野拔子凈油提取工藝優(yōu)化及其在卷煙中的應(yīng)用效果

顏克亮　陳微　孫勝南　楊瑩　胡武　陳興　陳志雄　周博　凌軍　黃艷　張?zhí)鞐?/p>

摘要：[目的]優(yōu)化超聲波輔助提取野拔子凈油的工藝條件，并分析其在卷煙中的應(yīng)用效果，為野拔子在卷煙中的進一步應(yīng)用提供參考依據(jù)。[方法]以野拔子為原料，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化超聲波輔助乙醇提取凈油的工藝條件，并進行成分分析；將野拔子凈油添加至卷煙中，通過卷煙感官評價篩選最佳添加量。[結(jié)果]超聲波輔助提取野拔子凈油的最佳工藝條件為：提取溫度50℃，提取時間40 min，料液比1：9，超聲波功率500 w，各因素影響排序為提取溫度>超聲波功率>料液比>提取時間；經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用儀分析鑒定，野拔子凈油共鑒定出40種成分，主要含有脫氫香薷酮（28.641%）、3，3-二甲基丙烯酸（9.080%）、5-甲基-2-乙酰基呋喃（4.790%）、芳樟醇（4.224%）、3-甲基-2-（5H）-呋喃酮（3.642%）、氧化芳樟醇（3.079%）、香薷酮（1.436%）、新植二烯（1.031%）等揮發(fā)性物質(zhì)。將野拔子凈油應(yīng)用于卷煙中，具有豐富和協(xié)調(diào)煙香，能提高香氣質(zhì)，改善吃味，使煙氣柔和細膩及減刺除雜等作用，且以3 mg/kg添加量為宜。[結(jié)論]優(yōu)化條件下超聲波輔助提取的野拔子凈油對提升卷煙吸食品質(zhì)有良好效果，可用于卷煙加香和品質(zhì)的提升。

關(guān)鍵詞：野拔子；凈油；工藝優(yōu)化；揮發(fā)性成分；應(yīng)用

中圖分類號：S572.09.9 文獻標志碼：A 文章編號：2095—1191（2018）03-0549-07

0引言

[研究意義]野拔子（Elsholtzia rugulosa Hemsl.）系唇形科香薷屬植物，主要分布在云南、四川、貴州及廣西等地，不僅具有抗病毒、抗腫瘤等多種活性作用（郭志琴等，2010），還能治療傷風感冒、胃炎、痢疾等病癥，特別在云南少數(shù)民族地區(qū)具有藥用植物和代茶植物的雙重身份（付立卓等，2010）。野拔子作為地域性較強的特色天然植物，若能將其凈油作為天然香料應(yīng)用于卷煙加香加料技術(shù)中，對于國內(nèi)其他特色天然植物的綜合開發(fā)及中式卷煙的發(fā)展均具有重要實際意義。[前人研究進展]近年來，已有不少學者對野拔子進行相關(guān)研究，但主要集中在化學成分（趙勇等，2004；劉瑩等，2009）、藥理活性（付立卓等，2010）、藥用標準（趙霞，2016）等方面。在野拔子提取方面也有一些報道，彭永芳等（2009）利用超聲波輔助水蒸汽蒸餾工藝提取野拔子揮發(fā)油，并通過正交設(shè)計優(yōu)化提取工藝，即在提取溫度70℃、提取時問80 min、加水倍量為8倍的工藝條件下，野拔子揮發(fā)油的提取效果最佳。文美瓊等（2010）采用醇提酸沉法對野壩子花中總黃酮進行提取，并通過分光光度法測定黃酮含量，確定野壩子花中黃酮類物質(zhì)對活性氧自由基具有較強的清除作用。李麗等（2015a）研究水蒸汽蒸餾結(jié)合微波提取野壩子葉精油的方法，并通過體外抗菌試驗證明該精油對測試菌株具有較好的抑菌能力；之后李麗等（2015b）通過正交試驗優(yōu)化微波輔助提取野壩子莖葉總黃酮的工藝，發(fā)現(xiàn)最佳工藝條件下總黃酮的平均提取率達2.98%，高于傳統(tǒng)回流法獲得的提取率。[本研究切入點]目前，關(guān)于野拔子揮發(fā)油和總黃酮的提取、分析等相關(guān)研究均有報道，但未見野拔子凈油提取方面的研究；此外，關(guān)于特色天然植物提取物應(yīng)用于卷煙的研究已有較多報道（魏杰等，2013；孟祥東，2014；黃東業(yè)等，2016；黃善松等，2017；徐世濤等，2017），但未見野拔子提取物在卷煙應(yīng)用方面的研究報道。[擬解決的關(guān)鍵問題]利用正交試驗優(yōu)化野拔子凈油提取工藝，并進行成分分析；再將其添加至卷煙中，通過卷煙感官評價篩選最佳添加量，為挖掘和綜合利用特色天然植物提供參考依據(jù)，也為中式卷煙加香加料研究提供天然香原料資源。

1材料與方法

1.1試驗材料

野拔子（2016年干品）購于廣東省普寧中藥材專業(yè)市場；試驗葉組煙絲（空白葉組2種，已加香加料葉組1種）由云南中煙工業(yè)有限責任公司提供。乙醇（食用級）購自中山市華士達生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：超聲波提取機LTCT-G（濟寧魯通超聲電子設(shè)備有限公司），中藥粉碎機BJ-800A（佛山市德瑪仕網(wǎng)絡(luò)科技有限公司），低溫冰箱MDF-U5411[三洋電機（中國）有限公司]，冷凍離心機DL-6M（湘儀離心機儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)濃縮器（上海申生科技有限公司），氣質(zhì)聯(lián)用儀6890-5973（美國安捷倫公司）。

1.2野拔子凈油提取

1.2.1工藝流程 野拔子→干燥、粉碎→稱取野拔子粉末→超聲波輔助乙醇提取→提取液過濾→濃縮得到野拔子浸膏→乙醇萃取精制→離心濃縮得到野拔子凈油，準確稱重。

1.2.2超聲波輔助乙醇提取野拔子凈油的單因素試驗 固定原料顆粒度60目、料液比1：6、提取溫度40℃、提取時間30 min、超聲波功率300 w。固定其他條件，分別考察原料顆粒度（20、40、60、80和100目）、提取溫度（30、40、50、60和70℃）、提取時間（20、30、40、50、60和70 min）、料液比（1：5、1：6、1：7、1：8、1：9和1：10）、超聲功率（100、200、300、400和500w）對野拔子凈油提取率的影響。每組試驗重復3次，取平均值。

野拔子凈油提取率（%）=野拔子凈油質(zhì)量（g）/野拔子粉末質(zhì)量（g）

1.2.3正交工藝優(yōu)化 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取4個影響較大的因素進行L9（3。）正交試驗，每組試驗重復2次，取平均值，通過其結(jié)果對超聲波輔助乙醇提取野拔子凈油工藝參數(shù)進行優(yōu)化。因素水平詳見表1。

1.3GC-MS測定條件

氣相色譜條件：色譜柱HP-INNOWAX（30 mx250 gmxO.25 gm）；進樣口溫度250℃；載氣為氮氣；柱溫箱為程序升溫，起始溫度40℃保持1 min，以3～C/min升至100℃保持1 min，以2℃/min升至250℃并保持1 min；分流比20：1；橫流模式，流速為1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度25℃；四級桿溫度150℃；EI離子源70 eV；質(zhì)量掃描范圍30-490 u；采用NISTl4進行檢索。

1.4野拔子凈油在卷煙中的加香應(yīng)用

用70%乙醇稀釋野拔子凈油，選取梯度添加用量（0、1、3和5 mg/kg）噴于空白葉組煙絲中，平衡24 h后將空白葉組煙絲和加香后的葉組煙絲卷制成煙，并置于恒溫恒濕器[溫度（22±1）℃，相對濕度（60±2）%]中平衡48 h，請評吸小組（12人）進行卷煙感官評價。

用95%乙醇稀釋野拔子凈油后，按照3 mg/kg用量噴灑于已加香加料的試驗葉組煙絲上，將原加香加料葉組和再次加香后的試驗葉組卷制成煙支在恒溫恒濕器[溫度（22±1）℃，相對濕度（60±2）%]中平衡48 h，請評吸小組（12人）進行卷煙感官評價。

1.5統(tǒng)計分析

采用Excel 2010對單因素試驗結(jié)果進行處理并制圖，SPSS 17.0對正交試驗結(jié)果進行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1原料顆粒度對提取效果的影響 由圖1可看出，隨著原料顆粒度的增加，野拔子凈油提取率逐漸升高，當原料顆粒度大于60目后，提取率上升趨勢趨于平緩；結(jié)合對提取物的香氣評價在60目時豐富性及醇和感較優(yōu)，且考慮實際操作過程中粉碎目數(shù)較高時，對提取后的進一步過濾工藝造成負面影響，因此選擇原料顆粒度為60目。

2.1.2提取溫度對提取效果的影響 圖2顯示，提取溫度的升高，加速了物料間的擴散運動，野拔子凈油提取率也隨之升高，但提取溫度超過50℃后，提取率趨于平緩；且通過比較不同溫度條件下提取凈油的香氣發(fā)現(xiàn)，高溫不利于高品質(zhì)凈油的提取，較高溫度對野拔子致香成分有影響，因此為了確保較高的提取率和凈油的香氣品質(zhì)，選擇50℃為宜。

2.1.3提取時間對提取效果的影響 圖3顯示，隨

2.1.4料液比對提取效果的影響 從圖4可看出，隨著料液比的增大，野拔子與有機溶劑接觸面濃度差越大，油脂越易滲出，故野拔子凈油提取率不斷升高，但料液比增至1：7后，提取率的上升趨勢減緩。料液比過大，提取液在濃縮過程損失的香氣成分多，在確保較高提取率和香氣品質(zhì)條件下，料液比選擇1：7最合適。降，可能是產(chǎn)生空穴的時間極短，來不及產(chǎn)生空化效應(yīng)的緣故，從而導致野拔子凈油的提取效果減緩。

2.2正交試驗結(jié)果

通過單因素試驗確定原料顆粒度為60目，95%乙醇為溶劑，選定提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、超聲波功率（D）4項為考察因子，野拔子凈油提取率為考察指標，進行4因素3水平正交試驗。由表2可知，影響野拔子凈油提取率的各因素主次排序為提取溫度（A）>超聲波功率（D）>料液比（C）>提取時間（B），野拔子凈油提取最佳工藝組合為A281C3D3，即提取溫度50℃、提取時間40 min、料液比1：9、超聲波功率500 w；由表3可知，提取溫度的P<0.05，表明提取溫度對野拔子凈油提取率影響顯著，其余3個因素P>O.05，對野拔子凈油提取率無顯著影響。

2.3驗證試驗結(jié)果

按最佳提取工藝進行4次平行試驗，野拔子凈油提取率分別為14.15%、14.12%、14.28%和14.20%，平均提取率為14.19%，高于正交試驗設(shè)計中任一組合的提取率，因此確定AzBlC3D3為最佳提取方案。

2.4野拔子凈油主要揮發(fā)性成分分析結(jié)果

對野拔子凈油進行成分分析，其總粒子流圖如圖6所示，分析結(jié)果見表4。野拔子凈油共檢測到40種成分，占總峰面積的94.819%，在已確定的揮發(fā)性成分中，主要由萜烯類、醇類、酮類、酯類、醛類、雜環(huán)類化合物、有機酸、高級脂肪酸及其酯類成分組成；其中，萜烯類化合物有6種，相對含量較高的分別是反式角鯊烯（1.113%）、新植二烯（1.031%）和石竹烯（0.756%）；醇類化合物有6種，相對含量較高的分別是芳樟醇（4.224%）、氧化芳樟醇（3.079%）和葉綠醇（2.058%）；酮類化合物有6種，相對含量較高的分別是脫氫香薷酮（28.641%）、3-甲基-2-（5H）-呋喃酮（3.642%）、香薷酮（1.436%）和胡椒酮（0.986%），其中脫氫香薷酮是鑒別出的所有揮發(fā)性成分中相對含量最高的化合物；酯類化合物有5種，以其中3種高級脂肪酸酯類化合物的相對含量較高，分別是亞麻酸乙酯（1.519%）、棕櫚酸乙酯（0.907%）和亞油酸乙酯（0.705%）；醛類化合物僅有2種，為苯甲醛（0.118%）和5一羥甲基糠醛（0.338%），相對含量稍低；雜環(huán)類化合物以呋喃類化合物為主，共有2種，分別是5-甲基-2-乙酰基呋喃（4.790%）和2，3-二氫苯并呋喃（0.885%）；有機酸化合物共4種，以3，3-二甲基丙烯酸（9.080%）相對含量較高；高級脂肪酸及其酯類成分品種豐富，共有10種，主要有亞麻酸（10.793%）、棕櫚酸（5.189%）、亞油酸（4.461%）和油酸（1.123%）。

2.5野拔子凈油在卷煙中應(yīng)用的感官評價結(jié)果

2.5.1野拔子凈油香氣特征 取1g野拔子凈油，加入19 g 95%乙醇振蕩溶解后在比色管中進行觀察，并使用辯香紙蘸取溶解后的溶液進行嗅香。稀釋后的野拔子凈油為墨綠色透明液體，具有特殊的青香兼清甜香氣，并帶有花香、果香、干草香、壤香等香韻，香氣豐富持久。

2.5.2野拔子凈油在卷煙空白葉組中應(yīng)用的感官評價結(jié)果 由表5可知，野拔子凈油應(yīng)用在卷煙中可以協(xié)調(diào)、豐富煙香和提升香氣質(zhì)，賦予卷煙清甜感和花香、果香、青香、干草香等韻調(diào)，且具有掩蓋雜氣、改善吃味等效果，可作為卷煙加香的天然香原料，在卷煙中的添加量以3 mg&g為佳。

2.5.3野拔子凈油在已加香加料卷煙葉組中應(yīng)用的感官評價結(jié)果 由圖7可知，原加香加料葉組在添加野拔子凈油后，風格特征中的清香、果香和甜香香韻有所增加，而其他香韻并沒有因為野拔子凈油的應(yīng)用而減弱，說明在卷煙中添加3 mg/kg野拔子凈油具有較好的提升香氣量和協(xié)調(diào)煙香效果。從圖8可看出，野拔子凈油的應(yīng)用使得原加香加料葉組在吃味及刺激性方面有一定提升，在香氣、豐富性及雜氣方面也有相對突出的應(yīng)用效果。

3討論

現(xiàn)階段，我國煙草行業(yè)大力開發(fā)天然植物香料應(yīng)用于中式卷煙中，以提升卷煙的安全性和個性特色。在天然植物凈油的開發(fā)和應(yīng)用方面，已有不少學者進行研究，如龐登紅等（2012）通過水提醇沉法制備芹菜籽凈油，將其應(yīng)用于卷煙中能賦予卷煙辛香香韻、豐富煙香，并能有效提升煙氣狀態(tài)和改善吃味；蔡波等（2013）使用超聲波工藝提取香根草凈油，將其應(yīng)用于卷煙加香中，評價結(jié)果顯示香根草凈油可賦予卷煙清甜香韻，并能協(xié)調(diào)煙香和改善吃味；張勝等（2014）采用頂空萃取/氣相色譜聯(lián)用技術(shù)對亞臨界貢菊凈油的化學組分進行分析，并將其添加到卷煙中，結(jié)果表明，貢菊凈油能對多個品牌卷煙起到增加甜潤感、豐富柔和煙香等積極的改善作用。本研究利用超聲波輔助提取野拔子凈油，通過單因素和正交試驗確定野拔子凈油超聲波輔助提取的最佳工藝條件，發(fā)現(xiàn)在最佳工藝條件下野拔子凈油的提取率、香氣和應(yīng)用效果均達到優(yōu)異的平衡度，與前人的研究結(jié)果（龐登紅等，2012；蔡波等，2013；張勝等，2014）基本一致，所制備的天然植物凈油應(yīng)用在卷煙中可賦予卷煙一定的特色香韻和增強不同的功能性效果。

本研究運用GC/MS對野拔子凈油中的主要揮發(fā)性成分進行分析，共鑒別出40種成分，其中多種成分對卷煙香氣及吃味等方面具有增益效果，如新植二烯、芳樟醇、氧化芳樟醇、石竹烯、苯甲醛、5一羥甲基糠醛、多種雜環(huán)類化合物和高級脂肪酸及其酯類化合物等。新植二烯是煙葉中的重要致香物質(zhì)和增香劑，兼具香氣前體和香氣載體的重要功能；芳樟醇具有賦予卷煙青香、花香、果香等香韻，提調(diào)辛香和清甜感，協(xié)調(diào)、豐富煙香，矯正吸味等作用（余振華等，2010）；氧化芳樟醇可賦予卷煙花香和木香等韻調(diào)，同時具有修飾煙氣狀態(tài)的應(yīng)用效果；石竹烯在卷煙中能改進和提調(diào)煙香的自然風味，并能賦予一定的清甜感效果；大量存在的脂肪酸及其酯類化合物是抑制煙葉辛辣刺激性的重要化學成分；苯甲醛在卷煙中具有協(xié)調(diào)和烘托煙香的作用。通過卷煙感官評價對野拔子凈油的香氣、應(yīng)用效果（對卷煙感官香氣風格及感官質(zhì)量特征的影響）進行分析，發(fā)現(xiàn)野拔子凈油在卷煙中具有增香、提質(zhì)和矯味等應(yīng)用效果，深具優(yōu)良天然煙用香料的特質(zhì)，為中式卷煙的發(fā)展提供了更加豐富的天然香料資源。

為了對野拔子進行更深入的研究，在后續(xù)研究中，可增加多種技術(shù)方法對野拔子進行提取，分析不同技術(shù)制備的野拔子提取物中的主要化學成分，結(jié)合卷煙感官評價探究主要成分在卷煙中的致香機理，以確定更適宜卷煙應(yīng)用的野拔子天然香料開發(fā)技術(shù)路線。

4結(jié)論

優(yōu)化條件下超聲波輔助提取的野拔子凈油對提升卷煙吸食品質(zhì)有良好效果，可用于卷煙加香和品質(zhì)的提升。

（責任編輯 羅麗）