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    抗菌肽對(duì)煙草青枯菌的抑菌作用

    2018-09-10 15:26:36江仕龍劉明宏高亞星蔣選利
    關(guān)鍵詞:抑菌作用抗菌肽生物防治

    江仕龍 劉明宏 高亞星 蔣選利

    摘?要:煙草青枯病是煙草生產(chǎn)上的主要病害之一,安全、有效的防治煙草青枯病對(duì)煙草生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。為了解決煙草青枯病的防治這一難題,設(shè)計(jì)了5種人工合成的多肽和寡肽,采用抑菌圈測(cè)定法測(cè)定其對(duì)青枯菌的抑制效果。結(jié)果表明,編號(hào)為228的寡肽效果最好,有望成為新的青枯病生物防治藥劑。

    關(guān)鍵詞:抗菌肽;青枯菌;抑菌作用;生物防治

    中圖分類號(hào):Q93

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    文章編號(hào):1008-0457(2018)06-0092-03?國(guó)際DOI編碼:10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.016

    煙草青枯病(Tobacco bacterial wilt)是由青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起的危害世界煙草生產(chǎn)的重要病害。此病1880年首次發(fā)現(xiàn)于美國(guó),現(xiàn)已成為熱帶和亞熱帶煙區(qū)最常見的病害之一,在我國(guó)長(zhǎng)江以南各煙區(qū)發(fā)生普遍[1]。對(duì)煙草青枯病的防治,主要有選用抗病品種、優(yōu)化栽培管理和藥劑防治這幾個(gè)措施,但是沒有十分理想的防治手段。近年來(lái),尋找新的防治藥劑的目光落在了抗菌肽(antimicrobial peptide)上面[2]??咕氖莿?dòng)植物先天性免疫的重要組成部分,是動(dòng)植物防御微生物入侵的一道有效屏障[3]。它們能作用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、寄生蟲、癌細(xì)胞甚至是薄膜病毒,而絕大多數(shù)抗菌肽對(duì)哺乳動(dòng)物的正常細(xì)胞是無(wú)害的,并且殺菌機(jī)制與傳統(tǒng)抗生素完全不同[4]。

    本文在天蠶抗菌肽(Cecropin)的基礎(chǔ)上,通過修飾天蠶抗菌肽肽序,設(shè)計(jì)了5種多肽,采用抑菌圈測(cè)定法研究其對(duì)煙草青枯菌的抑菌作用。

    1?材料與方法

    1.1?材料

    所用的五種多肽由上海淘普生物科技有限公司合成(見表1)。煙草青枯病菌(R.solanacearum)由作者自己分離、純化獲得。

    1.2?方法

    于固體NA培養(yǎng)基上活化保存的青枯菌24 h(28℃),然后用接種環(huán)刮取活化的青枯菌到裝有約125 mL液體NA培養(yǎng)基的錐形瓶,并將錐形瓶置于28℃、200 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h 取少許培養(yǎng)液,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在490 nm處的吸光度,以蒸餾水作為對(duì)照,測(cè)得的OD值為1.70±0.05則可以直接用于下一步,如超過,則用無(wú)菌水稀釋培養(yǎng)液到該吸光度(此吸光度青枯菌濃度為106~107 cfu/mL,處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)。然后用移液槍取100 uL培養(yǎng)液到有固體NA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上,并用玻璃細(xì)菌涂布棒涂抹均勻待用。

    稱取適量人工合成的凍干肽粉于2 mL規(guī)格無(wú)菌離心管中,并加無(wú)菌水稀釋配成母液,再以母液加無(wú)菌水稀釋到其他濃度,最后得到500 μg/mL、250 μg/mL和125 μg/mL三個(gè)濃度,分別用A、B、C表示。然后取適量滅菌濾紙片于裝有肽溶液和無(wú)菌水的離心管中浸泡,將浸泡后的濾紙片用鑷子夾出,放置于涂有細(xì)菌培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿上,每個(gè)培養(yǎng)皿放同一處理的三個(gè)濾紙片,大致呈等邊三角形,每個(gè)處理用兩個(gè)培養(yǎng)皿,每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)做三個(gè)抑菌點(diǎn)測(cè)試,即相當(dāng)于6個(gè)重復(fù)。最后將培養(yǎng)皿置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng);于48 h后測(cè)量抑菌圈大小,記錄并拍照。

    2?結(jié)果與分析

    本次實(shí)驗(yàn)中使用的多肽,對(duì)煙草青枯病菌均有一定的抑制作用。其抑制作用的大小,與多肽的濃度有關(guān),高濃度的時(shí)候抑菌圈最大,即抑菌活性最強(qiáng),低濃度的時(shí)候抑菌圈小,即抑菌活性最弱。不同的多肽,其抑制作用不同,其中抑菌效果最好的是編號(hào)為228的多肽,最差的是編號(hào)為222的多肽。

    天蠶抗菌肽是一類具有抗菌活性的肽的總稱,自從Steiner等1881年首次命名了兩種天蠶抗菌肽以來(lái)[5],在常用的在線抗菌肽據(jù)庫(kù)APD(the Antimicrobial Peptides Database)和CAMPR3(Collection of Anti-Microbial Peptides)中,已經(jīng)各自收錄了37條和185條天蠶抗菌肽序列(含人工合成序列),是抗菌肽研究中的熱門家族。但其對(duì)煙草青枯病菌是否具有抑菌作用,未見報(bào)道。在本試驗(yàn)中,只有11個(gè)氨基酸殘基的寡肽比含有29個(gè)氨基酸殘基的多肽抑菌效果好,和以前報(bào)道的研究結(jié)果相似[6-7]。

    3?結(jié)論與討論

    在活性較強(qiáng)的4個(gè)寡肽中,雖然氨基酸殘基一樣,序列也高度相似,但是抑菌效果差別較大??咕牡慕Y(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)至少有7個(gè)因素和肽的生物活性有關(guān),它們是大小、肽序、結(jié)構(gòu)度、凈電荷、總疏水性、總親水性、螺旋的疏水面和親水面各自的寬度[8]。通過APD的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具,得知所有寡肽的凈電荷都是 +4,但只有編號(hào)為228的寡肽的疏水性基團(tuán)所占比例為54%,其它3種寡肽的疏水性基團(tuán)所占比例均為63%,這可能在一定程度上影響了寡肽的活性。

    利用抗菌肽防治煙草青枯病屬于生物防治的一種,當(dāng)前研究得比較多的生物防治方法是利用生防菌來(lái)防治煙草青枯病,即為傳統(tǒng)的生物防治方法。肖田等[9]的研究指出,生防菌防治效果的好壞,除了與生防菌菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有關(guān),還與該菌株是否能夠在寄主上定殖、該菌株與致病菌位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)能力以及是否能夠誘導(dǎo)寄主抗性等因素有關(guān)。這些因素,加上青枯菌的多樣性和煙草不同的主栽品種,使得利用生防菌這種傳統(tǒng)的生物防治方法的防治效果不穩(wěn)定,或者前期防治效果好后期防治效果差的情況時(shí)有發(fā)生[10]。相比之下,抗菌肽直接作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜[11-12],所以受其他因素的影響程度比生防菌小。因此,將篩選到抑菌效果理想的抗菌肽,利用微生物發(fā)酵技術(shù)繁殖這種抗菌肽,用于生產(chǎn)中防治植物病害,是一種全新的生物防治技術(shù),該方法屬于現(xiàn)代生物防治方法。這種利用抗菌肽的現(xiàn)代生物防治方法在人類疫病防治方面應(yīng)用較多,而在植物病害防治方面非常少。本研究以煙草青枯病為對(duì)象,進(jìn)行了初步的抑制作用研究,僅僅是利用抗菌肽防治植物病害研究的開始,隨后將進(jìn)一步進(jìn)行田間防效試驗(yàn)研究,為控制煙草青枯病提供新的生防技術(shù)。

    參?考?文?獻(xiàn):

    [1]?周志成,肖啟明,曾愛平,等.煙草病蟲害及其防治[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2009:56.

    [2]?Zasloff M.Antimicrobial peptides of multicellular organisms[J].Nature,2002,415(6870):389-395.

    [3]?司菡.抗菌肽的研究進(jìn)展[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2008,8(4):393-396.

    [4]?徐靈龍,王云峰,石星明,等.抗菌肽及其功能研究[J].中國(guó)生物工程雜志,2007,27(1):115-118.

    [5]?Stciner H,Hultmark D,Engstrom A,et al.Sequence and specicity of two antibacterial proteins involved in insect immunity[J].Nature,1981(292):246-8.

    [6]?Andreu D,Ubach J,Boman A, et al.Shortened cecropin A-melittin hybrids Significant size reduction retains potent antibiotic activity[J].FEBS letters,1992,296(2):190-194.

    [7]?Ferre R,Badosa E,F(xiàn)eliu L,et al.Inhibition of plant-pathogenic bacteria by short synthetic cecropin A-melittin hybrid peptides[J].Applied and environmental microbiology,2006,72(5):3302-3308.

    [8]?Tossi A,Sandri L,Giangaspero A.Amphipathic,α-helical antimicrobial peptides[J].Peptide Science,2000,55(1):4-30.

    [9]?肖?田,肖崇剛,鄒?陽(yáng),等.青枯菌無(wú)致病力菌株對(duì)煙草青枯病的控病作用初步研究[J].植物保護(hù),2008,34(2):79-82.

    [10]?周崗泉,張建華,陳澤鵬,等.煙草內(nèi)生細(xì)菌及其對(duì)煙草青枯病的生物防治研究[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào),2008,14(2):31-34.

    [11]?Epand R M,Vogel H J.Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes,1999,1462(1):11-28.

    [12]?Shai Y.Mechanism of the binding,insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by α-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes,1999,1462(1):55-70.

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