第26屆國(guó)際生物學(xué)奧林匹克競(jìng)賽試題實(shí)驗(yàn)4·生物化學(xué)

佟向軍 范六民 劉寶玉 王戎疆 張 立

（1 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100871 2 天津市第一中學(xué) 天津 300051 3 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100875）

總分：100 分

考試時(shí)間：90 min

共20 題

考試目的:在本次考試中，將分析酶的動(dòng)力學(xué)和酶的抑制劑。

考試包括2 個(gè)主要部分，每個(gè)部分包含3 個(gè)子部分。

第1 部分（57.5 分）

1.1 酶動(dòng)力學(xué)介紹（理論）（0 分）

1.2 使用合成底物類似物pNP-Gal 的工業(yè)α-半乳糖苷酶的酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)操作）（問(wèn)題1～2：40 分）

1.3 α-半乳糖苷酶的酶動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析（問(wèn)題4～11：17.5 分）

第2 部分（42.5 分）

2.1 酶抑制劑介紹（理論）（問(wèn)題11～13：2 分）

2.2 α-半乳糖苷酶的抑制實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)操作）（問(wèn)題14：27 分）

2.3 α-半乳糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析（問(wèn)題15～20：13.5 分）

在考試開始之前，建議首先瀏覽整個(gè)試卷以了解大致內(nèi)容。由于大多數(shù)分?jǐn)?shù)設(shè)置在實(shí)驗(yàn)部分，所以建議在開始計(jì)算和回答理論問(wèn)題之前（第1.3、2.1 和2.3 部分）首先完成1.2 和2.2 部分。

材料與設(shè)備

為了完成實(shí)驗(yàn)工作，需要下面列出的材料。請(qǐng)確?？梢垣@取這些材料。如果發(fā)現(xiàn)材料缺失，請(qǐng)?jiān)诳荚囬_始15 min 之內(nèi)舉手示意考務(wù)人員。

A.1 個(gè)p200 移液器。使用移液器p200 轉(zhuǎn)移體積為20～200 μL 的液體，除非另有說(shuō)明。

B.1 個(gè)p1000 移液器。使用移液器p1000 轉(zhuǎn)移體積為200～1 000 μL，除非另有說(shuō)明。

C.p200 移液器的96 孔吸頭盒。 除非另有說(shuō)明，否則每次移液后應(yīng)丟棄移液器吸頭。

D.p1000 移液器的96 孔吸頭盒。 除非另有說(shuō)明，否則每次吸液后應(yīng)丟棄移液管吸頭。

E.＞30 個(gè)微量離心管（1.5 mL）

F.1 個(gè)微量離心管支架

G.2 個(gè)標(biāo)有國(guó)家代碼+A 或B 的微量滴定盤

H.1 個(gè)微量滴定板模板

I.1 只秒表

J.1 支鉛筆

K.1 支記號(hào)筆

L.1 個(gè)計(jì)算器

M.1 把直尺

N.1 張用于示意考務(wù)人員的粉紅卡片

O.9 mL 2 mol/L Na2CO3（終止液）

P.6.5 mL 15 mmol/L pNP-Gal（底物）

Q.15 mL 超純水

R.5 mL 1 mmol/L pNP（標(biāo)準(zhǔn)溶液）

S.2 mL 0.024 mg/mL（酶）

T.5 mL 0.5 mol/L（抑制劑）

U.平板電腦觸控筆

第1 部分

1.1 酶動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)介

α-半乳糖苷酶可以催化α-半乳糖苷中末端半乳糖殘基的水解。通常，使用合成底物類似物對(duì)硝基苯基-α-半乳糖苷（pNP-Gal）測(cè)定α-半乳糖苷酶的活性，α-半乳糖苷被水解成半乳糖（Gal）和對(duì)硝基苯基（pNP）（圖1）。

pNP-Gal 是無(wú)色的，而pNP 產(chǎn)物為黃色并且其濃度可以通過(guò)微量滴定板讀數(shù)器確定405 nm處的吸光度。

圖1 半乳糖苷酶活性測(cè)定示意圖

在第1 部分中，將對(duì)水解速率對(duì)底物濃度的依賴性進(jìn)行研究。為了達(dá)到這一目的，描述這種關(guān)系的Michaelis-Menten 圖（圖2）可用于估計(jì)2 個(gè)重要參數(shù)Vmax和Km（參見(jiàn)圖2 的圖例）。 初始反應(yīng)速率Vo 可以由Δ［P］／Δt 確定，該值是單位時(shí)間內(nèi)（Δt）的產(chǎn)物濃度（［P］）的變化。

圖2 Michaelis-Menten 圖

Lineweaver-Burk 圖中的參數(shù)Vmax 和Km 可以分別從Y 軸和X 軸截距確定（圖3）。 通過(guò)繪制初始反應(yīng)速率（1／Vo）與底物濃度（1／［S］）的倒數(shù)的方法可以產(chǎn)生Lineweaver-Burk 圖。

圖3 Lineweaver-Burk 圖

1.2 工業(yè)α-半乳糖苷酶的酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 首先產(chǎn)生用于測(cè)量酶反應(yīng)產(chǎn)物濃度（pNP）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 要產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，你需要用終止液（Stop）稀釋1 mmol/L pNP 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（Standard）。

問(wèn)題1.標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋方案。

當(dāng)需要使用時(shí)，要用終止液(Stop)稀釋1 mmol/L pNP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（Standard）。 計(jì)算在500 μL 總體積中制備最終標(biāo)準(zhǔn)濃度所需的pNP 和終止液的體積。 在表1 中填入你的計(jì)算值。

表1 稀釋方案制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟：

A.用記號(hào)筆標(biāo)記上表第1 行中5 個(gè)1.5 mL 微量離心管（St1～St5）。

B. 將不同體積的1 mmol/L pNP 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（Standard）轉(zhuǎn)移到標(biāo)記的1.5 mL 管中（使用相同的吸頭）。

C.根據(jù)上表中的計(jì)算，將不同體積的終止液（Stop） 轉(zhuǎn)移到標(biāo)記的管中。 將微量離心管倒置5次，使其與標(biāo)準(zhǔn)溶液徹底混合。

D.將100 μL 超純水（Water）轉(zhuǎn)移到微量滴定板A 的A1～A5 和B1～B5 孔中（使用相同的吸頭，參見(jiàn)圖4 和/或使用微量滴定板模板幫助你移液到正確的孔中） 。

E.轉(zhuǎn)移50 μL 上述最終溶液到相同的微量滴定板孔中。 每種溶液被分別轉(zhuǎn)移到2 個(gè)不同的孔中（下標(biāo)I 和II，圖4）。

F.使用p1000 移液器向每個(gè)pNP 標(biāo)準(zhǔn)A1～A5和B1～B5 孔中添加100 μL 終止液（Stop）。通過(guò)將混合物上下顛倒2 次徹底混合。

圖4 微量滴定板A

現(xiàn)在繼續(xù)進(jìn)行第1.2.2 部分，將酶反應(yīng)混合物置于你的微量滴定板上。

重要提示：考務(wù)人員在考試的最后10 min 內(nèi)將不再接收任何微量滴定板。 如果你感覺(jué)無(wú)法及時(shí)完成1.2.2 的部分，請(qǐng)通過(guò)舉起粉紅卡片告知考務(wù)人員。 你的操作結(jié)果將顯示在問(wèn)題2 中。

1.2.2 酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

步驟：

準(zhǔn)備pNP-Gal 底物稀釋溶液進(jìn)行動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。

A.標(biāo)記5 個(gè)1.5 mL 管，標(biāo)記為S1 至S5（表2）。B.將15 mmol/L pNP-Gal 底物儲(chǔ)備溶液（Substrate）用標(biāo)準(zhǔn)1.5 mL 管中的超純水（Water）進(jìn)行稀釋（表2）。 稀釋溶液應(yīng)通過(guò)將管顛倒倒置5 次徹底混合。

表2 酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定的底物稀釋方案

C.將50 μL 每種稀釋的底物溶液（表2）和50 μL 超純水（Water）轉(zhuǎn)移到微量滴定板A G1～G5 和H1～H5。（參見(jiàn)圖4 和/或微量滴定板模板）。

D.將定時(shí)器設(shè)置為5 min，并在將酶溶液移至第1 孔后立即開始計(jì)時(shí)，以開始第1 次酶促反應(yīng)（SI1），如下所述。

E.移取50 μL 0.024 mg/mLα-半乳糖苷酶（Enzyme），從SI1 和SII1 開始加入G1～G5 和H1～H5 孔，并繼續(xù)以相同的順序和間隔持續(xù)到SII5 以開始每個(gè)孔中的酶反應(yīng)（以下稱為“酶反應(yīng)混合物”）。為確保良好的混合，快速但輕柔地將50 μL 的混合物在每個(gè)孔中進(jìn)行上、下2 次移液。

F.孵育5 min 后，使用p1000 移液管加入100 μL 2 mol/L Na2CO3溶液 （Stop），以與你開始的步驟相同的順序和速度終止孔G1～G5 和H1～H5 中的每個(gè)酶反應(yīng)。通過(guò)將混合物上、下移動(dòng)2 次混勻。

問(wèn)題2.酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。

舉起粉紅色卡片上交你的的微量滴定板。 測(cè)量后，所得值將自動(dòng)顯示在表3 中。

注意：在考試的最后10 min 內(nèi)不會(huì)接受微量滴定板。

表3

1.3 酶動(dòng)力學(xué)的數(shù)據(jù)分析

現(xiàn)在，你的任務(wù)是通過(guò)α-半乳糖苷酶測(cè)定底物水解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

首先，使用表4 中的數(shù)據(jù)確定產(chǎn)物（pNP）的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性函數(shù)。 使用標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算反應(yīng)混合物中的產(chǎn)物濃度，進(jìn)一步可以通過(guò)確定初始反應(yīng)速率（V0）計(jì)算每個(gè)底物濃度。

表4 用于模擬微量滴定板A 的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)，這樣可以避免1.2 部分的錯(cuò)誤。 在實(shí)際情況下，使用你自己的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。

表4 用于計(jì)算的吸光度數(shù)據(jù)（微量滴定板的第1～5 列）

問(wèn)題3.標(biāo)準(zhǔn)平均吸光度。

計(jì)算表5 中給出的標(biāo)準(zhǔn)曲線的每個(gè)重復(fù)測(cè)量的平均吸光度。 輸入小數(shù)點(diǎn)后3 位數(shù)。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的平均吸光度

問(wèn)題4.標(biāo)準(zhǔn)曲線線性函數(shù)。

在圖5 中，將pNP 的濃度（mmol/L）對(duì)應(yīng)于吸光度（問(wèn)題3 中計(jì)算出的平均A405nm）作圖。

圖5 估測(cè)pNP 產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線

在數(shù)學(xué)上僅使用2 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)St1 和St5 的平均吸光度確定標(biāo)準(zhǔn)曲線線性函數(shù)（見(jiàn)下文）的a 和b。 為a 和b 給出小數(shù)點(diǎn)的后3 位。

A405（405 nm 處的吸光度單位）=a·［pNP］（mmol/L）+b，其中a 是斜率，b 是Y 軸截距。

來(lái)自實(shí)驗(yàn)部分1.2.2 的酶反應(yīng)混合物的體積為150 μL。

問(wèn)題5.反應(yīng)時(shí)間。

將步驟中給出的反應(yīng)時(shí)間單位設(shè)置為s。

問(wèn)題6.動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析（無(wú)抑制劑）。

使用以下標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算每種反應(yīng)混合物的產(chǎn)物濃度：

A405吸光度=2.29×［pNP］（mmol/L）+0.058。

初始反應(yīng)速率V0可以從Δ［Product］／Δ 時(shí)間確定，即單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)品濃度的變化。所有數(shù)字保留到小數(shù)點(diǎn)后3 位。

表6 分析數(shù)據(jù)

問(wèn)題7.Michaelis-Menten 參數(shù)（圖形估計(jì)）。

圖6 Michaelis-Menten 圖

從Michaelis-Menten 圖以圖形方式估算Vmax和Km(圖6)。在小數(shù)點(diǎn)后給出1 位有效數(shù)字的答案。

問(wèn)題8.Lineweaver-Burk 線性函數(shù)。

圖7 是表3 中S1～S5 數(shù)據(jù)點(diǎn)的Lineweaver-Burk 圖（1／V0對(duì)1／［S］）。

圖7 Lineweaver-Burk 圖

確定Lineweaver-Burk 圖中線性函數(shù)（圖7），給出S1 和S5 2 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)小數(shù)點(diǎn)后的3 位有效數(shù)字，即a 和b。

1／［Vo］＝a×1／［S］+b

問(wèn)題9.測(cè)定Vmax 和Km。

使用上面計(jì)算的線性函數(shù)（問(wèn)題8）確定Vmax和Km。給出小數(shù)點(diǎn)后3 位數(shù)（不應(yīng)進(jìn)行單位轉(zhuǎn)換）。

問(wèn)題10.反應(yīng)混合物中的酶濃度。

用酶儲(chǔ)液濃度0.024 mg/mL 和酶的摩爾質(zhì)量（75000 g/mol）計(jì)算反應(yīng)混合物中的酶濃度(μmol/L)。給出小數(shù)點(diǎn)后3 位數(shù)。

問(wèn)題11.轉(zhuǎn)化率常數(shù)。

催化速度常數(shù)kcat（1 個(gè)酶分子的反應(yīng)速率）單位為1/s，計(jì)算公式如下：

計(jì)算出催化速度常數(shù)kcat，保留小數(shù)點(diǎn)后3 位。

2.1 抑制劑簡(jiǎn)介

抑制劑是可以特異性結(jié)合酶的化合物，從而降低其活性并導(dǎo)致Km、Vmax 或兩者的明顯變化。 表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化可以從在抑制劑存在下進(jìn)行的酶反應(yīng)的Lineweaver-Burk 圖確定。 取決于與酶結(jié)合的方式，可逆抑制劑可以是競(jìng)爭(zhēng)性的，非競(jìng)爭(zhēng)性的或無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性的。

酶活性的抑制和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的明顯變化也可以在Michaelis-Menten 和Lineweaver-Burk 圖中顯現(xiàn)（圖8）。

圖8 在Michaelis-Menten 和Lineweaver-Burk 圖中的抑制酶活性

抑制劑的特征在于其抑制平衡常數(shù)Ki，其定義為

其中［I］、［E］和［EI］分別是游離抑制性劑，游離酶和酶抑制劑復(fù)合物的濃度。對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)性抑制，在抑制劑存在下的表觀Km 被指定為Ki。 底物

圖9

問(wèn)題12.影響抑制劑的因素。

對(duì)于所有抑制類型，其抑制程度（即酶反應(yīng)速率的降低）取決于（選擇下面最好的答案）：

1）抑制濃度［I］2）底物濃度［S］

3）抑制劑的Ki4）［ES］的濃度

5）1，2 和3 的狀態(tài)6）1 和3 狀態(tài)

問(wèn)題13.理解抑制劑的特性。

標(biāo)示出以下語(yǔ)句的正確或錯(cuò)誤：

在競(jìng)爭(zhēng)性抑制中，底物濃度［S］的增加會(huì)降低或克服抑制效果。

2.2 對(duì)α-半乳糖苷酶的抑制作用（27 分）

這部分實(shí)驗(yàn)類似于第1 b 部分。 α-半乳糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)將在50 μL 抑制劑的存在下進(jìn)行，其濃度為0.5 mol/L。

步驟：抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)底物制備。

A.根據(jù)表7 準(zhǔn)備底物，這與你在第1.2.2 部分中所做的相似。注意應(yīng)通過(guò)將試管倒置5 次混合溶液。

表7 用于動(dòng)力學(xué)測(cè)定的底物稀釋方案

B.使用相同的移液管吸頭將50 μL 抑制劑（I抑制劑）轉(zhuǎn)移到微量滴定板B 孔A1～A5 和B1～B5中（見(jiàn)圖10 和/或微量滴定板模板）。

C.將50 μL 每種最終底物溶液（表7）轉(zhuǎn)移到相同的孔位置（A1～A5 和B1～B5）。

圖10 微量滴定板B

D.將定時(shí)器設(shè)置為5 min，并在開始第1 次酶反應(yīng)后立即通過(guò)將酶溶液加入到第1 孔（ISI1）中開始，如下所述。

E.從ISI1 和ISII1 開始，將50 μL 的α-半乳糖苷酶（EEnzyme）加入孔A1～A5 和B1～B5，并繼續(xù)以與ISII5 相同的順序和速度開始酶反應(yīng)。

F. 孵育5 min 后，使用p200 移液器加入100 μL 終止液（Stop），按照你開始加入時(shí)的相同順序和速度終止孔A1～A5 和B1～B5 中的每個(gè)酶反應(yīng)。 在加入終止液后，立即將混合物上下移動(dòng)2次，徹底混勻。

問(wèn)題14.酶抑制劑動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。

舉起粉紅色卡片上交你的的微量滴定板。 測(cè)量后，所得值將自動(dòng)顯示在表格（同表3）中。

注意：在考試的最后10 min 內(nèi)不會(huì)接受微量滴定板。

2.3 α-半乳糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)的數(shù)據(jù)分析

在本節(jié)中，你將利用第2.1 部分的理論和第2.2 部分提供的抑制數(shù)據(jù)（表8）計(jì)算抑制劑存在下的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 用于抑制數(shù)據(jù)的Lineweaver-Burk 方程將與提供的假設(shè)的Lineweaver-Burk 方程進(jìn)行比較，用于推導(dǎo)各種抑制類型和不受抑制的反應(yīng)。當(dāng)你確定抑制類型時(shí)，請(qǐng)使用這2 個(gè)方程式來(lái)確定相關(guān)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化，并使用相關(guān)方程來(lái)確定抑制平衡常數(shù)（Ki）。

表8 抑制實(shí)驗(yàn)的吸光度數(shù)據(jù)

問(wèn)題15.抑制動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析。

計(jì)算并填寫表9。 為了以mmol/L 計(jì)算產(chǎn)物濃度，請(qǐng)使用問(wèn)題6 給出的標(biāo)準(zhǔn)方程式：

吸光度A405=2.29×[pNP]（mmol/L）+0.058。

表9

依據(jù)上表中抑制動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)IS1～I(xiàn)S5，產(chǎn)生Lineweaver-Burk 圖。

假設(shè)不受抑制的反應(yīng)的Lineweaver-Burk 方程為：1／［Vo］=0.363·1／［S］+0.9908，將該線繪制在圖11 中。 請(qǐng)用此方程用于下面的計(jì)算，而不是你在1.3 部分中確定的方程式（圖7）。

圖11 假設(shè)的非抑制性數(shù)據(jù)的Lineweaver-Burk 圖

問(wèn)題16.線性函數(shù)（抑制反應(yīng)）。

在存在抑制劑的情況下確定Lineweaver-Burk圖的線性函數(shù)（圖11），在數(shù)學(xué)上僅使用來(lái)自IS1和IS5 的數(shù)據(jù)。 a 和b 給出小數(shù)點(diǎn)后3 位。

1／［Vo］=a·1／［S］+b。

問(wèn)題17.表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)與抑制劑。

在抑制反應(yīng)的Lineweaver-Burk 圖中確定存在抑制劑的表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 給出小數(shù)點(diǎn)后3 位數(shù)（不需要進(jìn)行單位轉(zhuǎn)換）。

問(wèn)題18.確定抑制類型。

抑制劑對(duì)α-半乳糖苷酶有什么抑制作用？ 與抑制酶的假設(shè)數(shù)據(jù)相比，基于抑制劑存在的動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化的大小，選擇最可能的抑制類型：

1）競(jìng)爭(zhēng)性2）非競(jìng)爭(zhēng)性3）不確定

問(wèn)題19.底物濃度的影響。

根據(jù)你以上選擇的抑制類型，底物濃度的增加如何影響抑制？ 選擇出正確答案：

1）抑制減弱2）無(wú)變化3）抑制增強(qiáng)

問(wèn)題20.抑制常數(shù)。

如果添加到反應(yīng)混合物中的50 μL 抑制劑的濃度為0.5 mol/L，則確定抑制常數(shù)（Ki）。 在小數(shù)點(diǎn)保留3 位數(shù)字（在此計(jì)算中不進(jìn)行單位轉(zhuǎn)換）。

考試結(jié)束。

（第26 屆試題完）