冰核細(xì)菌分離鑒定及拮抗菌篩選

趙晨心 丁海霞 彭麗娟

摘要 為了解貴州植物上冰核細(xì)菌的種類(lèi)及分布，采用平板稀釋法分離細(xì)菌和拮抗菌、小液滴凍結(jié)法鑒定冰核細(xì)菌、雙層平板法篩選拮抗菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征、生理生化指標(biāo)結(jié)合16S rDNA序列對(duì)比分析等方法鑒定冰核細(xì)菌和拮抗菌的種類(lèi)。結(jié)果表明，從貴州59種霜凍植物上分離到7株冰核細(xì)菌，從32份土壤中篩選到3株拮抗菌。經(jīng)鑒定，7株冰核細(xì)菌中，1株為成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans），1株為菠蘿泛菌（Pantoea ananatis），1株為熒光假單胞（Pseudomonas fluorescens），2株為丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae），2株為綠黃假單胞菌（Pseudomonas viridiflava）。3株拮抗菌中，1株放線菌為暗產(chǎn)色鏈霉菌（Strepto-myces phaeochromogenes），2株細(xì)菌均為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

關(guān)鍵詞 冰核細(xì)菌；拮抗菌；鑒定；生物防治

中圖分類(lèi)號(hào)：S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-3305（2018）04-059-06

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2018.04.024

Abstract Seven strains that identified as ice nucleation active bacteria by droplet freezing method were isolated from 59 kinds of frost plants in Guizhou Province. Three strains of antagonistic bacteria were screened from 32 soil samples by double-layer plate method. The species of ice nucleation active bacteria and antagonistic bacteria were identified by morphological characteristics， physiological and biochemical indicators combined with 16S rDNA sequence comparative analysis methods. It was identified that among the seven strains， one was Pantoea agglomerans， one was Pantoea ananatis， one was Pseudomonas fluorescens， two were Pseudomonas syringae and two were Pseudomonas viridiflava. Among the three antagonistic bacteria， one actinomycete was Streptomyces phaeochromogenes， and both bacteria were Bacillus amyloliquefaciens. Through this study， the species and distribution of ice nucleation on some plants in Guizhou Province were preliminary understood.

Key words Ice nucleation active bacteria； Antagonistic bacteria； Identification； Biological control

霜凍能在幾小時(shí)內(nèi)毀掉大片農(nóng)作物， 是一種嚴(yán)重的自然災(zāi)害[1]，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自1974年Maki等[2]首次從赤楊[Alnus japonica （Thunb.） Steud.]樹(shù)葉中分離到冰核細(xì)菌（Ice nucleation active bacteria，INA細(xì)菌）以來(lái)，冰核細(xì)菌引起了國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注，深入研究了冰核細(xì)菌種類(lèi)、影響成冰活性因素和冰核細(xì)菌分子生物學(xué)特性[3]等方面的內(nèi)容。冰核細(xì)菌廣泛腐生于植物表面，可在-5～-2℃時(shí)誘發(fā)植物細(xì)胞水結(jié)冰而發(fā)生霜凍[4]。國(guó)內(nèi)外大量研究證明[5-9]冰核細(xì)菌是破壞植物的過(guò)冷卻狀態(tài)，誘發(fā)和加重植物霜凍的重要因素[10-12]。

貴州位于云貴高原東側(cè)，地處中低緯度地區(qū)，屬亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)型氣候，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)而言，既有豐富多樣的立體氣候資源，也有多發(fā)的氣象災(zāi)害[13]。霜凍對(duì)貴州省農(nóng)業(yè)發(fā)展造成了很大影響。如2005年發(fā)生在銅仁市、黔東南州部分縣市的低溫冷凍災(zāi)害，其中萬(wàn)山出現(xiàn)了歷史罕見(jiàn)的雪凝天氣，農(nóng)作物受災(zāi)嚴(yán)重[14]。筆者從貴州4個(gè)市、州采集發(fā)生霜凍的植物組織分離冰核細(xì)菌，初步了解貴州植物上冰核細(xì)菌的種類(lèi)及分布情況，并從土壤中分離細(xì)菌和放線菌，篩選拮抗冰核細(xì)菌的拮抗菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本采集 2014年12月至2015 年的3月，以及2015年12月至2016年的3月，從貴州省貴陽(yáng)市、六盤(pán)水市、黔西南州、銅仁市等4個(gè)市、州的12個(gè)地點(diǎn)采集了59種霜凍植物標(biāo)本（表1），于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 土樣采集 從貴州省貴陽(yáng)市和六盤(pán)水市8個(gè)地點(diǎn)采集了32份土樣（表2），用以分離拮抗菌。分離放線菌的土樣在通風(fēng)處晾干。

1.2 冰核細(xì)菌與拮抗菌分離

參考Goto等方法分離冰核細(xì)菌[15]。參考崔汝強(qiáng)等方法分離拮抗細(xì)菌[16]，采用稀釋平板法分離拮抗細(xì)菌和放線菌[17]。

1.3 冰核活性的測(cè)定

采用Vali發(fā)明[18]，由Lindow[8]改進(jìn)的小液滴凍結(jié)法測(cè)定冰核活性。

1.4 篩選冰核細(xì)菌拮抗菌

采用雙層平板打孔法[19]篩選冰核細(xì)菌的拮抗細(xì)菌和放線菌，十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.5 鑒定方法

1.5.1 形態(tài)與生理生化鑒定 冰核細(xì)菌和拮抗細(xì)菌鑒定主要參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[20]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)（第八版）》[21]進(jìn)行。放線菌鑒定參考《放線菌的分類(lèi)與鑒定》進(jìn)行[22]。

1.5.2 分子鑒定 刮取培養(yǎng)物，參考Bacterial gDNA kit試劑盒（Biomiga，GD2411-01）的步驟提取DNA，采用通用引物27F和1492R、gyrA-F和gyrA-R（引物序列見(jiàn)表3）[23]，擴(kuò)增后采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，確定條帶正確后，將目的片段純化回收，并與pMD19-T 載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐抗性平板上進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選，送樣測(cè)序。將所測(cè)定的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析[24]。

采用最大簡(jiǎn)約法（MP）分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，運(yùn)用PAUP 4.0 BETA建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[25]。

拮抗細(xì)菌分子鑒定方法與冰核細(xì)菌鑒定方法相同，加測(cè)gyrA基因序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰核細(xì)菌的分離

從貴州省貴陽(yáng)市、六盤(pán)水市、黔西南州和銅仁市等4個(gè)市、州采集的59種霜凍植物標(biāo)本上，分離獲得7株冰核細(xì)菌，編號(hào)為B-A、B-B、B-C、B-D、B-E、B-F和B-G。

B-A寄主植物為八角金盤(pán)（F. japon-ica），采集地點(diǎn)盤(pán)縣水塘鎮(zhèn)丹霞山；B-B寄主植物為白菜（B. pekinensis），采集地點(diǎn)貴陽(yáng)市高坡鄉(xiāng)；B-C寄主植物為白花苜蓿（T. repens），采集地點(diǎn)貴陽(yáng)市黔靈公園； B-D寄主植物為茼蒿（C. coronarium），采集地點(diǎn)六盤(pán)水市鐘山區(qū)；B-E寄主植物為柑橘（C. reticulata），采集地點(diǎn)貴陽(yáng)市小車(chē)河公園；B-F的寄主植物為白菜（B. pekinensis），采集地點(diǎn)貴陽(yáng)市高坡鄉(xiāng)；B-G寄主植物是矮牽牛（P. hybrida），采集地點(diǎn)貴陽(yáng)市景云山。

2.2 冰核細(xì)菌拮抗細(xì)菌的篩選

從貴陽(yáng)市、六盤(pán)水市采集32份土樣，分離放線菌和細(xì)菌。經(jīng)初篩與復(fù)篩，篩選出3株對(duì)冰核細(xì)菌有抑制效果的拮抗菌：1株放線菌，編號(hào)為F1；2株細(xì)菌，編號(hào)為XD和XF。F1、XD和XF對(duì)冰核細(xì)菌B-C都有一定的拮抗作用（圖1）。對(duì)冰核細(xì)菌B-G有拮抗效果的只有XF（圖2）。十字交叉法測(cè)量抑菌圈，XF對(duì)B-C的拮抗效果最好，抑菌圈平均直徑達(dá)18.35 mm；XD對(duì)B-C的拮抗效果次之，抑菌圈平均直徑是17.81 mm； F1對(duì)B-C的拮抗效果最弱，抑菌圈平均直徑是12.67 mm。XF對(duì)B-G抑菌圈平均直徑是13.65 mm。

2.3 冰核細(xì)菌鑒定

2.3.1 冰核細(xì)菌的形態(tài)與特征生理生化反應(yīng) 對(duì)7株冰核細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)特征觀察和生理生化反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，B-D和B-E的需氧性反應(yīng)為兼性厭氧，與其他5株細(xì)菌不同，G-。

2.3.2 16S rDNA序列分析 對(duì)7株冰核細(xì)菌的16S rDNA片段進(jìn)行測(cè)序，在NCBI上用BLAST 程序與登錄的序列進(jìn)行比對(duì)。7株冰核細(xì)菌中，2株為泛菌屬（Pantoea），5株為假單胞屬（Pseudomonas）。

圖3為假單胞屬（Pseudomonas）5個(gè)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，圖4為泛菌屬（Pantoea）2個(gè)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

由圖3可知，B-B與熒光假單胞（P. fluorescens）在一個(gè)類(lèi)群；B-C、B-F與丁香假單胞（P. syringae）在一個(gè)類(lèi)群；B-A、B-G與綠黃假單胞菌（P. virid-iflava）在一個(gè)類(lèi)群。

結(jié)合形態(tài)特征與生理生化反應(yīng)結(jié)果，可確定菌株B-B為熒光假單胞（P. fluorescens），菌株B-C和B-F為丁香假單胞（P. syringae），菌株B-A和B-G是綠黃假單胞菌（P. viridiflava）。

由圖4可知，B-E與成團(tuán)泛菌（P. agglomerans）在一個(gè)類(lèi)群； B-D與菠蘿泛菌（P. ananatis）在一個(gè)類(lèi)群。結(jié)合形態(tài)特征與生理生化反應(yīng)結(jié)果，可確定菌株B-E為成團(tuán)泛菌（P. agglomerans）， 菌株B-D為菠蘿泛菌（P. ananatis）。

2.4 冰核細(xì)菌拮抗菌的鑒定

2.4.1 放線菌形態(tài)特征 形態(tài)特征：放線菌 F1在高氏合成1號(hào)培養(yǎng)基上，氣生菌絲灰白色，基內(nèi)菌絲褐色，可溶性色素暗褐色。顯微鏡下觀察，孢子鏈直或柔曲，孢子卵圓形，表面光滑。

放線菌F1在6種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀、菌落顏色和色素顏色等特征見(jiàn)表5和圖5。

2.4.2 放線菌分子鑒定 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖6。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中可知，F(xiàn)1與暗產(chǎn)色鏈霉菌（S. phaeochromogenes）在一個(gè)類(lèi)群。

結(jié)合16S rDNA序列分析與菌落形態(tài)、培養(yǎng)特征、氣生菌絲和基內(nèi)菌絲的顏色、可溶性色素的有無(wú)及顏色、并采用插片法觀察孢子鏈及其孢子的形狀，放線菌F1鑒定為暗產(chǎn)色鏈霉菌（S. phaeochromogenes）。

2.4.3 拮抗細(xì)菌的鑒定

2.4.3.1 拮抗細(xì)菌形態(tài)特征和生理生化測(cè)試。油鏡下觀察2株拮抗細(xì)菌，菌體均呈直桿狀，G+，都能產(chǎn)芽孢，芽孢為藍(lán)綠色，呈卵圓形或橢圓形。

由菌株XD、XF的生理生化反應(yīng)結(jié)果（表6）可以看出，菌株XD與XF的M.R試驗(yàn)結(jié)果不同，其余反應(yīng)均一致。

2.4.3.2 拮抗細(xì)菌分子鑒定。將2株拮抗細(xì)菌gyrA基因序列與16s rDNA序列調(diào)整后拼接在一起，形成2條多基因序列，將這2條多基因序列與其他菌株序列一起用PAUP4.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖7），進(jìn)行多基因分析。

由圖7可知，XF、XD與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）在一個(gè)類(lèi)群。

結(jié)合2株芽孢桿菌形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)以及16S rDNA和gyrA多基因分析，菌株XF和XD為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。

3 討論

從6種霜凍植物上分離到7株冰核細(xì)菌，貴陽(yáng)市高坡鄉(xiāng)白菜上分離到2株；7 株冰核細(xì)菌中，2株為泛菌屬（Pan-toea），5株為假單胞屬（Pseudomonas）；從分離冰核細(xì)菌的地點(diǎn)看，貴陽(yáng)市分離到5株，水城市分離到2株，銅仁市和興義市未分離到。

韋建福等在1992—1994年，采集27種植物分離到歐文氏菌屬（Erwinia）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）和假單胞菌屬（Pseudomonas）3個(gè)屬的冰核細(xì)菌[28]；黃曉琴等從茶樹(shù)上分離到菠蘿泛菌（P. ananatis）和成團(tuán)泛菌（P. agglom-erans）2種冰核細(xì)菌[29]。該試驗(yàn)未分離到歐文氏菌屬（Erwinia）和黃單胞菌屬（Xanthomonas）的冰核細(xì)菌。

從土壤中分離到3株拮抗菌，2株為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefa-ciens），1株為暗產(chǎn)色鏈霉菌（S. phaeo-chromogenes）。

解淀粉芽孢桿菌在其生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生一系列脂肽類(lèi)物質(zhì)、聚酮類(lèi)物質(zhì)還有具有蛋白活性的抑菌物質(zhì)，包括表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和芬薺素（fengycin）等幾大類(lèi)物質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒和支原體有良好的抑制作用[30-31]。該試驗(yàn)從土壤中分離的2株解淀粉芽孢桿菌對(duì)冰核細(xì)菌有很好的抑制作用，可能是解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的一系列抑菌物質(zhì)對(duì)冰核細(xì)菌產(chǎn)生了抑制作用。

放線菌是土壤里的優(yōu)勢(shì)菌種，并且種類(lèi)繁多，能產(chǎn)生大量的酶、抗生素和酶抑制劑等生物活性物質(zhì)，由于放線菌這些特性，在植物病害的生物防治方面有著廣泛的應(yīng)用[32]。而放線菌目（Actinomycetes）中最大的一個(gè)屬是鏈霉菌屬（Streptomycetes）。鏈霉菌的生防作用主要靠其產(chǎn)生的抗生素實(shí)現(xiàn)，此外，還可產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，包括蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和果膠酶等多種胞外水解酶[33]。

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責(zé)任編輯：鄭丹丹