鹽脅迫下棉花萌發(fā)、成苗和產(chǎn)量相關(guān)性狀的QTL定位

徐劍文 孔杰 趙君 王為然 劉劍光 朱家輝 王希睿 徐海江 肖松華 阿里甫·艾爾西

摘要：利用感鹽棉花品種泗抗1號和耐鹽棉花新品系蘇S012為親本配置雜交組合，構(gòu)建F，分離群體和F2∶3。家系。分別調(diào)查2個(gè)親本和299個(gè)F2∶3家系萌發(fā)期、苗期以及鈴質(zhì)量、鈴數(shù)、衣分和產(chǎn)量的鹽害率，作為QTL定位的表型數(shù)據(jù)。在棉花A5、D5、D8、Dl0、A13和D13染色體上共定位到13個(gè)耐鹽相關(guān)QTL，分別解釋2.81%、15.18%、1.78%、5.39%、2.92%、8.38%、9.65%、5.06%、0.46%、2.17%、2.27%、13. 25%、1.50%的表型變異率。

關(guān)鍵詞：棉花;耐鹽性;分子標(biāo)記;QTL定位

中圖分類號：S562.035.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號： 1000-4440（2018） 05-0972-06

提高作物產(chǎn)量和開發(fā)新的耕地，是提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率的2個(gè)重要方式。而鹽脅迫作為一種主要的環(huán)境脅迫，是提高土地利用率的重要限制性因素。中國西北、東北及濱海地區(qū)的鹽堿荒地和鹽堿障礙耕地總面積超過3.33xl07 hm2.其中具有農(nóng)業(yè)利用潛力的近1.33xl07hm2.占全國耕地總面積的10%以上。棉花作為耐鹽先鋒作物，在鹽堿地廣泛種植，在提高土地利用率上發(fā)揮了重要作用。通過現(xiàn)代分子生物學(xué)方法進(jìn)一步提高棉花的抗鹽性，對于發(fā)掘鹽堿地利用潛力具有極其重要的意義。

鹽脅迫影響棉花從出苗到成熟各階段，其危害程度最終以產(chǎn)量和纖維品質(zhì)表現(xiàn)。萌發(fā)期，鹽脅迫主要影響種子的吸脹吸水，延緩棉花萌發(fā)，并降低萌發(fā)率。苗期，鹽脅迫會引起幼苗畸形，阻礙葉綠素合成，尤其是二、三葉期的幼苗對鹽脅迫最為敏感，嚴(yán)重時(shí)棉花葉片發(fā)軟、色暗、功能期短，側(cè)根發(fā)生少，干物質(zhì)積累減少，生長緩慢，甚至死苗?，F(xiàn)蕾期，鹽脅迫會導(dǎo)致棉花生長勢下降，果枝數(shù)目減少，進(jìn)人生殖生長期延遲。開花期，受鹽脅迫影響，棉花花期縮短，結(jié)鈴性降低，并且棉鈴發(fā)育受到抑制，鈴質(zhì)量下降。棉花不同品種之間和同一品種不同生長階段之間的耐鹽性都有明顯的差異。從棉花生育期看，幼苗階段和開花結(jié)鈴期對鹽脅迫較為敏感，特別是三葉期前的幼苗。通過傳統(tǒng)育種方式提高棉花耐鹽性的效率低，周期長，投入高。轉(zhuǎn)基因育種和分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)是提高育種進(jìn)程的有效策略。其中，耐鹽堿基因的發(fā)掘是轉(zhuǎn)基因育種的重要基礎(chǔ)之一。而開發(fā)與耐鹽性狀連鎖的分子標(biāo)記，是分子標(biāo)記輔助育種的重要組成環(huán)節(jié)。

本研究利用感鹽棉花品種泗抗l號和耐鹽棉花新品系蘇S012為親本配置雜交組合，構(gòu)建F，分離群體和F2∶3家系，分別調(diào)查2個(gè)親本和F2∶3家系的萌發(fā)期、苗期以及鈴質(zhì)量、鈴數(shù)、衣分和產(chǎn)量的鹽害率，作為QTL定位的表型數(shù)據(jù)，用2500對SSR引物篩選在兩個(gè)親本間具有多態(tài)性的標(biāo)記，構(gòu)建棉花遺傳連鎖圖譜，篩選與耐鹽基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，對棉花耐鹽性狀QTL進(jìn)行定位，為進(jìn)一步定位克隆棉花耐鹽基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2015年夏季在江蘇省南京市以耐鹽棉花新品系蘇S012為母本、感鹽棉花品種泗抗l號為父本雜交獲得F1代種子。2015年冬季在海南省三亞市種植F1代，自交獲得F2代種子。2016年夏季在南京種植含有299個(gè)單株的F2代分離群體，人工自交獲得F2∶3家系。2017年夏季在江蘇省大豐市沿海灘涂鹽堿地種植親本、F1和F2∶3家系。

1.2耐鹽性狀調(diào)查

2017年夏季在大豐市稻麥原種場鹽堿地直播種植兩親本和F2∶3家系，設(shè)3次重復(fù)，土壤含鹽量為0.458%，在相鄰非鹽堿地直播兩親本和F2∶3家系作為對照。播種后10 d統(tǒng)計(jì)出苗率，三葉期統(tǒng)計(jì)幼苗存活率。吐絮后，調(diào)查單株鈴數(shù)，計(jì)算親本和每F2∶3家系的平均單株鈴數(shù)。收取50鈴，調(diào)查單鈴質(zhì)量和衣分。收取親本和每家系全部籽棉，計(jì)算產(chǎn)量。計(jì)算相對鹽害率，萌發(fā)相對鹽害率=（對照出苗率一鹽堿地出苗率）/對照出苗率×100%，苗期相對鹽害率=（對照存活率一鹽堿地存活率）/對照幼苗存活率×100%，鈴質(zhì)量相對鹽害率=（對照鈴質(zhì)量一鹽堿地鈴質(zhì)量）/對照鈴質(zhì)量x100%，鈴數(shù)相對鹽害率=（對照鈴數(shù)一鹽堿地鈴數(shù)）/對照鈴數(shù)×100%，衣分相對鹽害率=（對照衣分一鹽堿地衣分）/對照衣分×100%，產(chǎn)量相對鹽害率=（對照產(chǎn)量一鹽堿地產(chǎn)量）/對照產(chǎn)量×100%。

1.3 F2∶3家系耐鹽性狀的相關(guān)性分析

利用SPSS 22軟件，對F2∶3家系的萌發(fā)相對鹽害率、苗期相對鹽害率、鈴質(zhì)量相對鹽害率、鈴數(shù)相對鹽害率、衣分相對鹽害率和產(chǎn)量相對鹽害率進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)選用Spearman，顯著性檢驗(yàn)選用雙尾檢驗(yàn)，并對顯著性相關(guān)進(jìn)行標(biāo)注。

1.4 棉花基因組DNA提取、親本多態(tài)性引物篩選

用CTAB法提取蘇S012、泗抗l號和299個(gè)F2代單株的基因組DNA。在Cottongen數(shù)據(jù)庫（ht-tps：//www.cottongen.org/search/markers）中選擇2500對SSR（Simple sequence repeat）引物，由南京金斯瑞公司合成，檢測2個(gè)親本基因組之間的多態(tài)性，并用多態(tài)性引物對F2單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。參照張軍等的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染。

1.5 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

利用JoinMap3.0軟件對多態(tài)性引物進(jìn)行分析，并參考分子標(biāo)記的染色體定位信息，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。利用Windows QTLs Cartographer 2.0軟件的復(fù)合區(qū)間作圖法檢測棉花耐鹽堿性狀的QTL，進(jìn)行1 000次隨機(jī)抽樣測驗(yàn)，選擇LOD值≥2.5的QTL，并計(jì)算貢獻(xiàn)率（R2）、加性效應(yīng)（A）和顯性效應(yīng)（D）。利用MapChart 2.1軟件繪制遺傳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本蘇S012和泗抗1號的耐鹽性

萌發(fā)后10 d、幼苗三葉期分別調(diào)查親本材料蘇S012和泗抗1號在鹽堿地和非鹽堿地的萌發(fā)率、成苗率，并在吐絮后調(diào)查親本材料的衣分、單鈴質(zhì)量、單株鈴數(shù)和產(chǎn)量（表1）。結(jié)果顯示，受鹽脅迫影響，蘇S012和泗抗l號的萌發(fā)率、成苗率、衣分、單鈴質(zhì)量、單株鈴數(shù)和產(chǎn)量都顯著降低。進(jìn)一步計(jì)算相對鹽害率后發(fā)現(xiàn)，蘇S012的萌發(fā)相對鹽害率、苗期相對鹽害率、衣分相對鹽害率、鈴質(zhì)量相對鹽害率和產(chǎn)量鹽害率均顯著低于泗抗l號，而泗抗l號的鈴數(shù)相對鹽害率顯著低于蘇S012，并且兩親本材料在萌發(fā)相對鹽害率、苗期相對鹽害率、衣分相對鹽害率、鈴數(shù)相對鹽害率上的差異達(dá)到了極顯著水平。說明親本材料蘇S012在萌發(fā)期、苗期以及衣分、單鈴重和產(chǎn)量上耐鹽性顯著高于泗抗l號，而在單株鈴數(shù)上，泗抗l號的耐鹽性顯著高于蘇S012。

2.2 F2∶3家系耐鹽性狀相關(guān)性分析

利用SPSS 22軟件對F2∶3家系的萌發(fā)相對鹽害率、苗期相對鹽害率、衣分相對鹽害率、鈴質(zhì)量相對鹽害率、鈴數(shù)相對鹽害率和產(chǎn)量相對鹽害率之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果（表2）顯示：萌發(fā)相對鹽害率與苗期相對鹽害率、衣分相對鹽害率、產(chǎn)量相對鹽害率呈正相關(guān)關(guān)系，與鈴數(shù)相對鹽害率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;苗期相對鹽害率與產(chǎn)量相對鹽害率呈正相關(guān)關(guān)系，與鈴數(shù)相對鹽害率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;衣分相對鹽害率與鈴質(zhì)量相對鹽害率呈正相關(guān)關(guān)系：鈴質(zhì)量相對鹽害率與產(chǎn)量相對鹽害率呈正相關(guān)關(guān)系：鈴數(shù)相對鹽害率與產(chǎn)量相對鹽害率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.3 棉花連鎖圖譜構(gòu)建

用2 500對SSR引物，檢測兩親本之間的多態(tài)性，共篩選到68個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性頻率為2.72%。用68個(gè)多態(tài)性SSR引物檢測299個(gè)F2∶3家系的基因型，并用Jionmap軟件構(gòu)建連鎖圖（LOD≥3）。所繪制連鎖圖包含20個(gè)標(biāo)記和8個(gè)連鎖群，長度在15.0cM至68.3 cM之間，總長度為259.4 cM.標(biāo)記間平均距離為21.74 cM，各連鎖群含2至4個(gè)標(biāo)記。根據(jù)棉花分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫（https：//www.cottongen.org/search/markers）數(shù)據(jù)，這8個(gè)連鎖群被定位在棉花A5、D5、D8、Dl0、A13和D13染色體上，其中D5和Dl0染色體上定位到了2個(gè)連鎖群（圖1）。

2.4 棉花耐鹽QTL初定位

分別用F2∶3家系的萌發(fā)相對鹽害率、苗期相對鹽害率、衣分相對鹽害率、鈴質(zhì)量相對鹽害率、鈴數(shù)相對鹽害率和產(chǎn)量相對鹽害率，在Windows QTLs Cartogra-pher 2.0軟件中用復(fù)合區(qū)間作圖法檢測耐鹽相關(guān)QTL，共檢測到13個(gè)LOD值大于2.5的QTL位點(diǎn)（圖l、表3）。其中用萌發(fā)相對鹽害率數(shù)據(jù)共檢測到1個(gè)QTL，命名為qSTG，位于Dl0染色體上，表型貢獻(xiàn)率為2.81%。用苗期相對鹽害率數(shù)據(jù)共檢測到4個(gè)QTL，命名為qSTS-/、qSTS-2、qSTS-3、qSTS-4，分別位于A5、D5、Dl0、D13染色體上，表型貢獻(xiàn)率分別為15.18%、1.78%、5.39%、2.92%。用衣分相對鹽害率數(shù)據(jù)共檢測到2個(gè)QTL，命名為qSTL-1、qSTL-2，分別位于D5和A13染色體上，表型貢獻(xiàn)率分別為8.38%和9.65%。用鈴質(zhì)量相對鹽害率數(shù)據(jù)檢測到1個(gè)QTL，命名為qSTW，位于D8染色體上，表型貢獻(xiàn)率為5.06%。用鈴數(shù)相對鹽害率數(shù)據(jù)共檢測到3個(gè)QTL，命名為qSTBN-1、qSTBN-2、qSTBN-3，分別位于D5、Dl0和D13染色體上，表型貢獻(xiàn)率分別為0.46%、2.17%、2.27%。用產(chǎn)量相對鹽害率共檢測到2個(gè)QTL，命名為qSTP-1、qSTP-2，分別位于A5、Dl0染色體上，表型貢獻(xiàn)率分別為13.25%、1.50%。

3 討論

鹽脅迫首先對植物造成持續(xù)存在的滲透脅迫，并表現(xiàn)為離子失調(diào)引起的毒害和營養(yǎng)虧缺，繼而引起氧化脅迫并導(dǎo)致膜透性改變、代謝紊亂、有毒物質(zhì)積累，最終影響植物的生長發(fā)育和形態(tài)建成。植物耐鹽堿性是一個(gè)復(fù)雜的生物機(jī)制，是各種生理生化過程協(xié)同作用的結(jié)果。在進(jìn)化過程中，植物形成避鹽和提高耐鹽性2種機(jī)制以應(yīng)對鹽脅迫帶來的危害。避鹽主要包括泌鹽、稀鹽、積鹽和拒鹽4種方式。植物主要通過滲透調(diào)節(jié)、營養(yǎng)元素平衡和增強(qiáng)抗氧化脅迫，提高耐鹽性。大量相關(guān)基因在植物耐鹽機(jī)制中起到重要作用，它們主要包括離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因、信號傳導(dǎo)相關(guān)基因、細(xì)胞抗氧化相關(guān)基因等。對這些基因的挖掘，有助于進(jìn)一步提高植物耐鹽性。

鹽脅迫對棉花從出苗到成熟各時(shí)期都有不同的影響，尤其是幼苗期和開花結(jié)鈴期更加敏感，鹽脅迫的危害最終表現(xiàn)在產(chǎn)量和纖維品質(zhì)上。此外，在直播條件下，鹽堿地種植棉花的產(chǎn)量受萌發(fā)率、成苗率、單株鈴數(shù)、單鈴質(zhì)量、衣分等多種性狀共同決定。因此，只以棉花苗期萌發(fā)率作為耐鹽指標(biāo)進(jìn)行QTL定位不能完全發(fā)掘耐鹽相關(guān)基因。本研究在調(diào)查產(chǎn)量性狀的同時(shí)，分別調(diào)查了萌發(fā)率、成苗率、鈴質(zhì)量、鈴數(shù)和衣分5個(gè)表型數(shù)據(jù)，用于QTL定位，為較全面地發(fā)掘耐鹽相關(guān)基因打下了基礎(chǔ)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，萌發(fā)率、成苗率、產(chǎn)量之間存在顯著正相關(guān)，而鈴質(zhì)量和衣分之間也存在顯著正相關(guān)。說明應(yīng)對鹽脅迫對產(chǎn)量的危害，可以通過發(fā)掘幼苗期耐鹽相關(guān)基因：而應(yīng)對鹽脅迫對纖維品質(zhì)的危害，僅僅發(fā)掘幼苗期耐鹽相關(guān)基因則顯得不足。QTL定位結(jié)果也顯示，苗期耐鹽相關(guān)QTL qSTS-/、qSTS-3分別與產(chǎn)量相關(guān)QTL qSTP一I、qSTP一2定位區(qū)間重合。同樣說明通過發(fā)掘棉花苗期耐鹽相關(guān)基因，可以應(yīng)對鹽脅迫對最終產(chǎn)量的危害。

鹽脅迫下單鈴質(zhì)量是影響棉花產(chǎn)量的重要性狀，本研究相關(guān)性分析結(jié)果表明鈴質(zhì)量相對鹽害率與產(chǎn)量相對鹽害率呈正相關(guān)關(guān)系。李建亮也發(fā)現(xiàn)，隨著土壤鹽濃度提高，苗期感鹽品種中棉所102和耐鹽品種中棉所103的產(chǎn)量都逐漸減少，并且兩品種間的產(chǎn)量差異隨鹽濃度提高而增加，這種差異主要是由于鹽分的提高顯著降低了單鈴質(zhì)量和鈴數(shù)。此外，本研究中F2∶3群體的鈴質(zhì)量相對鹽害率與苗期相對鹽害率之間的相關(guān)性不顯著。在李建亮的研究中，苗期感鹽品種中棉所102鈴質(zhì)量性狀的耐鹽性高于耐鹽品種中棉所103，兩品種在苗期的耐鹽性和鈴質(zhì)量的耐鹽性上沒有直接相關(guān)性。因此，提高鹽脅迫下棉花的鈴質(zhì)量，是增加鹽堿地種植棉花產(chǎn)量的有效途徑。根據(jù)F2∶3群體的鈴質(zhì)量性狀，本研究在棉花D8染色體上定位到1個(gè)與鹽脅迫下鈴質(zhì)量相關(guān)的QTL qSTBW，該QTL位點(diǎn)與萌發(fā)、成苗相關(guān)QTL位點(diǎn)的區(qū)間沒有重合。對該QTL的進(jìn)一步研究和利用將在棉花耐鹽分子育種中發(fā)揮積極的作用。

單株鈴數(shù)是影響棉花產(chǎn)量的另一個(gè)重要性狀。QTL定位結(jié)果顯示，鈴數(shù)相關(guān)QTL qSTBN-1、qSTBN-2、qSTBN-3分別與qSTS-2、qSTG、qSTS-4的定位區(qū)間重合，而萌發(fā)相對鹽害率、苗期相對鹽害率與鈴數(shù)相對鹽害率呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。推測原因是因?yàn)槊劝l(fā)期和苗期的耐鹽性影響了成苗率，繼而影響了種植密度，從而導(dǎo)致部分耐鹽性較差的株系反而具有更多的鈴數(shù)。本試驗(yàn)從實(shí)際生產(chǎn)角度出發(fā)，采用鹽堿地直播的方式鑒定群體的耐鹽性。若要揭示影響鹽堿地結(jié)鈴性的具體分子機(jī)制，需要再采用營養(yǎng)缽育苗后移栽的方式進(jìn)行鑒定，才能獲得影響鹽堿地結(jié)鈴性的更加精確的數(shù)據(jù)。

棉花基因組總長約為5000 cM.需要約5000個(gè)分子標(biāo)記才能達(dá)到遺傳圖譜的表達(dá)飽和。本研究所用兩個(gè)親本材料均為陸地棉，遺傳背景差異小，多態(tài)性SSR標(biāo)記數(shù)量偏少，共篩選到68個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性頻率為2.72%。因此在遺傳圖譜中，標(biāo)記間遺傳距離較大，且標(biāo)記數(shù)目較少。在下一步工作中，將通過開發(fā)新的分子標(biāo)記，以及利用極端性狀混池重測序（Bulk segregant analysis-sequence，BSA-seq）技術(shù)進(jìn)一步縮小定位區(qū)間、加大遺傳圖譜飽和度。本研究的結(jié)果為未來耐鹽相關(guān)基因的定位和標(biāo)記輔助選擇育種工作奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。