響應(yīng)面法優(yōu)化順丁烯二酸-β-環(huán)糊精單乙酯的制備工藝

梁倩，李詠富，龍明秀，田竹希，何楊波，石彬

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所，貴州貴陽(yáng) 550006）

環(huán)糊精是一種具有疏水性內(nèi)腔的環(huán)狀低聚糖，它由多個(gè)α-D-吡喃葡萄糖通過(guò)α-1,4-糖苷鍵首尾相連而形成的化合物[1～3]，能選擇性地結(jié)合底物，可以通過(guò)超分子催化化學(xué)反應(yīng)[4]。其空腔結(jié)構(gòu)可提供理想的作用位點(diǎn)，能與一定大小和形狀的疏水性客體、親脂性物 質(zhì)通過(guò)范德華力、氫鍵等非共價(jià)鍵作用力形成包合物，不同強(qiáng)度的范德華力形成的包合物具有多種獨(dú)特的物理、化學(xué)性質(zhì)?？梢赃\(yùn)用于疏水性藥物、天然色素、精油等食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。天然的β-環(huán)糊精（β-CD）是由7個(gè)α-D-吡喃葡萄糖結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的，而其水溶性有限，它們與某些疏水性客體形成的包合物的水溶性得不到改善，更容易從水溶液中析出。因此，制備親水性β-CD衍生物可以增加β-CD在水中的溶解性、穩(wěn)定性并且拓展β-CD的應(yīng)用范圍，例如穩(wěn)定的親水性β-CD衍生物可作為一種理想藥物載體，能夠?qū)κ杷运幬镉性鋈茏饔肹4～6]，對(duì)天然藥物具有保護(hù)和緩釋作用等[7,8]。

本文以含乙烯基的β-CD為單體，通過(guò)與親水性單體發(fā)生自由基共聚反應(yīng)制備水溶性β-CD高分子聚合物，以期增大β-CD在水中的溶解性和穩(wěn)定性。衍生物中含乙烯基的報(bào)道較少，現(xiàn)有方法在制備乙烯基β-環(huán)糊精衍生物時(shí)采用有毒化學(xué)試劑，對(duì)環(huán)境造成污染的同時(shí)也限制了乙烯基β-環(huán)糊精衍生物的應(yīng)用范圍[9]。

本文采用安全的低毒的方法，通過(guò)磷酸鹽的催化含有乙烯基的順丁烯二酸與β-CD進(jìn)行酯化反應(yīng)，制備β-CD高分子聚合物，并采用響應(yīng)面BBD設(shè)計(jì)優(yōu)化酯化反應(yīng)的參數(shù)條件，得到最佳條件下的酯化產(chǎn)物，以期增大β-CD在水中的溶解性，增加對(duì)疏水性藥物的水溶性，為其進(jìn)一步在藥物載體方面和生物活性等方面的研究奠定基礎(chǔ)，拓展其在食品和藥品行業(yè)的應(yīng)用[10]。

1 材料與方法

1.1 材料

β-環(huán)糊精（分析純）、順丁烯二酸（分析純）購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司；次亞磷酸鈉（SPD）購(gòu)于Sigma-Aldrich（USA）；甲基氫醌購(gòu)于中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)公司；其余試劑均為分析純；Aglient 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；傅里葉紅外光譜儀（Tensor 37, BRUKER OPTICS, Germany）；MALDI-TOF 質(zhì)譜儀（BIFLEX III, Bruker Daltonics Inc., USA）。

1.2 順丁烯二酸-β-環(huán)糊精單乙酯（CDM）的制備

順丁烯二酸-β-環(huán)糊精單乙酯（CDM）的合成反應(yīng)如下所示：

CDM的制備采用半干法，將3.405 g的β-CD與順丁烯二酸（3～7 mmol）、次亞磷酸鈉（0.2～0.7 mol）、甲基氫醌0.0186 g加入耐壓品中，按固液比（0.3～0.6）加入乙醇水（30%～70%）溶液，混合均勻后于恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)（100 ℃～120 ℃）高溫下反應(yīng)3.5 h時(shí)。反應(yīng)完全后冷卻至室溫，向耐壓品中加入30 mL無(wú)水乙醇，靜置24 h，過(guò)濾，用無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌濾餅至到將水分洗凈，于60 ℃烘箱干燥，產(chǎn)物即為順丁烯二酸-β-環(huán)糊精單乙酯（CDM）。

1.3 HPLC法測(cè)定CDM酯化率

1.3.1 HPLC測(cè)定條件

CDM酯化率的測(cè)定采用YMC-AQ-C18（250×4.6 mm）色譜柱，流動(dòng)相A為0.01 mol/L乙酸水溶液，B為無(wú)水乙醇，等度洗脫，流速1.2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫 35 ℃；進(jìn)樣量 10 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定CDM酯化率，以順丁烯二酸單乙酯為標(biāo)準(zhǔn)品，分別配置濃度為0.05，0.1，0.5，1，2，3.5 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與其峰面積進(jìn)行回歸處理，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為y=2475.1x+9.3256，γ=0.9998，線性關(guān)系良好。

1.3.3 樣品制備

準(zhǔn)確稱取CDM樣品0.25 g，用蒸餾水定容至25 mL，配置成濃度為100 mg/mL的樣品溶液，經(jīng)過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定其色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酯化率（%）。

1.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)

基于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)工作[11]，考察了CDM制備的主要因素有順丁烯二酸用量（X1，mmol）、固液比（X2）、反應(yīng)溫度（X3，℃），乙醇濃度（X4，%）4個(gè)因素范圍；結(jié)合中心組合 BBD法，設(shè)計(jì)上述四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以確定CDM的最佳制備條件。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 BBD中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中的因素水平表Table 1 The coded values and corresponding actual values of the optimization parameters

1.5 CDM的結(jié)構(gòu)表征

1.5.1 紅外光譜

順丁烯二酸單乙酯、β-CD和CDM紅外光譜圖采用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)定。取少量樣品與質(zhì)量為300 mg的KBr混勻，于研缽內(nèi)研磨成粉末后壓片，在4000～400波數(shù)（cm-1）內(nèi)掃描。

1.5.2 質(zhì)譜信息

β-CD和CDM質(zhì)譜信息采用MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定，以2,5-二羥基苯甲酸作為基質(zhì)。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)使用Design-Expert 8.0.5b對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析；使用t檢驗(yàn)對(duì)回歸系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，F(xiàn)檢驗(yàn)對(duì)二次多項(xiàng)線性回歸方程的顯著性進(jìn)行評(píng)價(jià)，回歸系數(shù)R2評(píng)價(jià)模型的回歸系數(shù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 CDM樣品的高效液相色譜圖

順丁烯二酸單乙酯、CDM 的高效液相色譜圖如圖1所示。順丁烯二酸單乙酯、CDM出峰時(shí)間都在4 min左右，且不重合，說(shuō)明順丁烯二酸單乙酯可以作為內(nèi)標(biāo)物[12～14]。

圖1 順丁烯二酸單乙酯、順丁烯二酸-β-環(huán)糊精單乙酯的高效液相色譜圖Fig.1 The HPLC chromatograms of monoethyl maleinate and CDM

2.2 順丁烯二酸-β-環(huán)糊精單乙酯制備參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 模型的適應(yīng)性分析

通過(guò)響應(yīng)面 BBD中心組合實(shí)驗(yàn)得到實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值如表2所示，順丁烯二酸-β-環(huán)糊精單乙酯的酯化率分布在0.062%～36.75%范圍內(nèi)，運(yùn)用Design-Expert 8.0.5b統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，確定其回歸方程式，CDM 酯化率用二次多項(xiàng)式回歸方程表示：

回歸方程通過(guò)T檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)，如表3所示，該模型p＜0.0001，失逆項(xiàng)F值為1.55，p=0.3568，說(shuō)明該模型有意義，模型擬合程度好；其決定系數(shù)R2值為0.8848，接近于1，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值很接近；其校正系數(shù)R2Adj值為0.7681，說(shuō)明酯化率響應(yīng)值的76.81%可以被該模型預(yù)測(cè)，表明該模型的擬合度比較高[15,16]。 計(jì)自主生成結(jié)果。

表2 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及CDM酯化率的響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken central composite experimental design setting in coded form of the independent variables (X1, X2, X3,X4) and predicted and experimental values

p值對(duì)系數(shù)交互影響進(jìn)行評(píng)價(jià)，p值越小，系數(shù)之間相互影響就越有意義[15,17]，從表3可以看出，該二次多項(xiàng)回歸方程的一次項(xiàng)系數(shù)X1、X2、二次項(xiàng)系數(shù)X12、X22、X32具有顯著性差異（p＜0.05）。

表3 響應(yīng)面二次回歸模型及其回歸系數(shù)方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for the effects amounts of maleic acid (X1), solid-to-liquid ratio (X2), reaction temperature (X3) and ethanol concentsolid-to-liquid ration (X4) on synthesis of CDM using predicted polynomial models

2.2.2 響應(yīng)面分析

本試驗(yàn)的順丁烯二酸用量（X1，mmol）、固液比（X2）、反應(yīng)溫度（X3，℃），乙醇濃度（X4，%）四個(gè)因素對(duì)CDM酯化率的交互影響如圖2A～F所示。

如圖2A 3D響應(yīng)面所示，當(dāng)反應(yīng)溫度（110 ℃）、乙醇濃度（45%）一定時(shí)，CDM酯化率隨著順丁烯二酸用量（1～5 mmol）增加而升高，隨著固液比（0.3～0.45）增加而緩慢升高，隨著固液比（0.45～0.6）的增加趨于平穩(wěn)，當(dāng)順丁烯二酸用量與固液比分別為3和0.45時(shí)，CDM酯化率達(dá)到最佳。

如圖2B 3D響應(yīng)面所示，當(dāng)固液比（0.45）與乙醇濃度（45%）一定時(shí)，CDM酯化率隨順丁烯二酸用量（1～5 mmol）升高而升高，隨著反應(yīng)溫度（100～120 ℃）升高而緩慢升高。

如圖2C 3D響應(yīng)面所示，當(dāng)固液比（0.45）與反應(yīng)溫度（110 ℃）一定時(shí)，CDM 酯化率隨乙醇濃度（30%～45%）的升高趨于平穩(wěn)，隨順丁烯二酸用量（1～5 mmol）升高而升高，當(dāng)乙醇濃度為45%，順丁烯二酸用量為3 mmol時(shí)，CDM酯化率達(dá)到最佳。

如圖2D 3D響應(yīng)面所示，當(dāng)順丁烯二酸用量（3 mmol）與乙醇濃度（45%）一定時(shí)，CDM 酯化率隨反應(yīng)溫度（100～110 ℃）的升高而緩慢升高，隨固液比（0.3～0.45）升高而緩慢升高，當(dāng)反應(yīng)溫度和固液比分別為110 ℃和0.45時(shí)，CDM酯化率達(dá)到最大。

如圖2E 3D響應(yīng)面所示，當(dāng)順丁烯二酸用量（3 mmol）與反應(yīng)溫度（110 ℃）一定時(shí)，CDM 酯化率隨固液比（0.3～0.45）和乙醇濃度（30%～45%）的升高而緩慢升高，當(dāng)固液比和乙醇濃度分別為 0.45和45%時(shí)，CDM酯化率達(dá)到最大。

如圖2F 3D響應(yīng)面所示，當(dāng)順丁烯二酸用量（3 mmol）與固液比（0.45）一定時(shí)，CDM 酯化率隨乙醇濃度（30%～45%）和反應(yīng)溫度（100～110 ℃）的升高而緩慢升高，當(dāng)乙醇濃度和固液比分別為 45%和110 ℃時(shí)，CDM酯化率達(dá)到最大。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

圖2 3D響應(yīng)面及等值圖Fig.2 Response surface (3D) and Contour plots showing the effect of amounts of maleic acid (X1), solid-to-liquid ratio (X2),reaction temperature (X3) and ethanol concen-tsolid-to-liquid ration (X4) on synthesis of CDM.

為了驗(yàn)證模型方程的可靠性，根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化的條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：順丁烯二酸用量 4.3273 mmol，固液比 0.4085，反應(yīng)溫度 109.462 ℃，乙醇濃度48.213%，為了實(shí)驗(yàn)的可操作性，將其進(jìn)行修正。驗(yàn)證試驗(yàn)（n=3）結(jié)果如表4所示，實(shí)際測(cè)得CDM酯化率為40.977±2.032%，這與理論預(yù)測(cè)值40.71%接近（相對(duì)誤差0.656%）。因此，采用BBD中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的工藝參數(shù)，準(zhǔn)確可靠，具有意義。

表4 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Comparison between the predicted value and observed value for the response variables

2.3 CDM的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 紅外光譜分析

圖3 順丁烯二酸單乙酯、β-環(huán)糊精及順丁烯二酸-β-環(huán)糊精單乙酯（CDM）紅外光譜圖Fig.3 The FT-IR sepctra of monoethyl maleinate, β-cyclodextrin and CDM

順丁烯二酸單乙酯、β-CD以及CDM的紅外光譜[18,19]比較圖如圖3所示β-CD吸收峰：在950 cm-1處是環(huán)糊精糖苷鍵骨架振動(dòng)吸收峰，1044 cm-1是C-O/C-C拉伸震動(dòng)吸收峰，1205 cm-1處吸收峰屬于O-H平面彎曲振動(dòng)，1160 cm-1C-O-C拉伸/O-H彎曲振動(dòng)吸收峰，1250～1370附近吸收峰屬于C-H的彎曲振動(dòng)，1465 cm-1處CH2彎曲振動(dòng)吸收峰；順丁烯二酸單乙酯中不飽和酯鍵吸收峰有：1722 cm-1處C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，1708 cm-1處羧酸C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，CDM保留了β-環(huán)糊精的固有吸收峰，在1722 cm-1和1708 cm-1處不飽和酯鍵吸收峰與順丁烯二酸一致，在1637 cm-1處是C=C雙鍵伸縮振動(dòng)吸收峰。由此說(shuō)明了順丁烯二酸-β-環(huán)糊精單乙酯（CDM）的合成[20]。

2.3.2 質(zhì)譜分析

對(duì)β-CD及CDM進(jìn)行了質(zhì)譜分析[21,22]，質(zhì)譜信息如圖 4所示，[CDM+Na]+質(zhì)荷比(m/z)為 1255.6，[β-CD+Na]+質(zhì)荷比(m/z)為1157.6，順丁烯二酸的相對(duì)分子質(zhì)量為116.07，也就是說(shuō)CDM失去一個(gè)水分子（相對(duì)分子質(zhì)量18）與順丁烯二酸中的一個(gè)羧基發(fā)生酯化反應(yīng)，形成CDM，CDM結(jié)構(gòu)如圖5所示。

圖4 CDM的質(zhì)譜圖Fig.4 The mass spectra of CDM

圖5 CDM結(jié)構(gòu)圖Fig.5 The molecular structure of CDM

3 結(jié)論

本文采用Design-Expert 8.0.5b軟件，以BBD中心設(shè)計(jì)法優(yōu)化順丁烯二酸-β-環(huán)糊精單乙酯（CDM）合成條件，優(yōu)化得到的工藝參數(shù)為順丁烯二酸用量4.327 mmol，固液比0.408，反應(yīng)溫度109.462 ℃，乙醇濃度48.213%，CDM酯化率預(yù)測(cè)值為40.71%，在最佳工藝參數(shù)下，CDM實(shí)際酯化率達(dá)到40.977±2.032%，與預(yù)測(cè)值接近（相對(duì)誤差 0.656%）說(shuō)明采用響應(yīng)面BBD中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到CDM合成參數(shù)準(zhǔn)確可靠；通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行紅外光譜和質(zhì)譜表征，佐證了順丁烯二酸-β-環(huán)糊精單乙酯的合成。

順丁烯二酸-β-環(huán)糊精單乙酯（CDM）制備工藝的優(yōu)化，為進(jìn)一步研究CDM單體的活性以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)，為其在藥物和食品方面的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了參考。