貝伐單抗多囊脂質(zhì)體的處方優(yōu)化及體外釋放特性研究

王毅云 慕宏杰 華紅臣 姜瑩 孟慶慶 王愛萍 劉沙 孫考祥

中圖分類號 R943 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）07-0922-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.14

摘 要 目的：制備具有緩釋作用的貝伐單抗（BEV）多囊脂質(zhì)體（BEV-MVLs），并對其體外釋放特性進行研究。方法：采用復乳法制備BEV-MVLs，以有機相中三油酸甘油酯（TO）的濃度、1，2-二油?；字Ｄ憠A（DOPC）-膽固醇（CH）的比值（mol/mol）、外水相中L-賴氨酸的濃度為因素，以包封率為指標，采用Box-Behnken設計-響應面法對處方進行優(yōu)化。采用倒置熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察BEV-MVLs的形態(tài)，激光粒度儀測定其粒徑，高效液相色譜法測定BEV含量并計算其包封率和體外累積釋放度。結(jié)果：最優(yōu)處方為有機相中TO 2.72 mmol/L、DOPC-CH比值0.67（mol/mol）、外水相中L-賴氨酸40 mmol/L。所制BEV-MVLs的包封率為（80.65±4.42）%（n=3），與預測值的相對誤差為2.54%；脂質(zhì)體外觀呈球形，大小較均勻，為典型的非同心囊泡結(jié)構(gòu)，平均粒徑為16.80 μm；30 d的體外累積釋放度約為92%。結(jié)論：成功制得具有緩釋作用的BEV-MVLs，其包封率達到預期效果。

關鍵詞 貝伐單抗；多囊脂質(zhì)體；復乳法；Box-Behnken設計-響應面法；處方優(yōu)化；體外釋放

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Bevacizumab （BEV） multivesicular liposomes （BEV-MVLs） with sustained-effect， and to study their in vitro release characteristics. METHODS： BEV-MVLs were prepared by double emulsion method. Box-Behnken design-response surface methodology was used to optimize the prescription with the concentration of glycerol trioleate （TO） in organic phase， ratio of 1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine （DOPC）-cholesterol （CH） （mol/mol）， the concentration of L-lysine in external water phase as factors， using encapsulation rate as index. The morphology of BEV-MVLs was observed by inverted fluorescence microscope and SEM； particle size was determined by laser particle size analyzer； the BEV content was determined by HPLC and calculate the encapsulation rate and in vitro accumulative release rate. RESULTS： The optimized prescription was as follows as TO of 2.72 mmol/L in organic phase， DOPC-CH ratio of 0.67 （mol/mol） and L-lysine of 40 mmol/L in external water phase. The encapsulation rate of BEV-MVLs was （80.65±4.42）% （n=3）， and relative error of it to predicted value was 2.54%. The liposomes were spherical in appearance shape and uniform in size， and they were typical non-concentric vesicle structure with average particle size of 16.80 μm. 30 d in vitro accumulative release rate was about 92%. CONCLUSIONS： Prepared BEV-MVLs show sustained-effect， and their encapsulation rate reaches the expected effect.

KEYWORDS Bevacizumab； Multivesicular liposomes； Double emulsion method； Box-Behnken design-response methodology； Formulation optimization； in vitro release

貝伐單抗（Bevacizumab，BEV）為重組抗血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）人源化單克隆抗體，作為全球首個上市的VEGF抑制劑，其通過競爭性抑制VEGF與內(nèi)皮細胞表面受體結(jié)合、特異性阻斷VEGF的生物學效應、抑制內(nèi)皮細胞增殖、降低血管通透性，從而阻止新生血管形成[1-2]。由于眼部脈絡膜新生血管（Choroidal neovascularization，CNV）的形成與VEGF的過度表達有關[3]，臨床上廣泛將BEV用于眼部玻璃體注射治療CNV異常生長導致的濕性老年性黃斑變性（Wet-age-related macular degeneration，Wet-AMD），取得明顯效果[4-5]。

由于BEV在玻璃體中的消除半衰期為3～5 d[6]，Wet-AMD患者玻璃體腔頻繁注射易產(chǎn)生眼內(nèi)炎、白內(nèi)障、視網(wǎng)膜脫落等并發(fā)癥；且研究表明，隨著治療時間的推移，玻璃體腔中的蛋白水解酶會逐漸增多，導致注入玻璃體的藥物分解清除速率加快[7]。因此，開發(fā)BEV的長效緩釋制劑，以減少注射次數(shù)是非常必要的。

多囊脂質(zhì)體（Multivesicular liposomes，MVLs），是利用貯庫泡沫技術研發(fā)的一種新型脂質(zhì)體[8]，適合于包封水溶性藥物[9]。與普通脂質(zhì)體相比，MVLs具有更大的粒徑和包封容積，所以包封率較高；MVLs還具有獨特的非同心囊泡結(jié)構(gòu)，藥物釋放取決于囊泡的不斷破裂，因而注射給藥后，能在注射部位形成良好儲庫，具有緩釋效果[10]。國外已有布比卡因、阿糖胞苷、硫酸嗎啡的MVLs制劑成功上市[11]。本研究旨在將BEV包封于MVLs中，制備一種BEV眼部玻璃體注射給藥的緩釋制劑BEV- MVLs，對其處方進行優(yōu)化，并對其體釋放特性進行評價。

1 材料

1.1 儀器

S18N-10G高速分散機和RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國艾卡儀器設備有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；LC20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；Axio Vert.A1倒置顯微鏡（德國卡爾蔡司光學有限公司）；EM-30 Plus臺式掃描電鏡（韓國Coxem公司）；2000激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）；TG-16S臺式微量高速離心機（四川蜀科儀器公司）；SHA-C水浴振蕩器（常州金壇良友儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

BEV原料藥（山東綠葉制藥有限公司，批號：YJJ192- 0033-0003，純度：98%）；BEV對照品（瑞士羅氏制藥公司，批號：N3539B01，純度：98%）；二棕櫚酰磷脂酰甘油（DPPG，批號：556600-2140163-01）、1，2-二油?；字Ｄ憠A（DOPC，批號：560300-2150040-01/905）均購自德國Lipoid公司；三油酸甘油酯（TO，批號：20150421，化學純）、L-賴氨酸（批號：20151207，純度：97%）、蔗糖（批號：20151203，分析純）、膽固醇（CH，批號：20140418，分析純）、葡萄糖（批號：20160111，分析純）均購自國藥集團化學試劑有限公司；人血清白蛋白（美國Sigma公司，批號：SLBT4199）；曲拉通X-100（煙臺賽爾斯生物技術有限公司，批號：C34H62011）。

2 方法與結(jié)果

2.1 BEV-MVLs的制備

采用復乳法制備BEV-MVLs。按處方稱取DOPC、DPPG、TO、CH溶于1 mL的氯仿中作為有機相，向其滴加等體積含25 mg BEV的內(nèi)水相[pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS），含5%蔗糖和1%人血清白蛋白]，以11 500 r/min的轉(zhuǎn)速高速剪切6 min形成W/O型初乳；向初乳中加入一定體積外水相（含L-賴氨酸和4%葡萄糖），以7 500 r/min的轉(zhuǎn)速高速剪切1 min，形成W/O/W型復乳。將復乳轉(zhuǎn)移至盛有外水相的梨形瓶中，在37 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉有機溶劑，即得BEV-MVLs混懸液。

2.2 BEV含量檢測方法的建立及包封率的計算

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Bio-Monolith Protein A（4.95 mm×5.2 mm，0.10 mL）；流動相A：PBS（pH 7.4），流動相B：0.5 mol/L醋酸溶液（pH 2.5），梯度洗脫；流速：1.5 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：280 nm；進樣量：20 μL。梯度洗脫程序見表1。

2.2.2 供試品溶液的制備 取BEV-MVLs混懸液1 mL，置于10 mL量瓶中，加10%曲拉通X-100破乳，用pH 7.5的PBS定容，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 專屬性考察 以不含BEV的空白MVLs作為空白溶液，以BEV水溶液作為對照品溶液，以BEV-MVLs混懸液作為樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，BEV的保留時間為2.3 min，峰形良好，且樣品峰處無雜質(zhì)干擾，說明該分析方法具有良好的專屬性。色譜圖見圖1。

2.2.4 線性關系考察 取0.05、0.5、1、2.5、5 mg/mL的系列BEV對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標（y）、BEV質(zhì)量濃度為橫坐標（x）進行線性回歸，得回歸方程為y=106x-31 596（r=0.999 4），可知BEV在0.05～5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

2.2.5 精密度考察 取0.05、1、5 mg/mL的BEV對照品溶液，各3份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，同日內(nèi)各測定3次，連續(xù)測定3 d，考察日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果顯示，日內(nèi)RSD分別為1.63%、1.44%、0.56%（n=3），日間RSD分別為1.51%、1.82%、0.51%（n=3），符合相關要求。

2.2.6 準確度考察 分別精密量取BEV對照品溶液0.02、0.4、4 mL，各3份，置于10 mL量瓶中，加入2 mL空白MVLs，用10%曲拉通X-100破乳，定容，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液進樣測定，記錄峰面積，計算BEV含量，以測得量/加入量×100%計算加樣回收率。結(jié)果顯示，平均加樣回收率分別為99.00%、98.67%、99.03%，RSD分別為1.75%、1.55%、0.61%（n=3），符合相關要求。

2.2.7 包封率測定 取BEV-MVLs 0.5 mL，加生理鹽水稀釋，600×g離心8 min，除去上清液，沉淀用10%曲拉通X-100破乳后，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算藥物包封部分的含量m包，另取相同體積的BEV-MVLs直接用10%曲拉通X-100破乳，測定并計算BEV總含量 m總，計算包封率（%）=m包/m總×100%。

2.3 Box-Behnken設計-響應面法優(yōu)化處方

根據(jù)預試驗結(jié)果，確定影響B(tài)EV-MVLs包封率的主要因素包括有機相中TO的濃度（X1，mmol/L）、DOPC- CH的比值（X2，mol/mol）和外水相中L-賴氨酸的濃度（X3，mmol/L），以三者為因素，采用Box-Behnken設計-響應面法設計試驗，每個因素3個水平，以包封率為指標（Y），采用Design-Expert 8.0.6軟件生成17組試驗方案。因素與水平見表2，Box-Behnken設計與結(jié)果見表3。

2.3.1 回歸方程的擬合 利用Design-Expert 8.0.6軟件對各因素及響應值進行回歸分析，得到擬合方程為Y=80.57+7.21X1+2.10X2+6.44X3-2.68X1X2-5.03X1X3+4.09X2X3-15.68X12-14.16X22-5.51X32（R2=0.965 0，P<0.01，失擬項P>0.05）。方差分析結(jié)果見表4。

由表4可知，模型P<0.01，說明達到極其顯著的水平，此外失擬項P>0.05，說明該方程能很好擬合和預測各因素與Y的關系，其中X1、X3、X1X3、X12、X22、X32對Y有顯著影響（P<0.05）。對模型進行優(yōu)化，刪除方差分析表中P>0.05的不顯著項，優(yōu)化后的方程為Y=80.57+7.21X1-2.10X2+6.44X3-5.03X1X3-15.68X12-14.16X22-5.51 X32（R2=0.936 0，P<0.01，失擬項P>0.05），優(yōu)化后的方程仍有統(tǒng)計學意義，具備良好擬合度。

2.3.2 響應面的優(yōu)化與預測 基于實際試驗要求，追求Y的最大化，對模型進一步處理，各因素對Y的響應面圖和等高線圖見圖2。

響應面中的橢圓形和較陡坡度代表兩因素交互作用顯著，而圓形和較緩坡度代表兩因素交互作用不顯著，極值出現(xiàn)于響應面的最高處或等值線最小橢圓的中心點。3因素對BEV-MVLs的Y影響大小為X1>X3>X2，與方差分析結(jié)果一致。根據(jù)各因素變量范圍對Y影響的期望值，選擇優(yōu)化后的處方中有機相中TO的濃度為2.72 mmol/L、外水相中L-賴氨酸的濃度為40 mmol/L，DOPC-CH比值為0.67（mol/mol），在此條件下，模型預測包封率為82.7%。

2.3.3 最優(yōu)處方的驗證 為進一步驗證所建立模型與實際實驗結(jié)果是否相符，以軟件所優(yōu)化后的處方工藝即稱取1.4 mmol DOPC、2.95 mmol DPPG、0.002 72 mmol TO、2.8 mmol CH溶于1 mL的氯仿中作為有機相，向其滴加等體積含25 mg BEV的內(nèi)水相，按“2.1”項下方法制備成初乳；向初乳中加入4 mL外水相（含4%葡萄糖和4 mmol/L的L-賴氨酸），制備成10 mL BEV-MVLs混懸液，平行制備3批，測得包封率為（80.65±4.42）%（n=3），與預測值的相對誤差為2.54%，證實了該模型的有效性，且包封率達到預期效果。

2.4 BEV-MVLs的表征

2.4.1 形態(tài) 于倒置顯微鏡下觀察BEV-MVLs形態(tài)，可見其外觀呈球形，圓整、大小較均勻，內(nèi)部由許多緊密排列的非同心囊泡構(gòu)成，類似泡沫狀[12]，顯微鏡圖見圖3。

將凍干后的BEV-MVLs固定于導電膠上，經(jīng)噴金處理，制成標本，進行掃描電鏡觀察，可見其形態(tài)較為圓整，呈現(xiàn)出典型的非同心囊泡結(jié)構(gòu)，掃描電鏡圖見圖4。

2.4.2 粒徑 采用激光粒度儀測定BEV-MVLs的粒徑，得到粒徑分布曲線。結(jié)果顯示，BEV-MVLs粒徑分布為11.13～24.96 μm，平均粒徑為16.80 μm，粒徑分布寬度適宜，對稱性良好，粒徑分布圖見圖5。

2.5 體外釋放特性

取BEV-MVLs 5 mL于10 mL EP管中，離心除去上清液，沉淀中加入2 mL釋放介質(zhì)（pH 7.4的PBS）并混勻，放入37 ℃水浴振蕩器（30 r/min）中進行釋放試驗。于0、0.5、1、3、5、7、10、14、17、21、25、30 d各時間點取樣，將釋放液600×g離心8 min，取上清液0.2 mL，同時補加等溫等體積釋放介質(zhì)，測定釋放樣品中BEV含量，計算累積釋放度，繪制釋放曲線，體外累積釋放曲線見圖6。

由圖6可知，采用pH 7.4 PBS作為釋放介質(zhì)模擬眼部玻璃體環(huán)境，所得數(shù)據(jù)能較好地反映制劑在體外的緩釋效果，30 d時的累積釋放度達92%。將釋放數(shù)據(jù)用不同的釋放模型擬合，最終確定其最佳擬合模型為一級釋放模型，其方程為y=295.876（1-e0.013x）（R2=0.987），即BEV-MVLs的釋放機制近似于單個囊泡破裂而導致的骨架溶蝕型釋放，而不是簡單的藥物擴散；隨著外部單個囊泡的擴散和表面溶蝕，包封的藥物釋放出來，但內(nèi)部未發(fā)生破裂的囊泡仍可保持非同心圓結(jié)構(gòu)，依然維持緩釋作用效果，因而藥物釋放時間得到延長。

3 討論

單抗藥物含量分析常用二喹啉甲酸（BCA）法和酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法，前者是測定樣品中蛋白總濃度，后者檢測蛋白濃度通常為pg級，樣品需稀釋很高倍數(shù)才能分析，兩種方法準確度均不高。本研究采用Protein A色譜柱分析BEV含量，Protein A是金黃色葡萄球菌A蛋白，能與抗體片段Fc區(qū)域（主要是免疫球蛋白G）特異性結(jié)合，其他組分不被結(jié)合而流出，改變流動相pH值可使抗體與Protein A分開而被洗脫下來，從而準確定量抗體濃度，與ELISA法檢測相比，操作簡單、高速快捷[13]。

在W/O/W法制備BEV-MVLs過程中，有兩個因素影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性：一是油水界面吸附作用；二是均質(zhì)乳化產(chǎn)生的壓力。本研究在內(nèi)水相中添加蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑蔗糖，以減少蛋白質(zhì)動力學作用，阻斷蛋白質(zhì)在油水界面的聚集和變性，加強蛋白質(zhì)疏水性氨基酸之間的相互作用，提高蛋白質(zhì)耐熱性和穩(wěn)定性。在處方中加入白蛋白能夠有效保護抗體對抗均質(zhì)乳化過程中的壓力，降低界面吸附作用，保護抗體活性。

綜上所述，本研究成功制得具有緩釋作用的BEV- MVLs，其包封率達到預期效果。

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（收稿日期：2017-09-21 修回日期：2017-12-06）

（編輯：鄒麗娟）