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    葉面噴施鉀肥對霞脆桃果實(shí)品質(zhì)及KUP基因表達(dá)的影響

    2018-09-10 00:53:05宋志忠許建蘭張斌斌俞明亮馬瑞娟
    江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報 2018年5期
    關(guān)鍵詞:鉀素成熟度鉀肥

    宋志忠 許建蘭 張斌斌 俞明亮 馬瑞娟

    摘要:以霞脆桃為材料,研究了葉面噴施鉀肥對果實(shí)品質(zhì)的影響及果實(shí)發(fā)育中K+動態(tài)平衡與KUP家族基因表達(dá)水平之間的聯(lián)系。結(jié)果表明:噴施鉀肥顯著增加了霞脆桃的鮮質(zhì)量和體積大小,改善了果皮著色指標(biāo),提高了果實(shí)可溶性固形物和可溶性糖含量,有效提升了桃果實(shí)品質(zhì),并有效增強(qiáng)了果實(shí)發(fā)育不同時期果肉的鉀素營養(yǎng)狀況;桃KT/HAK/KUP家族基因在桃果實(shí)發(fā)育不同時期的表達(dá)水平存在差異,Ppe KUP1基因在霞脆桃整個果實(shí)發(fā)育期的表達(dá)水平最高,其次是PpeKUP5和PpeKUP3,而PpeKUP14~PpeKUP16在果實(shí)發(fā)育不同時期均沒有檢測到表達(dá)量;PpeKUP1、Ppe KUP2和PpeK UP7在轉(zhuǎn)錄水平上對噴施鉀肥處理最為敏感,其表達(dá)水平與對照相比,在第2次果實(shí)膨大期(75 DAFB)至達(dá)到商業(yè)成熟度時(95 DAFB)均顯著增強(qiáng)。

    關(guān)鍵詞:桃;果實(shí)發(fā)育;鉀肥;葉面噴施;KT/HAK/KUP家族;基因表達(dá)

    中圖分類號:S662.1

    文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

    文章編號: 1000-4440(2018) 05-1107-06

    鉀是植物細(xì)胞中含量最為豐富的金屬元素之一,在維持細(xì)胞電荷平衡,調(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓,參與光合作用和蒸騰作用等多種生命過程中起重要作用,是植物正常生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素。土壤缺鉀影響植物光合作用與葉綠素合成,缺鉀嚴(yán)重將引起植物組織萎縮。果園中,鉀肥施用與花的開放、桃果實(shí)品質(zhì)、產(chǎn)量及果實(shí)采后貯藏品質(zhì)密切相關(guān)。缺鉀土壤中施用適量鉀肥,能顯著提高果實(shí)可溶性固形物含量,改善糖酸比,提升果實(shí)內(nèi)在品質(zhì),并能增加果實(shí)單果質(zhì)量,改善著色指數(shù)以及果頂形狀,提高果實(shí)外觀品質(zhì)。此外,施用鉀肥可顯著改善果實(shí)的抗裂果特性和貯藏運(yùn)輸特性。然而,諸多研究主要集中在生理生化層面,鉀素營養(yǎng)與果樹生長及果實(shí)發(fā)育過程中K+吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制研究報道鮮少。

    KT/HAK/KUP家族基因編碼高親和的K+轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白,介導(dǎo)植物對K+的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和分配,維持植物體內(nèi)鉀素營養(yǎng)平衡。然而,該家族成員的功能尚未完全清楚,個別基因的研究多見于模式植物擬南芥。吸收動力學(xué)研究結(jié)果表明擬南芥AtK UP1介導(dǎo)根部細(xì)胞吸收外界K+,既具有低親和吸附系統(tǒng)(IAS)的特征,又具有高親和吸附系統(tǒng)(HAS)的特征。表觀遺傳學(xué)研究結(jié)果表明AtKUP2、AtKUP4和AtHAK5主要控制根毛區(qū)延長和細(xì)胞擴(kuò)張,介導(dǎo)根部吸收的K+向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)或分配;AtKUP7介導(dǎo)根部K+的吸收并將吸收的K+運(yùn)輸?shù)侥举|(zhì)部,特別是缺鉀條件下,其將K+從根部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)作用更顯著。借助生物信息學(xué)分析方法,宋志忠等從葡萄和桃中分別鑒定出18和16個KUP基因成員。然而,多年生木本植物(尤其是果樹作物)KT/HA K/K UP家族成員的功能依然未知。

    桃[Prunus persica(L.)Batsch]是一種全球重要的水果,隨著基因組序列的公布,迅速成為最具研究潛力的園藝作物之一。本研究分析了鉀肥施用對霞脆桃生長指標(biāo)及果實(shí)品質(zhì)的影響,并通過實(shí)時熒光定量PCR分析了果實(shí)發(fā)育中K+動態(tài)平衡與KUP家族基因表達(dá)水平之間的聯(lián)系,從分子層面探討鉀肥施用、鉀素營養(yǎng)狀況與果實(shí)發(fā)育及品質(zhì)之間的密切關(guān)系,為果樹施用鉀肥提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料及取樣

    供試材料為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院桃試驗(yàn)園中的7年生早中熟桃品種霞脆,試驗(yàn)于2015和2016年重復(fù)開展,重復(fù)性驗(yàn)證一致,本文展示數(shù)據(jù)源自2015年試驗(yàn)。鉀肥施用處理參照宋志忠等和李靖等報道的方法。選擇同一田地的2行桃樹(各6棵,行株距為5mx3m),其中一行為對照,另一排行進(jìn)行葉片噴施處理。盛花后45d(5月上旬),即桃幼果已成形并將進(jìn)入第1次快速膨大期,對選定的桃樹噴施3%(本研究室前期鉀肥預(yù)試驗(yàn)所得的最佳噴施量)的KH2P04溶液,以滴液為度,試驗(yàn)植株按常規(guī)栽培措施管理。果實(shí)樣品采集:從盛花后35d(4月下旬,30DAFB)起,每隔20d取一次樣,至果實(shí)達(dá)到商業(yè)成熟度時(6月底,95 DAFB),共采樣4次,用于基因表達(dá)分析,達(dá)到商業(yè)成熟度的果實(shí)用于果實(shí)品質(zhì)的各項(xiàng)指標(biāo)測定。

    1.2 桃果實(shí)生理指標(biāo)測定

    用分析天平測定果實(shí)單果質(zhì)量,并用游標(biāo)卡尺測定果實(shí)的縱徑、橫徑和側(cè)徑。在果實(shí)縫合線兩側(cè)中部用TA.XT.Plus型質(zhì)構(gòu)儀測定帶皮果肉硬度,探頭直徑8mm,測試深度5mm,貫人速度lmm/s。

    參照馬瑞娟等的方法,用Color Quest XE色差計測定果實(shí)顏色指標(biāo)。其中L4表示顏色的亮度,取值范圍為[1,100];α*、b*表示顏色組分,取值范圍為,α*值為紅綠色差指標(biāo),b*值為黃藍(lán)色差指標(biāo)。a*/b*值反映果實(shí)的真實(shí)色澤,負(fù)值時果實(shí)為綠色,零值時表示果實(shí)顏色由綠色轉(zhuǎn)為黃色或橙紅色,正值時表示果實(shí)色澤為黃色或橙紅色。

    果實(shí)硬度測定完成后,取測定硬度的2個點(diǎn)處果肉的汁液用便攜數(shù)顯折光儀PAL-1測定果實(shí)的可溶性固形物含量,取2個點(diǎn)的平均值作為每個果實(shí)的實(shí)際可溶性固形物含量。果肉勻漿后以702 SM Titrino自動電位滴定儀測定可滴定酸含量,用斐林試劑滴定法測定可溶性糖含量。

    鉀離子含量測定參照Song等的方法:樣品在105℃中殺青30min.并在65℃烘箱烘烤48h,均勻粉碎后用HNO3-HC104消化過夜,并通過石墨高溫消解儀消煮4.5h,定容后用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-AES)測定。

    1.3 果肉總RNA的提取和熒光定量PCR

    利用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKa-Ra公司產(chǎn)品)提取果實(shí)樣品的總RNA,并通過Pri—meScriptTM RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)合成第一鏈cDNA作為模板,用于實(shí)時熒光定量PCR。通過NCBI/Primer-BLAST在線服務(wù)器設(shè)計桃PpeKUP基因的特異性表達(dá)引物,分別以桃Ubiquitin,基因(GenBank No.KJ598788)和Actin,基因(GenBank No.KP690196)為內(nèi)參,所用引物序列參照Song等的報道,通過ABI 7500實(shí)時熒光定量PCR儀檢測桃PpeKUP基因在桃花不同開放時期的表達(dá)特征。熒光染料為SYBR Green(TaKaRa公司產(chǎn)品),反應(yīng)體系參照商品說明書。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30s:95℃變性5s,58℃退火34s(40個循環(huán));最后72℃延伸10s。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    所有數(shù)據(jù)通過SPSS 13.0軟件進(jìn)行顯著性分析,在鉀肥處理與對照2個獨(dú)立桃果實(shí)樣品間進(jìn)行£檢驗(yàn)(P<0.05為顯著水平,P<0.01為極顯著水平)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 噴施鉀肥對桃果實(shí)外觀的影響

    桃果實(shí)鮮質(zhì)量隨果實(shí)的發(fā)育而逐漸積累(表1),在盛花后75d(6月上旬,75DAFB)出現(xiàn)第2次果實(shí)膨脹期,在達(dá)到商業(yè)成熟度時(6月底,95DAFB),霞脆桃平均單果質(zhì)量達(dá)到最高(157.76g)。噴施KH2PO4鉀肥顯著提高了不同發(fā)育時期的桃果實(shí)單果質(zhì)量,在經(jīng)濟(jì)采收期(95DAFB)達(dá)到了178.42g,即顯著提高了15%(表1和圖1)。

    桃果實(shí)體積隨著果實(shí)的發(fā)育而逐漸增加,在經(jīng)濟(jì)采收期,霞脆桃果實(shí)的平均縱徑、橫徑和側(cè)徑分別達(dá)到最大值(表1)。與對照相比,噴施鉀肥顯著提高了不同檢測時期平均縱徑和側(cè)徑的長度(P<0.05),在經(jīng)濟(jì)采收期(95 DAFB)縱徑和側(cè)徑分別提高了11.36%和12.65%,而橫徑?jīng)]有顯著變化(表1和圖1)。

    霞脆屬于易著色桃品種,在桃果實(shí)發(fā)育和成熟過程中,果皮顏色由綠色逐漸轉(zhuǎn)為紅色。在達(dá)到商業(yè)成熟度時(95 DAFB),桃果實(shí)α*和α*/b*達(dá)到峰值。與對照相比,噴施KH2PO4鉀肥顯著增強(qiáng)了桃果實(shí)的α*和α*/b*,分別提高了20.97%和15.20%.而對桃果實(shí)L*值沒有顯著影響(表2),說明噴施鉀肥可能通過提高果實(shí)的α*和α*/b*值改善果皮色澤和外觀。

    2.2 噴施鉀肥對桃果實(shí)品質(zhì)的影響

    果實(shí)硬度、可溶性固形物含量、可溶性糖含量和可滴定酸含量等都是影響果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)的重要指標(biāo)。在達(dá)到商業(yè)成熟度時(95 DAFB),噴施鉀肥的桃果實(shí)可溶性固形物和可溶性糖含量相比于對照分別提高了15.81%和15.20%,而果實(shí)硬度和可滴定酸含量沒有顯著差異(表3)。

    霞脆桃果實(shí)發(fā)育不同時期果肉中K+含量存在差異,隨著桃果實(shí)的不斷發(fā)育而逐漸增加,在第2次果實(shí)膨大期(75 DAFB)至達(dá)到商業(yè)成熟度時(95DAFB),K+含量達(dá)到峰值(表4)。在盛花后55d、75d和95d,噴施鉀肥的果肉K+含量與對照相比分別上升20.26%、16.51%和21.00%。

    2.3 桃果實(shí)發(fā)育過程中KT/HAK/KUP家族基因的表達(dá)特征

    在前期研究中,筆者從桃基因組中鑒定并克隆了16個KUP家族基因。熒光定量PCR分析結(jié)果表明:PpeKUPl~PpeKUP13基因在霞脆果實(shí)中均能檢測到,且表達(dá)水平差異較大,其中,PpeKUPI基因的表達(dá)水平最高,其次是PpeKUP5和PpeKUP3,其他基因的表達(dá)量相對較低,而PpeKUP14~Ppe-KUP16基因在霞脆果實(shí)中沒有檢測到表達(dá)量(圖2)。此外,PpeKUPl~PpeKUP13基因在試驗(yàn)的4個不同時期的表達(dá)趨勢類似,均在第1次果實(shí)膨大期(35DAFB)和硬核期(55DAFB)的表達(dá)水平較高,并隨著果實(shí)的不斷發(fā)育和成熟而逐漸降低。其中,PpeKUP1基因在硬核期(55DAFB)最為突出,其表達(dá)水平約為其他PpeKUP基因的5—20倍,說明其在果實(shí)發(fā)育初期是尤為重要的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(圖2)。

    2.4桃果實(shí)發(fā)育過程KT/HAK/KUP家族基因?qū)娛┾浄实捻憫?yīng)

    熒光定量PCR結(jié)果表明,PpeKUP1、PpeKUP2和PpeKUP7在轉(zhuǎn)錄水平對噴施鉀肥處理較為敏感,PpeKUI的表達(dá)水平在噴施鉀肥后的3次不同檢測點(diǎn)均顯著上升,而PpeKUP2和PpeKUP7的表達(dá)水平在第2次果實(shí)膨大期(75DAFB)至達(dá)到商業(yè)成熟度時均顯著增強(qiáng)(圖3),其他基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)水平不受噴施鉀肥影響。

    3 討論

    K+是植物細(xì)胞中含量最為豐富的陽離子之一,鉀是植物正常生長和發(fā)育必不可缺的品質(zhì)元素,與花的開放、果實(shí)發(fā)育、品質(zhì)形成及產(chǎn)量密切相關(guān)。本研究從生理層面分析了噴施鉀肥對霞脆桃果實(shí)品質(zhì)的影響,結(jié)果表明噴施鉀肥顯著提高了霞脆桃果實(shí)鮮質(zhì)量和果實(shí)大小,改善了果皮著色指標(biāo),并提高了果實(shí)可溶性固形物和可溶性糖的含量,提升了果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)。這些結(jié)果與鉀肥施放改善番茄、蘋果、檸檬、獼猴桃、龍眼、蟠桃、油桃和普通桃等果實(shí)品質(zhì)的諸多報道是一致的。而且噴施鉀肥有效改善了桃果實(shí)發(fā)育不同時期果肉的鉀素營養(yǎng)狀況,推測鉀素營養(yǎng)狀況的改善,促進(jìn)了果實(shí)縱徑和側(cè)徑發(fā)育,可能是桃果實(shí)鮮質(zhì)量增加的直接因素,也可能是桃果實(shí)品質(zhì)得以改善的因素之一。

    果樹研究中,有關(guān)鉀肥控釋促進(jìn)果實(shí)發(fā)育及其鉀素營養(yǎng)的分子基礎(chǔ)研究鮮少。本研究從轉(zhuǎn)錄水平分析桃鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體KT/HAK/KUP家族基因在霞脆桃果實(shí)發(fā)育不同時期的表達(dá)特征及其對噴施鉀肥的差異響應(yīng)。結(jié)果表明,KT/HA K/KUP家族基因在果實(shí)發(fā)育與成熟不同時期的表達(dá)水平差異明顯,均在第1次果實(shí)膨大期(35DAFB)和硬核期(55DAFB)的表達(dá)水平較高,表明在桃幼果形成和硬核形成時期需要更多的KUP轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)揮作用,以便富集較多的K+參與果實(shí)發(fā)育初期細(xì)胞內(nèi)各種依賴K+的生理過程,也可能為第2次果實(shí)膨大(75 DAFB)和果實(shí)成熟儲備充足的K+驅(qū)動力。伴隨著桃果實(shí)的不斷發(fā)育和成熟,KT/HAK/KUP家族基因的表達(dá)水平逐漸降低,說明桃果實(shí)發(fā)育成熟后這些轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能下降。桃果實(shí)發(fā)育成熟后,體內(nèi)K+有可能向其他組織(例如一年生枝條的韌皮部或樹干)轉(zhuǎn)移,但依然維持在較高的鉀素營養(yǎng)狀態(tài),維持并保障采收后果實(shí)的基本形態(tài)和鮮質(zhì)量。

    Song等研究結(jié)果表明PpeKUPI基因在桃幼苗的根、莖和葉中均有表達(dá),且在根部易受外界非生物脅迫的調(diào)控。宋志忠等發(fā)現(xiàn)PpeKUPL基因在桃花中的表達(dá)量相對較低,遠(yuǎn)低于該家族其他成員基因。本研究結(jié)果表明PpeKUP1基因在霞脆桃果實(shí)發(fā)育初期至硬核期(55 DAFB)的表達(dá)量極高,約為其他PpeKUP基因表達(dá)水平的5~20倍,且在轉(zhuǎn)錄水平上對噴施鉀肥非常敏感,其表達(dá)水平從硬核期(55DAFB)至達(dá)到商業(yè)成熟度時(95DAFB)是持續(xù)被誘導(dǎo)的,提示PpeKUPl是果實(shí)發(fā)育過程中(特別是幼果形成及發(fā)育初期)重要的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體,在維持果肉鉀素營養(yǎng)方面發(fā)揮較大作用。盡管Ppe-KUP5基因是桃幼苗(特別是根部)KT/HA K/KUP家族基因中表達(dá)量最高的,但在桃花中的表達(dá)量是極低的。本研究中,PpeKUP5在桃果實(shí)發(fā)育中的表達(dá)水平僅次于PpeKUPI,且在霞脆桃果實(shí)發(fā)育早期(35~55DAFB)的表達(dá)量較高,但對噴施鉀肥不敏感。雖然PpeKUP7基因在桃幼苗和桃花中表達(dá)量相對較低,在霞脆桃果實(shí)中表達(dá)量也是極低的,但對噴施鉀肥較為敏感,在第2次果實(shí)膨大期(75DAFB)至達(dá)到商業(yè)成熟度時(95DAFB)其表達(dá)均顯著增強(qiáng),表明其與PpeKUOI和PpeKUP5在桃果實(shí)發(fā)育與成熟過程中,是響應(yīng)和增強(qiáng)果肉鉀素營養(yǎng)狀態(tài)所不可或缺的。同時,在果實(shí)發(fā)育成形并不斷成熟時,一年生枝條韌皮部和樹葉也逐漸生長和發(fā)育,這3個轉(zhuǎn)運(yùn)體基因也有可能在將果實(shí)內(nèi)K+向一年生枝條韌皮部、樹葉或樹干的轉(zhuǎn)移和分配中發(fā)揮一定的作用。此外,PpeKUP14~PpeKUP16基因在幼苗根、莖和葉中均有表達(dá)(低于PpeKUP5),但在桃花開放后不同時期均不表達(dá),PpeKUP14~PpeKUP16在霞脆桃果實(shí)發(fā)育不同時期亦檢測不到,且對外界鉀肥施用沒有響應(yīng),充分表明這3個轉(zhuǎn)運(yùn)體可能在桃花開放和果實(shí)形成及發(fā)育過程中不發(fā)揮作用,而可能參與其他生命過程。

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