鐵皮石斛原球莖誘導率提升的研究

黃靖 劉春英 袁亞芳

關鍵詞：鐵皮石斛;原球莖;誘導;培養(yǎng)基

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.11.002

鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimuraet Migo又稱黑節(jié)草，屬蘭科石斛屬，為蘭科多年生附生草本植物，是一種珍貴的野生藥用植物。石斛屬DendrobiumSw是蘭科Orchidaceae中的第二大屬，迄今全球已發(fā)現(xiàn)有1500多種植物，我國有70多個種?，F(xiàn)代藥理研究表明，鐵皮石斛具有抗腫瘤、抗衰老、增強機體免疫力、擴張血管及抗血小板凝集等作用，因此在臨床上及中藥復方中被廣泛應用[1]。鐵皮石斛蒴果成熟時易開裂，且種子粒徑小，自然繁殖率低。由于鐵皮石斛生長條件的特殊性和分布的局限性以及多年的人為過度采挖破壞，自然資源瀕臨枯竭，成為瀕危植物，被列為國家重點保護的野生藥材品種。近年來，在鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的推動下，大多數(shù)從事鐵皮石斛組織培養(yǎng)的企業(yè)，主要是采用種子播種方式。由于使用的果莢沒有嚴格把關，生產(chǎn)出來的種苗分化、混雜現(xiàn)象嚴重，種植出來的鐵皮石斛品質(zhì)無法得到保證，嚴重影響了鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，為了保護和有效利用鐵皮石斛，采用組織培養(yǎng)技術，大量快速繁殖鐵皮石斛組培苗顯得尤為重要。

組培工廠化生產(chǎn)育苗要求配方穩(wěn)定、繁殖系數(shù)高、成本低和種苗質(zhì)量穩(wěn)定[2]。目前有關鐵皮石斛快速繁殖研究報道中，多集中以種子、莖尖、莖段等為外植體，并通過原球莖的增殖與分化來繁殖種苗[3]。

通過莖段原球莖的途徑，生產(chǎn)出的種苗都來源于同一母本，性狀整齊一致，可以解決種子播種的種苗混雜問題，且繁殖系數(shù)高;但是，原球莖誘導的控制難度較大，生產(chǎn)上沒有得到廣泛應用[4]。以鐵皮石斛種子誘導原球莖，再通過原球莖的分化、增殖培養(yǎng)而得到大量幼苗，這種快繁方法可加快鐵皮石斛繁殖速度，推進工廠化育苗[5]。本研究以福清佳家農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限公司的鐵皮石斛種子、莖段為原材料，采用單因素試驗法對原球莖的誘導和增殖的培養(yǎng)基配方進行篩選，以期建立一整套鐵皮石斛莖段原球莖途徑的組培生產(chǎn)技術流程，應用于工廠化生產(chǎn)。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料采自福清佳家農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限公司，種植于基地溫室大棚。

1.1.1莖段的處理選擇健康、無病蟲害為害的當年生鐵皮石斛嫩莖，去除葉片，帶回實驗室。

1.1.2成熟蒴果的處理采集鐵皮石斛成熟蒴果，經(jīng)過表面消毒處理，剖開蒴果取出種子接種到原球莖誘導培養(yǎng)基上。

1.2試驗方法

1.2.1莖段消毒莖段先用自來水沖洗干凈，再用流水沖洗5 min，然后用無菌濾紙吸干表面水分。在超凈工作臺上，將莖段剪成3 cm長的小段，每段帶1～2個莖節(jié)。先用75%酒精浸泡30 s，再放入0.1 L汞溶液中浸泡6 min;之后用無菌水沖洗3次，再用無菌濾紙吸干，在無菌碟子上切去兩端傷口，并切成帶一個節(jié)的小段，接種到不同的誘導培養(yǎng)基上。

1.2.2蒴果的消毒將鐵皮石斛的蒴果先用自來水沖洗干凈，再置于洗潔精溶液中搖洗10 min，取出蒴果用自來水洗凈，瀝干水后，在超凈工作臺上先用75%的酒精消毒2 min;倒去酒精，再用0.1%升汞消毒15 min;倒去升汞消毒液，用無菌水沖洗4～5次，瀝干備用。接種時，將經(jīng)過表面消毒的蒴果放在無菌的不銹鋼盤上，切除頭尾約0.5 cm，然后將蒴果中段沿縱軸切開，取出種子，均勻地接種到培養(yǎng)基表面。

1.2.3原球莖的誘導莖段及種子均以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，設置8個處理，分別添加不同濃度的NAA（表1）。將材料接種在原球莖誘導培養(yǎng)基中，每個處理接種5個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿接種10個外植體，30 d后統(tǒng)計原球莖的誘導情況。

2結果與分析

2.1不同外植體及激素對原球莖誘導的影響

接種10 d起，外植體均開始萌發(fā)，30 d左右可明顯看到膨大的原球莖，且部分原球莖開始分化出芽尖。60 d左右可明顯看到分化出的小苗。

由表3可以看出，不同處理種子均可萌發(fā)誘導出原球莖，而以種子為外植體的原球莖誘導率遠高于以莖段為外植體的誘導率，其中以MS為基本培養(yǎng)基處理原球莖誘導率均高于以1/2MS為基本培養(yǎng)基處理。MS添加NAA 0.1 mg·L-1處理的原球莖誘導率高達98.7%，處理4的誘導率最低，為41.6%。由此可以看出，NAA濃度過高抑制幼苗分化，而低濃度NAA有利于促進幼苗分化。

綜合原球莖誘導和分化情況可知，MS中添加0.1 mg·L-1 NAA可有效促進鐵皮石斛種子萌發(fā)和發(fā)育。

2.2不同激素濃度對原球莖增殖的影響

從表4可以看出，鐵皮石斛的原球莖體具有較強的增殖能力。即使只在基本培養(yǎng)基中，經(jīng)60 d培養(yǎng)后，其增殖系數(shù)仍可高達21.4。在添加NAA 0.1 mg·L-1的條件下，6BA的最佳用量為0.5 mg·L-1，即處理③，鐵皮石斛原球莖體的增殖系數(shù)高達45.8。該處理中每瓶接入5個原球莖體，經(jīng)60 d培養(yǎng)后，最多的1瓶增殖出的原球莖體數(shù)多達297個，統(tǒng)計5瓶，共增殖出2290個原球莖體。繼續(xù)增加6BA用量后，原球莖增殖系數(shù)反而下降，當6BA用量達到2.0 mg·L-1時，增殖系數(shù)開始下降至34.9。

3結果與討論

原球莖誘導是鐵皮石斛原球莖途徑組織培養(yǎng)的一個關鍵環(huán)節(jié)，誘導率的高低直接影響組培工廠化生產(chǎn)的成本。常規(guī)組培手段采用的原球莖誘導多使用鐵皮石斛莖段及莖尖為外植體，誘導率普遍低于50%，本研究通過接種成熟種子對原球莖誘導培養(yǎng)基篩選發(fā)現(xiàn)，在MS+NAA 0.1 mg·L-1+瓊脂7.0 g·L-1+蔗糖30.0g·L-1上，鐵皮石斛成熟種子萌發(fā)誘導產(chǎn)生原球莖比率高達98.7%。在MS+NAA 0.1 mg·L-1+6BA 0.5 mg·L-1+瓊脂7.0 g·L-1+蔗糖30.0 g·L-1上，原球莖能大量進行增殖。試驗結果也表明添加一定濃度的生長素和細胞分裂素能有效促進鐵皮石斛原球莖的誘導，但濃度過高或過低均不利于原球莖的誘導及增殖。

組織培養(yǎng)獲得鐵皮石斛再生植株的途徑有多種，關于利用成熟種子進行快繁，文獻報道較多的是用成熟的種子消毒后進行無菌播種形成原球莖，并經(jīng)過增殖、分化發(fā)育成完整植株[5]。本研究主要是采用將種子消毒后無菌播種誘導產(chǎn)生原球莖，增殖原球莖，再通過轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基促進小苗增殖的方法，進而達到快繁的目的。

參考文獻：

[1]莫昭展，貝學軍，楊小飛，等.鐵皮石斛叢生芽增殖研究[J].西北林學院學報，2008，23（6）：104-107.

[2]林江波，王偉英，李海明，等.鐵皮石斛莖段原球莖的誘導、分化與植株再生[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2016，31（10）：1075-1079.

[3]張壽文，蘇慧慧，鐵皮石斛原球莖分化的研究概述[J].中國現(xiàn)代中藥，2014，16（4）：274-276.

[4]林茜，林貴美，韓曉華，等.利用鐵皮石斛原球莖進行組培快繁[J].南方農(nóng)業(yè)學報，2015，46（9 ）：1557-1560.

[5]石麗敏，盧華兵，胡賢女.鐵皮石斛原球莖誘導分化與增殖試驗[J].浙江農(nóng)業(yè)科學，2015，56 （8 ）：1191-1192.

（責任編輯：柯文輝）