱，且通過可激活Cx43蛋白激酶引起Cx43發(fā)生磷酸化，增加心肌缺血周邊區(qū)P-Cx43和T-Cx43的表達(dá)進(jìn)而抑制室性心律失常的發(fā)生。以上研究表明自主神經(jīng)參與急性心肌缺血后Cx43的再表達(dá)和再分布。筆者的研究發(fā)現(xiàn)，消融LSG可抑制心肌缺血后P-Cx43和T-Cx43的表達(dá)下降。我們認(rèn)為消融LSG上調(diào)急性心肌缺血后P-Cx43和T-Cx43的表達(dá)與交感神經(jīng)活性降低，副交感神經(jīng)活性增強(qiáng)有關(guān)。消融LSG抑制急性心梗后P-Cx43和T-Cx43的丟失可能機(jī)制如下：①只有P-Cx43才參與心電傳導(dǎo)。已有研究報(bào)道，刺激迷走神經(jīng)不僅可降低血清去甲腎上腺素的濃度，還可促進(jìn)乙酰膽堿的釋放，后者可上調(diào)心肌缺血后P-Cx43的表達(dá)[17]。消融LSG可擬迷走神經(jīng)興奮作用促進(jìn)P-Cx43的表達(dá)；②在分子層面上，T-Cx43的表達(dá)與NO有關(guān)。Yao等[18]研究表明NO可通過環(huán)磷酸鳥苷相關(guān)通路激活蛋白激酶A進(jìn)而增加T-Cx43的表達(dá)。消融LSG可能通過激活NO合成酶，增加NO的釋放，從而上調(diào)T-Cx43的表達(dá)。

綜上所述，消融LSG可通過抑制交感神經(jīng)活性，增強(qiáng)迷走神經(jīng)活性，進(jìn)而抑制缺血心肌Cx43的丟失發(fā)揮抗心律失常的作用。消融LSG調(diào)控Cx43的表達(dá)及磷酸化水平確切機(jī)制還需進(jìn)一步探討。