不同雞種BF1基因SNP和Indel比對(duì)分析

陳博雯 鄭圣晗 張莘 王統(tǒng)苗 王志秀 張揚(yáng) 陳國(guó)宏 常國(guó)斌

摘要：雞BF1基因多態(tài)性與傳染性疾病的抗性有很大關(guān)系。雞BF1基因多態(tài)性及功能尚不清楚。本研究直接測(cè)定了25個(gè)雞種BF1基因序列，并與從NCBI下載的紅色原雞BF1基因進(jìn)行了比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在這25個(gè)雞種中共檢測(cè)到了171個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP），其中外顯子上發(fā)現(xiàn)了108個(gè)SNP。這些外顯子中SNP位點(diǎn)編碼氨基酸166個(gè)，其中有58個(gè)氨基酸發(fā)生變異，氨基酸序列同源性高于核苷酸。外顯子4和外顯子1的SNP數(shù)量最多，占46010以上，第5、第6、第7、第8外顯子屬于保守區(qū)域。核苷酸序列缺失主要發(fā)生在外顯子1和內(nèi)含子5上。25個(gè)雞種根據(jù)地理位置和氣候環(huán)境大致可被分為3大類。說(shuō)明，BF1基因在核苷酸多態(tài)性水平上存在較高的變異性，為雞抗病育種提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雞MHC; BF1基因;SNP; INDEL

中圖分類號(hào)：S858.31

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1000-4440（2018）05-1087-08

主要組織相容性復(fù)合體（MHC）在所有有頜脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中具有重要作用。在雞中，MHC-B區(qū)域編碼經(jīng)典的I類和II類分子，它是最具多態(tài)性的基因組區(qū)域，主要編碼參與先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)，因此，該基因組區(qū)域?qū)τ跈C(jī)體抗病性和易感性至關(guān)重要。

在哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）對(duì)于病毒感染以及腫瘤等疾病的免疫與治療方面有其不可或缺的地位。當(dāng)一個(gè)抗原被識(shí)別后，將被分解成若干個(gè)多肽分子。MHC，類基因編碼的分子與細(xì)胞表面病原體衍生的多肽鏈結(jié)合，使細(xì)胞表面顯示出病原體，CTL通過(guò)其細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）識(shí)別呈遞的抗原表位，從而對(duì)病原體細(xì)胞進(jìn)行殺傷并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。雞MHC主要有3個(gè)亞區(qū)，即BF（I類）、BL（II類）、BG（Ⅳ類）。雞幾乎所有的細(xì)胞均表達(dá)BF基因，BF抗原在MHC限制性抗原呈遞給細(xì)胞毒性T細(xì)胞過(guò)程中起核心作用。大多數(shù)雞MHC單倍型含有2個(gè)經(jīng)典的I類基因座，BF1和BF2。且有研究結(jié)果表明，BF1在靶細(xì)胞上表達(dá)的分子能夠強(qiáng)烈抑制雞NK細(xì)胞的殺傷。可見，BF1在雞體免疫應(yīng)答中發(fā)揮著極為重要的作用。

雞MHC位于第16號(hào)微小的染色體上，其中BF1基因位于DMB2和TA P1基因之間。有研究者指出，雞馬立克病的抗病性在很大程度上由基因決定，而雞MHC基因多態(tài)性與這種傳染性疾病的遺傳抗性高度相關(guān)，所以抗病育種在疾病控制方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。由于BF1基因在其他雞品種抗病性的研究甚少，尚不了解不同雞種BF1基因之間的差異。本研究利用目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)對(duì)25個(gè)雞品種外周血淋巴細(xì)胞（Peripheralblood leukocytes，PBLs）中BF1基因序列進(jìn)行測(cè)定，分析其SNP位點(diǎn)和Indel位點(diǎn)，找出不同雞種BF1基因序列上的差異，初步探討B(tài)F1基因在不同雞品種中的遺傳多態(tài)性及其進(jìn)化機(jī)制，也為雞抗病育種工作的研究提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集25個(gè)不同雞品種的血樣，選取的25個(gè)雞種分別為，來(lái)自揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遺傳資源實(shí)驗(yàn)室的雪山雞、青腳麻雞、廣西黃雞、文昌雞、溧陽(yáng)雞、太湖雞、AA雞、羅斯雞、安卡雞、隱性白羽肉雞、如皋黃雞和東鄉(xiāng)綠殼蛋雞，來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽科學(xué)研究所國(guó)家地方禽種資源基因庫(kù)的泰和烏骨雞、大骨雞、仙居雞、北京油雞、白耳雞（BE）、鹿苑雞、斗雞、茶花雞、固始雞、藏雞、狼山雞和蕭山雞，來(lái)自云南省野生動(dòng)物救護(hù)中心的紅色原雞亞種。

每個(gè)雞種選取10個(gè)樣本，并通過(guò)翅靜脈采集血液樣品l ml，保存在4 cC中。試驗(yàn)采取苯酚和氯仿從血液中提取DNA。將同一品種10只雞的混合DNA樣品送到深圳華大基因公司進(jìn)行目標(biāo)序列捕獲測(cè)序，選擇Gallus_gallus-5.0作為參照基因組。高通量測(cè)序DNA樣本的范圍為雞16號(hào)染色體，位置為41803～139165，共計(jì)97363 bp。參考序列為紅色原雞的基因序列。GenBank登錄號(hào)為693260。

1.2 序列分析

從測(cè)序的DNA序列中選擇BF1基因，利用MEGA6.06軟件對(duì)25個(gè)雞種的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，統(tǒng)計(jì)核苷酸突變位點(diǎn)，及與之相對(duì)應(yīng)的氨基酸突變位點(diǎn)和插入位點(diǎn)。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NCBI網(wǎng)站檢索Gallus gallus的BF1基因序列

BF1基因位于第16號(hào)染色體上的87140～89907位置。BF1基因總長(zhǎng)2 768 bp，其中CDS區(qū)長(zhǎng)為1083bp。在NCBI網(wǎng)站上檢索出Gallus gallus的BF1基因外顯子和內(nèi)含子情況如圖l所示。圖l顯示BF1基因由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成。

2.2 不同雞種BF1基因的SNP位點(diǎn)和Indel位點(diǎn)分布

通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子進(jìn)行鑒定，確定其相對(duì)位置。每個(gè)外顯子和內(nèi)含子的SNP數(shù)目見表l。

與參考序列相比，25個(gè)雞種中BF1基因共有171個(gè)單核苷酸多態(tài)性。BF1基因外顯子中共有108個(gè)SNP，突變個(gè)數(shù)明顯多于內(nèi)含子，說(shuō)明外顯子更具多態(tài)性。

由表l知，SNP主要發(fā)生在外顯子l和外顯子4上，其中外顯子4上有50個(gè)SNP，外顯子1次之，而外顯子5、外顯子6、外顯子7、外顯子8上沒(méi)有出現(xiàn)突變，說(shuō)明這些外顯子區(qū)域比較保守。

表2中的“長(zhǎng)度”表示不同雞種BF1基因的長(zhǎng)度，由于BF1基因存在插入和缺失，雞種BF1基因長(zhǎng)度不同。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)插入和缺失主要發(fā)生在外顯子1和內(nèi)含子5上。從表2中可以看出，與原雞序列相比，不同的25個(gè)雞種BF1基因序列都有核苷酸的缺失，其中AA雞、羅斯雞和安卡雞這些外來(lái)種發(fā)生核苷酸缺失最多，斗雞的核苷酸缺失最多達(dá)29個(gè)，狼山雞、綠殼蛋雞和茶花雞等地方種發(fā)生核苷酸缺失較少。大部分雞種BF1基因在外顯子l上都發(fā)生了較大片段的缺失，而大骨雞和固始雞BF1基因沒(méi)有核苷酸的缺失和插入以及單核苷酸突變（表3和表4），表明這2個(gè)雞種在BF1基因上具有保守性。

對(duì)于BF1基因.25個(gè)雞種中外顯子l上G/C突變發(fā)生較多，且都是非同義突變（V/L），其他都是同義突變。由表l知，外顯子l的核苷酸序列發(fā)生缺失，這些缺失也導(dǎo)致氨基酸缺失。在外顯子2和外顯子3上，這些雞種中分別有2個(gè)SNP位點(diǎn)為非同義突變，每個(gè)核苷酸突變導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸變異。外顯子4中C/T突變最多，且都是非同義突變。這些外顯子中SNP位點(diǎn)編碼的氨基酸有166個(gè)，其中有58個(gè)氨基酸發(fā)生了變異，表明氨基酸同源性高于核苷酸。

從表4中可以看出，不同雞種BF1基因外顯子4上有10個(gè)突變位點(diǎn)，核苷酸突變位點(diǎn)最多，其次是外顯子1，表明這2個(gè)外顯子區(qū)域具有豐富的多態(tài)性。

單核苷酸多態(tài)性存在于所有種中，25個(gè)雞種的外顯子中斗雞數(shù)量最多，氨基酸缺失數(shù)也最多。

2.3 BF1基因的MEGA系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA6.06對(duì)25個(gè)雞種的BF1基因進(jìn)行對(duì)比分析，選用Construct/Test Neighbor-Joining Tree（NJ）方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），Bootstrap的值設(shè)置成500。25個(gè)雞種根據(jù)其地理位置和氣候環(huán)境，大致可被分為3大類，文昌雞和雪山雞等聚為一類;斗雞、烏骨雞和鹿苑雞聚為一類;廣西黃雞單獨(dú)為一類。上述結(jié)果表明，BF1基因在進(jìn)化過(guò)程中存在豐富的遺傳多樣性。

3 討論

本研究報(bào)告了雞BF1基因在25個(gè)雞種中的SNP以及Indel情況。如果只考慮外顯子中發(fā)生的SNP個(gè)數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)高變區(qū)外顯子4上的SNP數(shù)量最多，其突變比例在44%以上，相對(duì)應(yīng)氨基酸突變數(shù)目和突變位點(diǎn)也最多，由此可以推測(cè)外顯子4在BF1基因中起決定性作用，決定著BF1基因的遺傳多樣性，可能存在與疾病有關(guān)的變異，這一發(fā)現(xiàn)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。而外顯子l上檢測(cè)到的單核苷酸多態(tài)性大部分是非同義替換，編碼的氨基酸沒(méi)有特定的差異，所以氨基酸水平上基本是保守的或半保守的?；谶@些特征，Shiina等報(bào)道，這種高度多態(tài)性似乎只能部分影響表達(dá)分子的結(jié)構(gòu)，而間接選擇可能是基因變異的主要驅(qū)動(dòng)力。

本研究發(fā)現(xiàn)斗雞外顯子中的SNP數(shù)目最多，茶花雞、大骨雞和文昌雞等發(fā)生SNP數(shù)目較少，固始雞外顯子中沒(méi)有SNP，這與研究報(bào)道的中國(guó)斗雞的遺傳多樣性豐富，固始雞因其獨(dú)特的特征特性和相對(duì)封閉的形成歷史具有較好的保守性的研究結(jié)果相吻合。

在系統(tǒng)聚類中，25個(gè)雞種分為3大類，但不同種間置信度水平并不高，這是由于該基因變異度高導(dǎo)致不同雞種之間的同源性低，這可能與中國(guó)地方多種生態(tài)類型、種群演變歷史以及豐富的遺傳多樣性有關(guān)，例如觀賞性的河南斗雞、藥用的烏骨雞等;廣西黃雞單獨(dú)為一類，表明廣西黃雞BF1基因?yàn)閱为?dú)起源，又因其分布于廣西壯族自治區(qū)，屬于放牧飼養(yǎng)，整個(gè)雞群的生長(zhǎng)都處在大自然狀態(tài)之下，生存能力和抗病性強(qiáng)：大骨雞，蕭山雞等其他21個(gè)雞種分為一類，其中羅斯雞與隱性白羽肉雞作為現(xiàn)代主要肉雞品種，具有生長(zhǎng)速度快，飼料報(bào)酬高的特點(diǎn)，但同時(shí)也存在抗病力尤其是先天免疫性能相對(duì)較差的問(wèn)題，BF1基因上SNP位點(diǎn)的缺失可能是影響因素之一。

雞的MHC多態(tài)性與疾病的抗性相關(guān)，如抗馬利克?。∕arek's disease，MD）。依照分子擬似學(xué)說(shuō)，某些個(gè)體對(duì)疾病的易感是由于病原體的抗原結(jié)構(gòu)與MHC分子相似，致使免疫系統(tǒng)無(wú)法識(shí)別，不能有效攻擊病原體，由于多態(tài)性的存在使這種“擬似”受到限制，從而使病原體不能在群體中大面積傳播。本研究比對(duì)分析了25個(gè)雞種BF1基因的序列，充分顯示了雞BF1基因豐富的多態(tài)性，它為基因改造提供了豐富的資源，為更多疾病控制提供了候選基因。因此，研究雞BF1基因多態(tài)性對(duì)于研究雞抗病性和易感性具有不可或缺的作用。