腐皮鐮孢霉菌侵染及保鮮劑處理對秋葵相關(guān)抗性酶的影響

辛松林 秦文 孫傳紅 徐丹 黃倩 毛美丹 方子豪

摘要：為研究秋葵果實響應(yīng)外界脅迫反應(yīng)及合理利用果實抗性酶的保護功能，以川秋葵為試驗材料，采用人工接種腐皮鏈孢霉菌和保鮮劑處理的方法，研究秋葵果實抗性酶的變化。結(jié)果表明，POD、PPO、PAL、C4H、4CL、CAD和TAL參與了秋葵果實響應(yīng)腐皮鏈孢霉菌侵染和成熟衰老的反應(yīng)過程。4CL、POD、PPO在整個腐皮鏈孢霉菌侵染階段活性持續(xù)增高起著重要的防御作用;PAL、CAD在腐皮鏈孢霉菌侵染的4d內(nèi)活性增高，且在整個侵染階段都保持了較高的活性：C4H在腐皮鏈孢霉菌侵染的3d內(nèi)起著重要的防御作用：TA，在侵染24 h迅速啟動響應(yīng)反應(yīng)。不同保鮮劑對抗性酶活性表達的誘導(dǎo)作用不同，1-MCP與殼聚糖復(fù)合處理對維持果實抗病性和采后品質(zhì)的效果最好。

關(guān)鍵詞：川秋葵;腐皮鏈孢霉菌;保鮮劑;抗性酶

中圖分類號：S649

文獻標識碼：A

文章編號： 1000-4440（2018）05-1161-08

秋葵，又稱黃秋葵，屬于錦葵科秋葵屬一年生草本植物，由于其富含果膠、黃酮及人體必需氨基酸，具有一定的保健功能，因此廣受消費者喜愛，然而由于秋葵表面積大，果皮表面附有細密絨毛，很容易受到病原菌的侵染而加速秋葵的腐敗變質(zhì)，影響了貯藏時間。秋葵受到病原菌侵染后，組織會產(chǎn)生一系列復(fù)雜的生理生化變化，以維持自身代謝的動態(tài)平衡，增強對病原菌的抵抗能力。其主要機理為：病原菌通過侵染健康組織，誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧分子，大量積累的活性氧對植株造成氧化傷害。另一方面，植株自身的抗氧化防御系統(tǒng)同時發(fā)生作用，植株體內(nèi)的抗氧化物酶類如過氧化物酶（PPO）、多酚氧化（POD）等通過清除活性氧分子，從而誘導(dǎo)植株產(chǎn)生適應(yīng)性響應(yīng)。此外，苯丙烷代謝系統(tǒng)作為生成酚類物質(zhì)的主要次生代謝途徑，在植株抗逆境脅迫和適應(yīng)性防御反應(yīng)中起著重要作用。

秋葵果實對不同病原菌會表現(xiàn)出不同的抗感性，課題組前期對誘導(dǎo)秋葵果實在貯藏過程中腐敗的病原菌進行了研究，結(jié)果表明，腐皮鏈孢霉菌侵染是誘導(dǎo)果實腐敗的主要原因，并分離純化出腐皮鏈孢霉菌。腐皮鐮孢霉菌是常見的土壤習(xí)居菌，春天氣溫回升，土壤濕潤，菌核開始萌發(fā)產(chǎn)生子囊盤和子囊孢子，從而侵染植株根莖部或基部葉片及其他組織，發(fā)病后產(chǎn)生菌絲，受害病葉與鄰近健株接觸即可傳病。本試驗研究腐皮鐮孢霉菌侵染前后及保鮮劑處理對秋葵相關(guān)抗性酶的影響，探討秋葵在致病菌侵染和保鮮過程中相關(guān)抗性酶的變化規(guī)律，為進一步研究秋葵果實響應(yīng)外界脅迫反應(yīng)及合理利用果實抗性酶的保護功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秋葵（品種為川秋葵）：四川省植物工程研究院提供。選擇無傷口、無病蟲害、果莢長度6.0～8.0cm的果實，采摘后及時置于2～4℃保鮮庫中預(yù)冷備用。

腐皮鐮孢霉菌孢子懸浮液配制：腐皮鐮孢霉菌從貯藏過程中發(fā)病的秋葵果實中分離獲得，經(jīng)純化培養(yǎng)后，在PDA培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)6d，轉(zhuǎn)入含有10ml 0.01% Tween 20無菌水的50ml三角瓶中，在微型旋渦混合器上振蕩15s，再用雙層紗布過濾，濾液用血球計數(shù)板計數(shù)，算出孢子懸浮液的含菌量后，最終稀釋至含菌量為1ml lxl05孢子的孢子懸浮液，備用。

主要試劑：殼聚糖（脫乙酰度≥90%），購于成都科龍化工試劑廠：安喜布（有效質(zhì)量濃度0.45mg/L，規(guī)格為25cmx20cm），購于蘭州嘉誠生物技術(shù)有限公司：其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-3200掃描型紫外/ 可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司產(chǎn)品），冷凍高速離心機（美國Thermo公司產(chǎn)品），恒溫水浴鍋，電子天平，培養(yǎng)箱等。

1.3 試驗方法

1.3.1 腐皮鏈孢霉菌侵染處理 選取預(yù)冷后的果實，將秋葵用75%酒精進行消毒，再用無菌水進行清洗，瀝干水分待用。用滅菌過的打孔器（直徑為1.0cm）在秋葵赤道部位表面打8個深度為1.0～1.5cm的孔，其中5個孔不接菌，其余5個孔中分別接入10μl含菌量為lml lxl05孢子的腐皮鐮孢霉菌孢子懸浮液，再用保鮮膜包住打孔部位人泡沫包裝箱，室溫（250C+2℃，濕度85%～ 95%）條件下貯藏，分別于接菌1d、2d、3d、4d、5d取樣，進行相關(guān)指標的測定。

1.3.2 保鮮樣品處理 將挑選好的秋葵分為4組，每組250個，分別進行以下處理：（1）殼聚糖涂膜處理：將秋葵浸于1.0%的殼聚糖涂膜液中60s，待秋葵果實表面完全浸潤，撈出后自然風(fēng)干;（2）l—MCP處理：將0.5片安喜布和250個秋葵同時放人帶有紙屑的泡沫箱（340mmx220mmx180mm）中，蓋緊蓋子，放置24h后取出秋葵;（3）1-MCP與殼聚糖復(fù)合處理：按照（1）的方法先處理秋葵，然后按照（2）的方法再次處理秋葵;（4）對照：以不做任何處理的秋葵為對照。

將上述3個處理和1個對照的秋葵置于常溫（20℃+1℃）條件下貯藏，相對濕度為85%～ 90%，每24 h取樣進行各相關(guān)指標的測定。

1.3.3 指標測定 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測定參照Liu等的方法，酶活性單位為U/（h·g），F(xiàn)W。4一香豆酰一輔酶A連接酶（4CL）活性測定參照朱明華等的方法，酶活性單位為U/（min·g），F(xiàn)W。肉桂酸一4羥化酶（C4H）活性測定參照Lamb和Rubery的方法，酶活性單位為U/（min·g），F(xiàn)W。肉桂醇脫氧酶（CAD）活性測定參照Momson等的方法，酶活性單位為U/（h·mg），F(xiàn)W。酪氨酸解氨酶（TAL）活性測定依據(jù)Wajahatullah Khan等的方法，酶活性單位為U/（h·mg），F(xiàn)W。過氧化物酶（POD）活性測定參照Jiang等的方法，酶活性單位為U/（min·g），F(xiàn)W。多酚氧化酶（PPO）活性測定參照Clairbone等的方法，酶活性單位為U/（min·g），F(xiàn)W。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組處理進行5個平行實驗。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件和Origin 8.1軟件進行分析處理，選用ANOVA進行鄧肯氏多重差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐皮鏈孢霉菌侵染及保鮮劑處理后秋葵果實POD活性的變化

由圖l可知，在貯藏期內(nèi)，腐皮鏈孢霉菌未侵染組POD活性變化緩慢，變化幅度較小;腐皮鏈孢霉菌侵染組POD活性呈持續(xù)上升的趨勢，POD活性在侵染第5d達到最大值，為6.43 U/（nun·g），F(xiàn)W，極顯著高于未侵染組（P<0.01）。這種現(xiàn)象的原因可能是秋葵受到腐皮鏈孢霉菌侵染后，迅速啟動相關(guān)防御體系，果實POD活性上升以保持秋葵體內(nèi)活性氧代謝平衡，維持膜結(jié)構(gòu)完整性，抵御病原菌對秋葵果實的侵害。

由圖2可知，貯藏期間，空白組的POD活性變化幅度較小.3個保鮮劑處理組的POD活性呈先升高后下降的變化趨勢，在貯藏第ld，1-MCP處理組和復(fù)合處理組的POD活性達到最大值，復(fù)合處理組POD活性與對照組差異達極顯著水平（P<0.01），1一MCP處理組POD活性與對照組差異顯著（P<0.05）：在貯藏第2d，殼聚糖處理組的POD活性達到最大值，與對照組差異顯著（P<0.05），說明1-MCP和殼聚糖能夠誘導(dǎo)POD的活性提高。隨著貯藏時間的延長，保鮮劑處理組的POD活性下降，在貯藏第Sd，對照組的POD活性高于1-MCP處理組和殼聚糖處理組。可能是因為貯藏前期保鮮劑處理能夠有效提高POD活性，及時清除細胞內(nèi)部的自由基，殼聚糖本身也是一種廣譜殺菌劑，這對提高秋葵適應(yīng)性防御能力非常重要：貯藏后期，由于病原菌的侵染和組織老化，對照組上調(diào)POD活性以響應(yīng)組織氧化和病原菌侵染的反應(yīng)過程。

2.2 腐皮鏈孢霉菌侵染及保鮮劑處理后秋葵果實PAL活性的變化

腐皮鏈孢霉菌侵染誘導(dǎo)PAL活性增強。由圖3可知，PAL在腐皮鏈孢霉菌侵染的第ld迅速啟動響應(yīng)反應(yīng)，活性迅速升高，隨后3d活性緩慢上升，在第4d達到最大值，為638.622 U/（h·g），F(xiàn)W，隨后下降;未侵染組PAL活性呈先升后降趨勢，在第4d出現(xiàn)最大值為454.895 U/（h·g），F(xiàn)W。PAL是苯丙氨酸代謝途徑的限速酶，參與了多種激發(fā)子誘導(dǎo)的抗性，其活性增強是一種自我保護機制的反應(yīng)，有助于抵御病原菌的侵染。

由圖4可知，PAL活性呈現(xiàn)波動性變化。貯藏前2d，3個保鮮處理組的PAL活性高于對照組。貯藏第3d，殼聚糖處理組的PAL活性低于對照組，并在此后保持相對較低的水平。這可能與殼聚糖對腐皮鏈孢霉菌孢子萌發(fā)和菌絲體生長具有抑制作用有關(guān)。貯藏第4d，1-MCP處理組PAL活性低于復(fù)合處理組和對照組，這可能與1-MCP作為植物生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)PAL表達有關(guān)。復(fù)合處理組的PAL活性在第4d達到最大值532.5U/（h·g），F(xiàn)W，這單純從1-MCP處理或是殼聚糖處理的結(jié)果很難解釋，推測有可能與二者協(xié)同作用有關(guān)，誘導(dǎo)因子促進酶的合成是由于刺激了酶蛋白mRNA的形成?？傮w而言，在貯藏初期，保鮮劑處理對于PAL的活性有顯著提高作用，可以提高秋葵內(nèi)部植保素和木質(zhì)素的生成速率，抵御組織的老化以及病原菌脅迫，隨著貯藏時間延長，秋葵組織內(nèi)部苯丙烷代謝趨于平衡穩(wěn)定狀態(tài)，保鮮劑對PAL活性的影響不大。

2.3 腐皮鏈孢霉菌侵染及保鮮劑處理后秋葵果實PPO活性的變化

由圖5可知，腐皮鏈孢霉菌未侵染組PPO活性在侵染期間呈先降后升的趨勢，侵染第3d的PPO活性最低，侵染第Sd的活性最高，為0.5489U/（min·g），F(xiàn)W。其變化原因可能是隨著貯藏時間的延長，秋葵組織衰老，產(chǎn)生活性氧的積累，誘導(dǎo)PPO活性升高去除自由基，延緩果實衰老進程。腐皮鏈孢霉菌侵染組果實PPO活性呈現(xiàn)連續(xù)上升的趨勢，在侵染第5d達到最大值，為0.6465U/（min·g），F(xiàn)W，與腐皮鏈孢霉菌未侵染組差異不顯著（P>0.05）。結(jié)果表明，PPO參與了秋葵果實響應(yīng)腐皮鏈孢霉菌侵染的反應(yīng)過程，在整個侵染期間起著重要的防御作用。

由圖6可知，1-MCP處理組和復(fù)合處理組在貯藏期間的PPO活性變化呈持續(xù)上升趨勢，在第Sd達到最大值;殼聚糖處理組在貯藏期間的PPO活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在第3d達到最大值。在貯藏第3d，保鮮處理組PPO活性均極顯著高于對照組（P<0.01），可能是因為保鮮劑能誘導(dǎo)秋葵組織內(nèi)部存在的PPO活性迅速上升，促進木質(zhì)素以及抗菌醌類物質(zhì)的形成，對植物組織起到一定的防御保護作用。由此可見，保鮮處理可以有效提高PPO活性。在貯藏后期，殼聚糖處理組PPO活性下降，這種現(xiàn)象的原因可能是隨著貯藏時間延長，調(diào)控PPO各個基因表達不同，活性隨之變化。對照組PPO活性在貯藏前3d變化不大，從貯藏第3d開始，PPO活性迅速上升，在第Sd達到最大值，可能由于病原菌的侵染、組織褐變，對照組PPO活性被誘導(dǎo)增強。

2.4 腐皮鏈孢霉菌侵染及保鮮劑處理后秋葵果實4CL活性的變化

由圖7可知，腐皮鏈孢霉菌未侵染組在整個試驗期間4CL活性上升緩慢，活性最大值為34.49U/（min·g），F(xiàn)W;腐皮鏈孢霉菌侵染組在侵染第1d 4CL活性顯著上升，隨后下降，第4d秋葵果實4CL活性達到最大值為83.35U/（ min·g），F(xiàn)W，與未侵染組差異達極顯著水平（P<0.01）。結(jié)果表明，4CL參與了秋葵果實響應(yīng)腐皮鏈孢霉菌侵染的反應(yīng)過程。

由圖8可知，隨著貯藏時間的延長，對照組和保鮮處理組的4CL活性總體呈上升的趨勢，經(jīng)保鮮劑處理的秋葵果實4CL活性始終高于對照組。復(fù)合處理組4CL活性最大值為61.57 U/（min·g），F(xiàn)W，1-MCP處理組4CL活性最大值為45.92 U/（min·g），F(xiàn)W，殼聚糖處理組4CL活性最大值為46. 27U/（min·g），F(xiàn)W，對照組4CL活性最大值為34.49U/（min·g），F(xiàn)W，復(fù)合處理組與對照組的4CL活性差異達極顯著水平（P<0.01），1-MCP處理組、殼聚糖處理組與對照組的4CL活性差異不顯著（P>0.05）。

感官評價分別從色澤、質(zhì)地、外觀和接受度等方面進行評價。由圖9可知，經(jīng)保鮮劑處理的秋葵果實經(jīng)過S d的貯藏，其品質(zhì)顯著優(yōu)于對照組?？赡芤驗?CL控制著苯丙烷主途徑向分支途徑的轉(zhuǎn)折，其代謝產(chǎn)物——酚類物質(zhì)可氧化成能對病原菌產(chǎn)生直接毒性的醌類物質(zhì)，隨著酚類物質(zhì)和木質(zhì)素的積累，能有效抑制病原菌的擴展。

2.5 腐皮鏈孢霉菌侵染及保鮮劑處理后秋葵果實C4H活性的變化

C4H是苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶。由圖10可知，腐皮鏈孢霉菌侵染秋葵果實后，C4H活性顯著上升，在侵染第3d達到最大值，為203.74U/（min·g），F(xiàn)W，隨后下降。未侵染組C4H活性在整個貯藏期間的上升趨勢緩慢，在貯藏第Sd達到最大值，為98.56 U/（min·g），F(xiàn)W。

與腐皮鏈孢霉菌未侵染組相比，侵染組C4H活性上升明顯，這種現(xiàn)象可能的原因是秋葵受到腐皮鏈孢霉菌侵染后，果實產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，誘導(dǎo)C4H活性增強，有利于苯丙烷代謝酚酸類物質(zhì)的合成，由此形成的香豆酸、阿魏酸和咖啡酸等酚酸，抵御腐皮鏈孢霉菌的侵染。

由圖11可知，對照組的C4H活性在貯藏前期呈波動式上升趨勢，在貯藏第3d，C4H活性出現(xiàn)最大值，為104.1U/（min·g），F(xiàn)W。保鮮劑處理組呈現(xiàn)先升后降的趨勢，殼聚糖處理組和1-MCP處理組均在貯藏第2d，C4H活性達到最大值，分別為127.0U/（min·g），F(xiàn)W和132.0U/（min·g），F(xiàn)W，而復(fù)合處理組則在貯藏第3d時C4H活性達到最大值，為164.0U/（min·g），F(xiàn)W。結(jié)果表明，C4H參與了秋葵果實響應(yīng)腐皮鏈孢霉菌侵染和保鮮劑處理的反應(yīng)過程，C4H活性升高是秋葵果實抵抗腐皮鏈孢霉菌侵染和延長貯藏期的重要機制之一。

2.6 腐皮鏈孢霉菌侵染及保鮮劑處理后秋葵果實CAD活性的變化

由圖12可知，腐皮鏈孢霉菌侵染組的CAD活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢，第4d急劇上升，CAD活性達到最大值，隨后CAD活性下降;而未侵染組呈逐步上升趨勢，在貯藏后期的CAD活性上升較快，可能是因為秋葵果實的老化誘導(dǎo)CAD活性上調(diào)。在整個侵染期間，侵染組的CAD活性較未侵染組高，說明腐皮鏈孢霉菌侵染能夠誘導(dǎo)秋葵果實上調(diào)CAD活性以抵抗侵染。

由圖13可知，對照組的CAD活性呈上升趨勢，在貯藏第3d急劇上升，活性最大值為338.28U/（h·mg），可能因為秋葵果實的快速衰老誘導(dǎo)了CAD活性的急劇上升。殼聚糖處理組和復(fù)合處理組的變化趨勢基本一致，呈逐步上升趨勢，最大值分別為135.98 U/（h·mg）和328.86 U/（h·mg）。1一MCP處理組的CAD活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢.CAD活性第3d達到最大值，為131.82 U/（h·mg）。結(jié)果表明，在貯藏前期，保鮮劑均可誘導(dǎo)秋葵果實CAD活性升高，提高抗病性，延緩果實衰老;貯藏中后期，由于果實的衰老，病原菌侵染，誘導(dǎo)了對照組CAD活性表達更高。

2.7 腐皮鏈孢霉菌侵染及保鮮劑處理后秋葵果實TAL活性的變化

由圖14可知，腐皮鏈孢霉菌侵染組的TAL活性呈波動式上升下降趨勢，未侵染組TAL活性呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，侵染組TAL最高活性與未侵染組TAL最高活性差異達極顯著水平（P<0.01）。TAL與PAL都屬于芳香族解氨酶家族，TAL能不經(jīng)C4H進行非氧化脫氨，直接將L-酪氨酸（L-Tyr）轉(zhuǎn)化為香豆酸，轉(zhuǎn)化過程中的某些變化可能使得TAL活性出現(xiàn)波動。

由圖15可知，復(fù)合處理組和1-MCP處理組TAL活性在貯藏前4d呈持續(xù)上升趨勢，復(fù)合處理組TAL活性最大值達到65.11 U/（h·mg），1-MCP處理組最大值為58.03U/（h·mg）;殼聚糖處理組TAL活性呈波動式上升，最大值出現(xiàn)在貯藏第4d，為42.09U/（h·mg）;對照組TAL活性呈先升高后降低的趨勢，最大值出現(xiàn)在貯藏第2d，為19.52U/（h·mg）。

3 討論

果實組織采收后由于病原菌侵染會產(chǎn)生一系列復(fù)雜的生理生化變化，以維持自身代謝的動態(tài)平衡，誘導(dǎo)抗病性是采后果實貯藏保鮮的重要機制之一。果蔬中含有大量的抗性酶，在成熟衰老、病原侵染、機械損傷過程中都能誘導(dǎo)抗性酶做出有效響應(yīng)，但是不同環(huán)境下抗性酶的變化規(guī)律是不一樣的。4CL、POD、PPO在整個腐皮鏈孢霉菌侵染階段活性持續(xù)增高起著重要的防御作用;PAL是苯丙烷類代謝途徑中與抗菌功能產(chǎn)物形成相關(guān)的關(guān)鍵酶和限速酶，為木質(zhì)素和植保素的合成提供前體，在植物早期防衛(wèi)反應(yīng)中具有重要的作用。PAL在腐皮鏈孢霉菌侵染的4d內(nèi)活性持續(xù)增高，且在整個侵染階段都保持了較高的活性;在腐皮鏈孢霉菌侵染試驗中，侵染組和對照組的CAD活性在第4d顯著上升，且侵染組升高的幅度顯著高于對照組。C4H、4CL、CAD和TAL是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，它們活性的高低不僅影響木質(zhì)素的含量、木質(zhì)素單體的組成，而且影響酚類物質(zhì)、植保素、類黃酮等抗菌物質(zhì)的生物合成，這些次級代謝產(chǎn)物在植物的成熟衰老、抵御病蟲害、抗逆反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用。侵染組TAL活性出現(xiàn)波動性變化可能由于L-酪氨酸（L-Tyr）轉(zhuǎn)化為香豆酸過程中的某些復(fù)雜反應(yīng)所致，有待于對TAL催化機制深入研究。保鮮試驗結(jié)果表明，抗性酶POD、PPO、PAL、C4H、4CL、CAD和TAL參與了秋葵果實響應(yīng)成熟衰老和病原菌侵染的反應(yīng)過程，然而不同保鮮劑對抗性酶活性表達的誘導(dǎo)作用不一樣，包括POD、PPO、PAL、C4H、4CL、CAD和TAL的酶活性升高以抵抗秋葵果實的成熟衰老以及病原菌侵染，維持果實的抗病性和采后品質(zhì)。綜合考慮，復(fù)合處理組的效果最好。這與馬鈴薯塊莖干腐病、獼猴桃灰葡萄孢霉、杏果實抗病性和厚皮甜瓜采后病害中的研究結(jié)果相類似。但是，保鮮劑是如何在分子水平上調(diào)控秋葵果實抗性酶表達的機制尚需進一步研究。

本試驗通過研究腐皮鏈孢霉菌侵染黃秋葵后抗性酶POD、PPO、PAL、C4H、4CL、CAD和TAL，活性的變化發(fā)現(xiàn)，這些抗性酶在腐皮鏈孢霉菌侵染的黃秋葵果實中都能進行有效響應(yīng)，且在未侵染組中不同保鮮劑處理對這些抗性酶活性表達的誘導(dǎo)作用不同，試驗結(jié)果表明，1.0%的殼聚糖和0.45mg/L的1-MCP復(fù)合處理保鮮效果最好。