日本鰻鱺離散SNP標記篩選及群體遺傳多樣性分析?

于 磊， 劉炳艦， 劉進賢

(1. 中國科學院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室，山東 青島 266071； 2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室，山東 青島 266071)

生物與其所生存的環(huán)境密不可分。在本地環(huán)境的選擇壓力下，本地群體會進化出與其生存環(huán)境相適應的表型特征，更好地適應本地環(huán)境，這就是“本地適應性”(Local adaptation)[1]。闡明本地適應性發(fā)生的程度和動態(tài)，能夠加深對于生物多樣性的認識，同時也可以為生物資源的保護提供參考[2]。

早期本地適應性研究多采用候選基因法。研究者從已知生物學功能的編碼蛋白質(zhì)的基因入手，通過群體遺傳學分析檢測本地適應性的信號[3-6]。該方法能夠成功的關鍵在于目標候選基因的選擇，然而準確地選擇合適的基因在實際操作中難度極大。除此之外，候選基因法也很難應用到非模式生物的研究中。由于技術方法的束縛，關于生物種群本地適應性的研究進展緩慢。近年來，隨著二代測序技術(Next-generation sequencing technology)的迅猛發(fā)展，基于全基因組掃描的方法被應用到生物種群本地適應性的研究中。該方法可以開發(fā)大量單核苷酸多態(tài)性標記(Single nucleotide polymorphism, SNP)，大大促進了該領域的發(fā)展。SNP標記主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。單核苷酸多態(tài)性標記具有在基因組中數(shù)量多，分布密度高等特點，而且在基因分型過程中不需要根據(jù)片段大小將DNA分帶，可以大規(guī)模地高度自動化地完成，相比微衛(wèi)星標記工作效率更高，更適于大樣本量檢測分析，SNP標記的使用是群體遺傳學研究的一大突破[7]。研究者可以使用整個基因組范圍內(nèi)大量的SNP標記進行群體遺傳學分析，對種群遺傳學參數(shù)的解析力度驟增(例如，基因流和有效群體大小)。除此之外，基于全基因組掃描的方法在非模式生物的研究中體現(xiàn)出基于候選基因的方法不可比擬的優(yōu)勢。目前，基于二代測序技術檢測生物種群本地適應性的研究開發(fā)了大量離散遺傳位點(Outlier markers)，已經(jīng)在多種海洋生物中檢測到了適應性分化的信號，例如：大西洋鱈魚(Gadusmorhua)[8-9]、大西洋鯡魚(Clupeaharengus)[10-11]和太平洋七鰓鰻(Entosphenustridentatus)[12]等。然而，對于存在中性遺傳分化的物種，在離散遺傳位點上檢測到的生物種群的遺傳結(jié)構是中性力量和自然選擇力量共同作用的結(jié)果，很難準確解讀適應性分化的模式[13]。

日本鰻鱺(Anguillajaponica)隸屬于鰻鱺目(Anguilliformes)鰻鱺科(Anguillidae)鰻鱺屬(Anguilla)，是一種長距離降海洄游性魚類[14]。成魚廣泛分布于東亞河口和淡水河流，在日本、中國，以及朝鮮半島都有分布[15]。日本鰻鱺的產(chǎn)卵場位于馬里亞納群島的西部海域(大致為15°N, 140°E)[16]，孵化后的柳葉鰻(Leptocephalus)隨海流漂流至東亞各國沿海，進而抵達河口水域，變態(tài)為玻璃鰻(Glass eel)[17]。而后經(jīng)過復雜的變態(tài)發(fā)育，成體在淡水河流中生活。從1980年代開始，日本鰻鱺的種群衰退不斷加劇。玻璃鰻(Glass eel)、黃鰻(Yellow eel)以及銀鰻(Silver eel)的野生群體資源量均出現(xiàn)了嚴重衰退[18]。在2016年公布的IUCN瀕危物種紅色名錄中，日本鰻鱺已經(jīng)被列為“瀕危”[19]。雖然目前已經(jīng)可以人工育成日本鰻鱺的玻璃鰻幼體[20]，但是由于尚未攻克玻璃鰻幼體餌料的難題，因此人工育成的幼苗成活率低，活性弱，尚無法實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，日本鰻鱺的養(yǎng)殖仍然主要依靠從自然海域捕獲野生幼苗。隨著日本鰻鱺野生資源的衰退，鰻鱺市場受到巨大的沖擊。目前研究表明，水利設施建設、過度捕撈、環(huán)境棲息地的破壞，以及全球氣候變化等都可能是造成鰻鱺種群衰退的原因，然而這些因素對鰻鱺資源量影響的強度和機制尚不明確[21]。日本鰻鱺作為隨機交配物種[22-25]的典型代表，各地理群體均為同一基因庫隨機分配，并不存在中性遺傳分化。因此在離散位點上檢測到的群體間遺傳分化的信號是其單一世代內(nèi)受自然選擇作用的結(jié)果。這使其成為研究本地適應性問題的理想材料。

在本研究中，我們利用酶切位點相關DNA測序(Restriction site-associated DNA sequencing, RAD-Seq)技術開發(fā)日本鰻鱺多態(tài)性離散SNP標記，并通過KASPar(KBiosciences Competitive Allele-Specific PCR genotyping system)技術進行SNP位點的多態(tài)性驗證及在兩個群體中開展初步群體遺傳學分析。相關SNP標記可以用于未來日本鰻鱺群體遺傳結(jié)構的解析以及種群適應本地環(huán)境機制的研究。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和和DNA提取

在福建寧德市三沙鎮(zhèn)(SS)和遼寧丹東市(DD)向當?shù)貜氖脉犆绮稉谱鳂I(yè)的漁民購買日本鰻鱺的玻璃鰻樣品(SS，2014年3月，36尾；DD，2014年5月，30尾)，保存于95%的酒精中。DNA提取采用傳統(tǒng)方法。首先用蛋白酶K消化肌肉組織，然后使用苯酚-氯仿法抽提DNA。

1.2 SNP開發(fā)

從兩個群體各選取12尾玻璃鰻樣品進行RAD-seq。文庫構建和RAD-seq的具體實施參照了張柏東等[26]發(fā)表的論文。每個樣本RAD-seq獲得的總讀長至少達到1×基因組(約1.2G)深度。原始數(shù)據(jù)按照如下標準進行過濾：1.去除有接頭污染的序列；2.去除未識別堿基大于或者等于10%的序列；3.去除phred值小于5的堿基占總序列長度大于或者等于50%的序列；4.去除文庫構建過程中PCR擴增產(chǎn)生的重復序列；5.去除序列上沒有EcoRI酶切位點(AATTC)的序列。將過濾后的序列根據(jù)個體特異的標簽序列進行歸類。使用BWA 0.5.9將序列比對到日本鰻鱺的基因組草圖上[27]，參數(shù)使用默認值(Mismatch penalty 4；Gap open penalty 6)[28]。使用SAMTOOLS[29]獲取SNP位點的信息。

使用ARLEQUIN 3.5[30]篩選可能受到自然選擇作用的位點。該軟件可以繪制遺傳距離FST值關于雜合度的散點圖，將其與模擬的中性分布進行對比來進行離散位點的篩選。中性分布使用雙島嶼模型(Two-island model)進行模擬，假設自由交配[31]。

1.3 多態(tài)性驗證

SNP分型由艾吉析科技(上海)有限公司完成。該公司使用KASPar技術對丹東群體的30尾玻璃鰻樣品和三沙群體的31尾玻璃鰻樣品進行SNP分型。KASPar技術基于競爭性位點特異性PCR擴增技術，將正向引物的3’末端設計在SNP位點上，同一位點的兩個不同等位基因被擴增為攜帶不同熒光顏色的產(chǎn)物。每個SNP位點所使用的特異性引物信息見表 1。

使用ARLEQUIN 3.5計算觀測雜合度(Ho)，期望雜合度(He)。使用GENEPOP 4.5.1[32]檢驗哈溫平衡和連鎖不平衡，顯著性水平用Bonferroni方法進行校正。使用ARLEQUIN 3.5計算兩群體間的遺傳距離FST值，顯著性水平通過10 000次重抽樣模擬(Bootstrapping permutations)進行計算。

2 結(jié)果

2.1 RAD-seq過濾結(jié)果

在RAD-seq過程中，最終產(chǎn)出42.1Gb原始數(shù)據(jù)，MS25個體的原始數(shù)據(jù)量達到6×基因組(約1.2G)深度，其余個體的數(shù)據(jù)量達到1×基因組(約1.2G)深度，Q20比例基本都在90%以上。經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾后，共產(chǎn)出40.0Gb高質(zhì)量數(shù)據(jù)，平均每個樣本1.67Gb數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，數(shù)據(jù)量較大，滿足后續(xù)分析需要。

2.2 SNP開發(fā)和驗證

基于RAD-seq的數(shù)據(jù)共獲得73 557個SNP位點的信息。ARLEQUIN離散位點檢驗中，使用R軟件處理ARLEQUIN軟件輸出的文本文件，選取FST值達到99.5%分位數(shù)以上的位點作為候選位點，共有250個。在這些位點中，有85個SNP位點可以成功地進行功能注釋，涉及到多個方面的生物學功能。由于能成功進行功能注釋的位點更有可能在生物的本地適應性中發(fā)揮作用，因此使用KASPar技術對其中48個能進行功能注釋的位點進行SNP分型。有6個位點未分型成功，2個位點的數(shù)據(jù)缺失率大于15%，最終有40個位點的數(shù)據(jù)可用。在本研究中，同一位點2個不同等位基因擴增后的產(chǎn)物分別被HEX和FAM標記，根據(jù)2種熒光信號的強度進行SNP分型，熒光信號強度較強，分型結(jié)果清晰。

2.3 遺傳標記信息

在這40個SNP位點中，2個位點具有單態(tài)性，AJ_SNP_06位點在丹東群體和三沙群體中均只檢測到胞嘧啶脫氧核糖核苷酸(C)一種等位基因，而AJ_SNP_08只檢測到腺嘌呤脫氧核糖核苷酸(A)一種等位基因。其余38個位點具有多態(tài)性，在丹東(DD)群體中，這38個位點的觀測雜合度(Ho)為0～0.407，期望雜合度(He)為0.033～0.484；在三沙(SS)群體中，這38個位點的觀測雜合度(Ho)為0.032～0.500，期望雜合度(He)為0.032～0.494。具體信息見表 2。經(jīng)過Bonferroni方法校正，在丹東(DD)群體中，AJ_SNP_03位點偏離哈溫平衡，所有的位點間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象。在三沙(SS)群體中，AJ_SNP_25位點和AJ_SNP_35位點偏離哈溫平衡，所有位點間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象。綜上，這38個SNP標記具有較高的多態(tài)性，且未檢測到偏離哈溫平衡或出現(xiàn)連鎖不平衡，因此符合群體遺傳學分析的需要，可用于解析日本鰻鱺的群體遺傳結(jié)構。而且這些標記均可定位到日本鰻鱺基因組草圖上，研究者可根據(jù)自己的需要選擇SNP分型方法。丹東群體和三沙群體間的遺傳距離FST值為-0.005(P=0.898)，表明這2個群體間并無顯著的遺傳分化。

3 討論

遺傳多樣性是生物與環(huán)境長期相互作用的結(jié)果，也是生物適應生存環(huán)境的基礎。一般認為，遺傳多樣性水平越高，生物應對環(huán)境變化的能力越強，反之亦然[33]。生物遺傳多樣性的水平通過分子標記來評估，目前微衛(wèi)星標記和SNP標記是最流行的2種分子標記。與微衛(wèi)星標記相比，SNP標記在分型的準確性以及數(shù)據(jù)處理的自動化等方面更具優(yōu)勢[34]。本研究開發(fā)的38個多態(tài)性SNP位點，在丹東(DD)群體中的觀測雜合度(Ho)為0～0.407，期望雜合度(He)為0.033～0.484；在三沙(SS)群體中的觀測雜合度(Ho)為0.032～0.500，期望雜合度(He)為0.032～0.494。日本鰻鱺的這些SNP標記的雜合度并未出現(xiàn)顯著降低，與其他海洋魚類的雜合度水平相當。在隆頭魚(Ctenolabrusrupestris)中，SNP標記的期望雜合度(He)為0.063～0.495[35]；在大黃魚(Larimichthyscrocea)中，SNP標記的期望雜合度(He)為0.066～0.503[36]；在歐洲川鰈(Platichthysflesus)中，SNP標記的期望雜合度(He)為0.176～0.600[37]。結(jié)果表明，盡管日本鰻鱺的種群資源嚴重衰退，然而群體遺傳多樣性水平并未出現(xiàn)顯著降低。但是這并不意味著日本鰻鱺的資源狀況良好，而有可能與海洋魚類的生活史策略(Life history strategy)相關。日本鰻鱺為r-對策者，繁殖大量子代，但子代存活率低。因此即使種群遭遇瓶頸，子代可能依然會保持較高的遺傳多樣性水平。然而，日本鰻鱺的資源衰退已十分嚴重，若不加強對日本鰻鱺種群資源的保護，其資源狀況可能陷入惡性循環(huán)，最終導致日本鰻鱺物種的滅絕。

探究生物不同地理群體的遺傳結(jié)構，不僅可以加深對生物多樣性的認識，也是合理有效地管理生物資源的基礎。目前對海洋魚類群體遺傳結(jié)構的研究大多采用中性遺傳標記，這些研究的結(jié)果表明，很多海洋魚類不同地理群體間并不存在顯著的遺傳分化。使用離散位點標記進行研究，可以揭示更精細的群體遺傳結(jié)構[38-39]。本研究開發(fā)的SNP標記是根據(jù)丹東群體和三沙群體RAD-seq的數(shù)據(jù)開發(fā)的兩群體間高FST值標記，因此在解析日本鰻鱺群體遺傳結(jié)構時會具有更高的分辨率。在本研究中，基于38個SNP標記的丹東群體和三沙群體間的遺傳距離FST值為-0.005(P= 0.898)，且不顯著，表明這2個群體間并無顯著的遺傳分化。這可能與日本鰻鱺隨機交配[22-25]的生物學特征有關。日本鰻鱺性成熟后會洄游到共同的產(chǎn)卵場進行繁殖，不同地理群體是從同一基因庫隨機分配而來，因此遺傳組成并無顯著差異。然而，本研究開發(fā)的SNP標記是兩群體間高FST值的標記，應當具有更高的解析力。這2個群體間之所以出現(xiàn)小而不顯著的FST值，可能是由于開發(fā)SNP時采用的樣本量較小。開發(fā)SNP標記時選取的是小樣本，丹東群體和三沙群體各12尾，而后采用大樣本進行SNP分型。小樣本檢測到的離散位點可能包含統(tǒng)計學誤差，導致同樣的SNP標記在大樣本中開展群體遺傳學分析時不能檢測到顯著的遺傳分化。此外，由于SNP標記只有2個等位基因，需通過使用大量標記來提高其對群體遺傳結(jié)構的解析力，因此本研究中分析的SNP位點較少也可能是檢測到的遺傳分化水平低的原因。

除了用于研究群體遺傳結(jié)構，離散位點標記對于本地適應性研究也十分重要。日本鰻鱺作為隨機交配物種[22-25]的典型代表，各地理群體均為同一基因庫隨機分配，并不存在中性遺傳分化。因此在離散位點上檢測到的群體間分化的信號為其單一世代內(nèi)受自然選擇作用的結(jié)果。這使其成為研究本地適應性問題的理想材料。目前已有研究使用SNP標記對鰻鱺屬魚類的本地適應性開展研究[40-42]，然而SNP標記資源在日本鰻鱺中尚屬空白。本研究首次通過二代測序技術開發(fā)了一批離散SNP標記，這些SNP標記是基于丹東群體和三沙群體篩選的高FST值的分子標記，有可能與參與日本鰻鱺對本地環(huán)境的適應，因此可以作為候選分子標記應用到日本鰻鱺的本地適應性研究中，對深入理解微時間尺度內(nèi)生物的適應性進化問題具有重要意義。

4 結(jié)語

本研究首次通過二代測序技術開發(fā)了一批離散SNP標記。這些標記大多符合哈溫平衡，且標記間不存在連鎖不平衡現(xiàn)象，符合群體遺傳學分析的要求，可用于解析日本鰻鱺的群體遺傳結(jié)構。另外，這些SNP標記是基于丹東群體和三沙群體篩選的高FST值的分子標記，極有可能與參與日本鰻鱺對本地環(huán)境的適應，因此可以作為候選分子標記應用到日本鰻鱺的本地適應性研究中。

致謝：感謝李玉龍在數(shù)據(jù)處理中給予的幫助。

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