紫葉紫薇新品系葉色變化轉(zhuǎn)錄組分析

王瑩 李玉娟 李敏 馬祥建 談峰 郭聰 張健

摘要：對紫葉紫薇新品系的葉片進(jìn)行RNA-Seq測序和分析，共獲取145 338條Contig，得到組裝的Unigene有53 654條，平均長度1 186.25 bp。32 667條Unigene可以匹配到蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫獲得注釋信息，KEGG和GO注釋與富集分析顯示，差異DEG主要調(diào)節(jié)激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物代謝、核糖體代謝等生物學(xué)功能。58個表達(dá)差異基因分別對比到毛果楊和擬南芥2個模式植物的數(shù)據(jù)庫，篩出與葉綠素代謝相關(guān)候選基因9個，其中2個候選基因共同參與了葉綠素兼類黃酮代謝的調(diào)控，2個候選基因可能參與類黃酮代謝過程，它們分別屬于DUF547、Polyketide_cyc2、Pkinase、Calreticulin、NAD_Gly3P_dh_N、Glyco_hydro_9等13個基因家族，主要經(jīng)氧化還原反應(yīng)、物質(zhì)能量代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等機制介入紫薇葉色調(diào)控。本研究結(jié)果為探究紫葉紫薇葉色變異的分子機制提供參考。

關(guān)鍵詞：紫葉紫薇：葉色變化：轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號：S687.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號： 1000-4440（2018） 05-1128-10

紫薇（Lagerstroemia indica）以其觀賞性佳、抗逆性好，受到廣泛關(guān)注。雖然紫薇屬資源在中國分布非常廣泛，但該屬植物的育種研究起步較晚，主要集中在花色，如李文芳等和劉龍昌等分別對紫薇花色素的化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步研究：花香，如徐婉等對紫薇雜交后代花香氣成分做了定性與定量分析;抗逆性，如謝憲等對紫薇抗寒性的研究。紫薇屬稀缺彩葉品種，近年來育種專家們通過引種與選育，逐步獲得了一批集觀花、觀葉性于一體的彩葉紫薇。然而，對彩葉紫薇的研究目前僅集中于傳統(tǒng)的引種與栽培技術(shù)研究，基礎(chǔ)研究方面過于薄弱，尤其關(guān)于葉片呈色機理的研究。目前僅能查閱到宋倩等和王淑安等關(guān)于彩葉紫薇的葉色變異機制的研究報道，分別闡明了彩葉紫薇葉色變化與葉片中色素含量的關(guān)系，得到了大量與類胡蘿卜素和葉綠素合成相關(guān)的候選基因。

作為非模式植物中的一員，紫薇全基因組測序尚未完成，生物信息學(xué)信息十分匱乏。隨著測序技術(shù)日益成熟，高通量測序技術(shù)可以在不涉及基因組信息的情況下，檢測到所有物種的轉(zhuǎn)錄本，為彩葉紫薇葉片呈色機制的研究提供可能。

RNA-Seq測序技術(shù)可獲得大量的遺傳信息，能詮釋植物生化水平的多樣性及植物次生代謝分支調(diào)控機理，為研究彩葉植物葉色轉(zhuǎn)化帶來新的機遇。曹樺等對鐵皮石斛葉色突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，認(rèn)為do GLK1表達(dá)水平低和do Ftsz不表達(dá)導(dǎo)致了突變體葉綠體合成和分裂受阻。任杰對紅花槭品種艷紅葉色轉(zhuǎn)化期轉(zhuǎn)錄組解析結(jié)果表明，花青素苷代謝途徑基因差異表達(dá)對葉色變化起重要調(diào)控作用。紅掌突變體葉色呈色機制的研究結(jié)果表明，AaGLK和AaARC5分別是調(diào)控葉綠體發(fā)育和分裂的關(guān)鍵基因，AaDFR在花青素合成過程中起著關(guān)鍵作用。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在非模式彩葉植物的葉片呈色機理研究中。

本項目組2011年開始進(jìn)行紫薇實生選種工作.2012年開始進(jìn)行雜交育種工作，通過2種方法已選育出一批觀賞性狀優(yōu)良的彩葉紫薇新品系。其中在黑鉆石系列Best Red后代實生苗中發(fā)現(xiàn)l株植株葉片在春季呈現(xiàn)更加明艷的紫紅色，初夏開始返青，上位葉紫紅色，中位葉呈紫色與綠色相交的花葉色，下位葉綠色，色葉期比親本長15～20d，通過繁育觀察，其特異性、一致性、穩(wěn)定性均達(dá)到新品種的申報要求，擬定名為紫晶l號，已申報國家林業(yè)局植物新品種權(quán)。本研究利用Illumina HiSeq高通量測序平臺對紫晶1號不同葉位葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，比較不同葉片中基因表達(dá)的差異，以期通過RNA-Seq技術(shù)獲得與葉色性狀相關(guān)的基因序列，為揭示紫葉紫薇葉色變異的分子機制和培育彩葉紫薇新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所紫薇種質(zhì)圃內(nèi)新選育的紫葉紫薇紫晶l號為試驗材料。選取轉(zhuǎn)色期葉色性狀穩(wěn)定、生長健壯、長勢一致的植株，采集上位葉（紫葉）、中位葉（花葉）和下位葉（綠葉），用錫紙包裹，在液氮中迅速冷凍。本項目中試驗材料總RNA的提取與質(zhì)量檢測以及無參考基因組序列的轉(zhuǎn)錄組高通量測序分析均由北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取與質(zhì)量檢測 用總RNA提取試劑盒（QIAGEN）對不同葉位葉片進(jìn)行RNA提取，樣本的純度、濃度和完整度分別選用Nanodrop、Qu-bit 2.0、Aglient 2100分析。后續(xù)進(jìn)行合格RNA的cDNA文庫構(gòu)建和RNA-Seq測序。

1.2.2 cDNA文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序檢測后合格的樣品，以mRNA為模板，構(gòu)建cDNA雙鏈，利用AMPure XP beads試劑盒依次進(jìn)行純化、末端修復(fù)和片段大小選擇，通過PCR富集得到紫薇cDNA文庫。cDNA文庫的質(zhì)量用Agilent 2100檢測，再通過Illumina Hi-Seq平臺完成RNA-Seq測序分析。

1.2.3 De novo組裝及質(zhì)量控制 獲得的原始數(shù)據(jù)（Raw reads）經(jīng)過濾得到Clean reads，將其用Trinity拼接，得到Contigs，利用De Bruijn圖的方法和測序Read信息，在片段集合中讀取轉(zhuǎn)錄本序列，最長Contig即為最終轉(zhuǎn)錄本的Unigene。

1.2.4 Unigene功能注釋使用BLAST軟件將DEGs序列與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、eggNOG4.5、KEGG數(shù)據(jù)庫分別比對，獲得相關(guān)注釋信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序與de novo組裝

利用Illumina Hi-Seq對3個不同葉位葉片（每個葉位3個重復(fù)）共計9個樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（表1），共獲得68.56Gb（過濾后序列），各樣品過濾后的序列量均達(dá)到6.87Gb以上;Q30堿基百分比在91%以上，G、C含量在49%以上，可以用于下一步的De novo組裝。利用Trinity軟件將所有的短序列拼接，獲得145 338條Contig，進(jìn)一步組裝得到53 654條Unigene，總長度63646992 bp，平均長度為l 186.25bp，其中長度在200—300 bp的Unigene所占的比例最高，Unigene的N50為2229 bp，組裝完整性較高（圖1），獲得的Mapped Read可用于后續(xù)分析。

2.2 差異基因表達(dá)量分析

將FDR小于0.01，差異倍數(shù)FC≥4作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對紫晶l號3個不同葉位葉片中差異表達(dá)基因進(jìn)行比對，共篩選得到58條差異表達(dá)基因（圖2、表2）：以綠葉為對照，上位葉檢測出的差異表達(dá)基因數(shù)目最多，有4792個轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了改變，其中上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因高達(dá)4017個，上調(diào)倍數(shù)在4.00～1573.76，最大上調(diào)基因ID為c49503.graph_c0;在下調(diào)基因中，下位葉與中位葉對比，差異DEG最少，其次為上位葉與下位葉對比得到的差異DEG數(shù)，其中最大下調(diào)表達(dá)基因ID為c41691.graph_c0，下調(diào)倍數(shù)達(dá)1 418.35。

2.3 差異表達(dá)基因功能注釋

通過選擇BLAST參數(shù)（E-value≤le-5）和HM-MER參數(shù)（E-value≤le-10），將全部Unigene序列與COG、GO等8個數(shù)據(jù)庫比對（表3、表4），最后得到32667個有注釋信息的基因，其中長度在1000 bp以上的基因注釋效率為53.05%，而未得到注釋的Unigene為20 987條（39.12%）。

2.4 差異表達(dá)基因GO分類和功能富集

紫晶l號差異表達(dá)基因在GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，有18 718條Unigene在GO數(shù)據(jù)庫中得到相關(guān)注釋，其中每2個樣品相比得到的差異基因在GO數(shù)據(jù)庫中注釋率最多達(dá)56.88%（圖3），注釋的基因參與生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能調(diào)控（表5），功能組涉及到53個。生物學(xué)過程的注釋顯示，Uni-gene表達(dá)差異顯著順序依次為代謝過程，細(xì)胞過程和單組織過程;在細(xì)胞成分分類信息中，細(xì)胞部分和細(xì)胞顯著富集：在分子功能分類中，富集程度最高的是催化活性，說明紫晶l號轉(zhuǎn)色時期葉片中催化活性受影響較大。

2.5 差異表達(dá)基因KEGG注釋和富集分析

有7544個（23.10%） Unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫得到注釋，涉及了119個KEGG代謝通路，其中綠葉與紫葉對比獲得注釋的919個差異表達(dá)基因（ DEG）可以被分配到118個KEGG通路（表6），綠葉對比花葉獲得注釋的187條DEG可以被分配到88個KEGG通路，紫葉對比花葉獲得注釋的599條DEG可以被分配到113個KEGG通路，排名前10顯著性富集差異基因主要涉及到細(xì)胞途徑、遺傳信號響應(yīng)、環(huán)境信號響應(yīng)和新陳代謝4個方面，其中最大的分類是新陳代謝，包括碳水化合物、氨基酸、多糖生物合成以及能量、次生物質(zhì)等;環(huán)境信號響應(yīng)類最小。同時，KEGG的注釋結(jié)果也顯示，差異基因主要參與了次生物質(zhì)代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、核糖體代謝和碳水化合物代謝等通路。紫晶l號在轉(zhuǎn)色期葉片類黃酮生物合成途徑的KEGG通路注釋結(jié)果顯示，花青素合成途徑中有9個基因表達(dá)上調(diào)，3個基因下調(diào)，肉桂酰輔酶a是花色苷合成關(guān)鍵酶，相應(yīng)的基因ID為c37587.graph_c0、c50617.graph_c0和c54586.graph_c0（K05278+K08695+K00660）.

2.6 差異基因注釋結(jié)果分析

葉色轉(zhuǎn)化期間，log2FC達(dá)8倍以上差異表達(dá)的基因如表7所示，高水平差異表達(dá)的注釋基因中，以綠葉為對照，紫葉對比花葉的短鏈脫氫酶還原酶c27313.graph_c0基因表達(dá)下調(diào)水平顯著;以紫葉為對照，c52058.graph_c0（表皮原因子基因）也顯示出相似的下調(diào)趨勢。在差異表達(dá)DEG中，除c47073.graph_c0、c27117.graph_c0為假定的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因，其他的基因功能主要涉及到基礎(chǔ)代謝、逆境響應(yīng)因子、性別決定等幾個方面。

2.7 葉色相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子分析

在轉(zhuǎn)色期間，3種不同葉位篩選到差異基因58個。與模式植物毛果楊和擬南芥的GO和KEGG蛋白數(shù)據(jù)庫作比對（表8），篩出與葉綠素代謝相關(guān)候選基因9個，其中2個候選基因共同參與了葉綠素兼類黃酮代謝的調(diào)控，2個候選基因可能參與類黃酮代謝過程，分別屬于DUF547、Polyketide_cyc2、Pki-nase、Calreticulin、NAD Gly3P dh_N、Glyco hydro 9等13個基因家族，主要經(jīng)氧化還原反應(yīng)、物質(zhì)能量代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等機制介入紫薇葉色調(diào)控。在與葉色相關(guān)差異表達(dá)候選基因中，有11條Uni-gene與卟啉環(huán)代謝和葉綠素合成相關(guān)基因表現(xiàn)出同源性：而c56217.graph_c0基因在葉綠素降解通路中發(fā)揮了一定作用;在花青素苷代謝途徑中，尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、富含亮氨酸重復(fù)序列受體蛋白激酶、松脂醇還原酶I、聚半乳糖醛酸酶Ⅱ等均參與了對花青苷代謝途徑的調(diào)控。

3 討論

3.1 基于RNA-Seq技術(shù)的植物葉色基因的發(fā)掘

新一代高通量測序技術(shù)是基于邊合成邊測序和可逆終止子的原理，雙端測序的使用，不僅可以提高測序的深度，還能提高從頭拼接的效率和準(zhǔn)確性。一大批彩葉植物包括紫背天葵（Gynura bi-color）、銀杏（Ginkgo biloba）、花葉矢竹（Pseudosasa japonica f.Akebonosuji）等的轉(zhuǎn)錄組已經(jīng)被測序，為研究彩葉植物色素合成途徑及葉色轉(zhuǎn)化帶來新的機遇。本項目組對紫晶l號3種葉色葉片作了轉(zhuǎn)錄組測序分析和功能基因預(yù)測，獲得145338條Contig，進(jìn)一步組裝得到53654條Uni-gene，Q30均大于91%，被標(biāo)記的序列數(shù)比例（被標(biāo)記的序列數(shù)/過濾后的序列數(shù)）均在72%以上，Uni-gene的N50為2229 bp，測序數(shù)據(jù)的輸出和裝配質(zhì)量能夠滿足轉(zhuǎn)錄分析的基本要求，為詮釋紫晶l號葉片色素代謝分支調(diào)控機制，為色素合成關(guān)鍵基因的挖掘提供重要參考。

3.2 差異基因表達(dá)與功能注釋分析

楊海蕓等的研究結(jié)果表明，同一轉(zhuǎn)錄組Uni-genes的序列越長，其匹配率越高，本研究中長度在1000 bp以上的基因注釋率為53.05%，而在300—1000 bp的Unigenes的注釋率只有29.50%，結(jié)果與前者相似。在生物學(xué)過程分類中，表達(dá)差異最大的是代謝過程，這與吳全金、郭小鷗的研究結(jié)果相似，表明紫晶l號葉片中代謝相關(guān)基因的表達(dá)存在顯著差異，代謝產(chǎn)物的差異可能導(dǎo)致生物學(xué)功能與形態(tài)的差異。羅成科等在相關(guān)研究中指出，DUF是一大組未表明功能的蛋白家族，一些植物特有的DUF蛋白家族在調(diào)控植物生長發(fā)育、防御病蟲害和非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)等方面起著重要作用。Kodama等的研究結(jié)果顯示，擬南芥葉綠體運動響應(yīng)是DUF家族中WEB1和PMI22個基因互相作用調(diào)控的，推測c42391.graph_c0可能與其作用過程相似。韓曉斌等的研究結(jié)果表明，阻遏或敲除Pkinase家族中的Os EDR1基因，突變體植株均會出現(xiàn)斑葉，推測與Os EDR1同源的紫薇c45897.graph_c0轉(zhuǎn)錄因子影響了葉綠素的表達(dá)，進(jìn)而使葉色發(fā)生變化。在毛果楊、擬南芥、水稻等研究結(jié)果中表明，HMA基因家族是植物吸收、轉(zhuǎn)運Zn、Cu、Cd等重金屬的重要組分，擬南芥HMA1功能缺失會導(dǎo)致葉綠體中Cu含量下降和Zn含量上升，進(jìn)而影響葉綠素的合成。以綠葉為對照，紫葉中屬于HMA家族的c51707.graph—c0表達(dá)量顯著上調(diào)，進(jìn)一步推測c51707.graph_c0是控制紫薇葉色表達(dá)的候選基因。花色苷作為類黃酮物質(zhì)的一類，是植物呈現(xiàn)紅、橙、粉、紫、藍(lán)等顏色的主要色素，而葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶家族（UDPGT）在花色苷合成途徑起到重要作用。Kotepong等研究馬六甲蒲桃果皮發(fā)現(xiàn)，UFGT表達(dá)強度隨著紅巴梨果實的成熟而降低，招雪晴等研究指出，UFGT家族的PgUFGT基因在紅寶石和水晶甜石榴品種的發(fā)育期內(nèi)具有不同的表達(dá)模式，這與本研究的結(jié)果相似，推測c47870.graph_c0可能參與了紫薇葉片中類黃酮物質(zhì)的3-0位置的糖基化，與之相似的同源基因MDP0000543445、At UGT78D2等已在紅肉蘋果、黃果草莓等研究中被找到，并已證實其與花青素的代謝活動密切相關(guān)。孫海燕等在三色堇花色形成機制的研究中，克隆出屬于SDR（短鏈脫氫/還原酶）超基因蛋白家族的Vw DFR基因，推測該基因可能是花青素合成結(jié)構(gòu)基因。本研究中c29868.graph_c0屬于SDR基因家族，在類黃酮的生物合成過程中起到了正向調(diào)控作用，在紫葉中表達(dá)水平最高，說明c29868.graph_c0是紫晶1號葉片色素合成的關(guān)鍵候選基因。

本研究利用高通量測序技術(shù)對紫葉紫薇新品系紫晶l號轉(zhuǎn)色期葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得145338條Contig，進(jìn)一步組裝得到53 654條Uni-gene。KEGG和GO注釋與富集分析顯示，差異DEG主要調(diào)節(jié)激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物代謝、核糖體代謝等生物學(xué)功能。將最終獲得的58條差異表達(dá)Unigene對比到毛果楊和擬南芥2個模式植物的數(shù)據(jù)庫，篩出與葉綠素代謝相關(guān)候選基因9條，有2條候選基因共同參與了葉綠素兼類黃酮代謝的調(diào)控，2條候選基因可能參與類黃酮代謝過程，它們分別屬于DUF547、Polyketide_cyc2、Pkinase等13個基因家族，主要經(jīng)氧化還原反應(yīng)、物質(zhì)能量代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等機制介入紫薇葉色調(diào)控。