卡琪花蒂瑪中黃酮類物質(zhì)的組成及抗氧化活性

席紅如，吳暉，賴富饒，馬娟娟，劉袆帆，陳文博

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

卡琪花蒂瑪（Kacip Fatimah）是一種生長(zhǎng)在東南亞熱帶雨林中的常見紅色草藥，它的植物學(xué)名為L(zhǎng)abisia pumila，是紫金?？乒嗄緺畲厣参铩＜冋目ㄧ骰ǖ佻攦H生長(zhǎng)于馬來(lái)西亞海拔350 m高的無(wú)污染熱帶雨林中[1]。

馬來(lái)西亞歷代的女人們都用它的葉子煮水喝，青年少女用它來(lái)調(diào)節(jié)月經(jīng)不規(guī)律，月經(jīng)疼痛；孕婦用它來(lái)促進(jìn)生產(chǎn)；產(chǎn)婦用它來(lái)縮宮，恢復(fù)產(chǎn)后體力，治療產(chǎn)后骨質(zhì)疏松；更年期婦女用它來(lái)緩解雌激素缺乏帶來(lái)的相關(guān)疾?。ㄐ难芗膊?，骨質(zhì)疏松癥等）；還可用它來(lái)進(jìn)行美容養(yǎng)顏、提升性欲等等[2]。

目前，卡琪花蒂瑪中已經(jīng)報(bào)道的活性成分包括黃酮類、多酚類、皂苷類和有機(jī)酸類等[3]。黃酮類化合物是卡琪花蒂瑪中一種重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物。黃酮類物質(zhì)具有較強(qiáng)的清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射以及保護(hù)心血管系統(tǒng)等生物活性功能[4]。因此研究卡琪花蒂瑪中黃酮類化合物，對(duì)卡琪花蒂瑪中的黃酮的有效開發(fā)利用具有重要的意義。

周潔等[5]人的研究結(jié)果表明兒茶素通過抗氧化抑制相關(guān)酶活性及抑制信號(hào)傳導(dǎo)等來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞入侵、細(xì)胞增殖、細(xì)胞血管再生及轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。曾亮[6]等人的研究結(jié)果表明兒茶素會(huì)抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，增加細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，造成細(xì)菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)的滲漏，使細(xì)菌代謝發(fā)生紊亂，進(jìn)而達(dá)到抑菌效果。甘寧[7]等人通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明楊梅素通過降低ROS水平恢復(fù)內(nèi)源性 BMMSCs的成骨能力，減少卵巢大鼠骨量丟失。卞杰[8]等人的研究表明楊梅素通過激活Caspase家族蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用。

本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了卡琪花蒂瑪莖和葉中黃酮的含量及各種黃酮類化合物的組成成分，并對(duì)卡琪花蒂瑪莖和葉中的黃酮的自由基清除能力做了對(duì)比分析。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與試劑

卡琪花蒂瑪?shù)那o和葉片，產(chǎn)自馬來(lái)西亞，洗凈，晾干，粉碎，過40目篩，置于陰涼干燥處待用。

1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，阿拉丁公司；2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽（ABTS），申工公司；L-抗壞血酸（Vc），亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、過硫酸鉀（K2S2O8）、二水磷酸二氫鈉（NaH2PO42H2O）、十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）、鐵氰化鉀（K3[Fe(CN)6]）、三氯乙酸、三氯化鐵（FeCl3）等均為市售分析純。標(biāo)準(zhǔn)品：大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷、黃豆黃苷、葛根素、槲皮素、柚皮苷、楊梅素、兒茶素、蘆丁、芹菜素、山奈酚、白楊素、木犀草素、表兒茶素，阿拉丁公司。

1.2 儀器及設(shè)備

Spectrumlab 752S紫外可見分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；6CE-60F-717P型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HHS-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海橫平儀器儀表廠；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮系列化儀器廠；DLSB-5L/25型低溫冷卻液循環(huán)泵，鞏義市予華儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取20 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解完全后定容至100 mL容量瓶中，得到0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液；稱取5 g亞硝酸鈉于燒杯中，用蒸餾水溶解完全后定容到 100 mL容量瓶中得到 5%亞硝酸鈉溶液；稱取10 mg硝酸鋁于燒杯中，用蒸餾水溶解完全后定容到100 mL容量瓶中得到10%硝酸鋁溶液；稱取4 g氫氧化鈉于燒杯中，用蒸餾水溶解完全后定容到100 mL容量瓶中得到4%氫氧化鈉溶液。

用移液槍準(zhǔn)確移取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5 mL 0.1 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于15 mL具塞試管中，然后再分別加入5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1、0 mL蒸餾水，得到濃度分別為0、20、40、60、80、100、120、160、200 mg/mL的蘆丁溶液；再向每個(gè)具塞試管中分別加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻后反應(yīng)6 min；然后再加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻后反應(yīng)6 min；最后在加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，混勻，避光反應(yīng)15 min后在510 nm處測(cè)吸光值（每個(gè)梯度做3個(gè)平行）。

1.3.2 卡琪花蒂瑪中黃酮含量的測(cè)定

稱取一定量的已過 40目篩的卡琪花蒂瑪莖和葉片的粉末，在一定的溫度、乙醇濃度、料液比條件下提取一定時(shí)間，離心，過濾，定容[9]。移取一定量待測(cè)液按 1.2.1方法測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算黃酮提取率：黃酮提取率(mg/gFW)=(C×V×n)/m

式中，C代表根據(jù)回歸方程計(jì)算得到的質(zhì)量濃度（mg/mL），V代表提取液總體積（mL），n代表稀釋倍數(shù)，m代表卡琪花蒂瑪葉片粉末質(zhì)量（g）。

1.3.3 HPLC法測(cè)定黃酮類化合物含量

參考文獻(xiàn)[3,10]的方法，但對(duì)洗脫程序，進(jìn)樣量和流速條件稍作修改。A：0.1%甲酸；B：乙腈。洗脫程序：0～5 min：10%B；5～45 min 10%～90%B；45～50 min 90%B；50～55 min 90%～10%B；55～60 min 10%B；流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。將10種黃酮和6種異黃酮類化合物的標(biāo)準(zhǔn)品配置成一定濃度的溶液，按上述色譜條件測(cè)定并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。每種黃酮類化合物的含量用μg/mL表示。

1.3.4 DPPH自由基清除能力測(cè)定

DPPH實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行改進(jìn)。用乙醇配制濃度為0.2 mmol/L的DPPH工作液，避光放置一個(gè)晚上待用。向1 mL不同濃度的樣品溶液中加入3 mL DPPH 工作液，暗處反應(yīng) 30 min 后在 517 nm 處測(cè)定吸光值。以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，清除DPPH自由基能力按下式計(jì)算：

DPPH自由基清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中，A0為1 mL 無(wú)水乙醇+3 mL DPPH 乙醇溶液的吸光度；A1為1 mL樣品溶液+3 mL DPPH乙醇溶液的吸光度；A2為1 mL樣品溶液+3 mL乙醇溶液的吸光度。

1.3.5 ABTS自由基清除能力測(cè)定

ABTS實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行改進(jìn)。首先分別配制濃度為 7.4 mmol/L的 ABTS溶液和濃度為 2.6 mmol/L的高硫酸鉀溶液，然后將二者按1:1混合，室溫下避光過夜。使用時(shí)用無(wú)水乙醇將ABTS工作液稀釋40～50倍左右，使其吸光值A(chǔ)734=0.7±0.02。然后向0.2 mL不同濃度的樣品溶液中加入 2 mL稀釋過的ABTS工作液，暗處反應(yīng)30 min后在734 nm處測(cè)定吸光值。

1.3.6 Fe3+還原力測(cè)定

Fe3+還原實(shí)驗(yàn)方法按照參考文獻(xiàn)[13]。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均做 3組平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差（mean±SD）表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析（one-way ANOVA）和 Duncan's multiple range test方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(p＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 Fig.1 Standard curve of Rutin

蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.0084X-0.0709，其中Y為吸光度，X為蘆丁濃度μg/mL；R2=0.9922，表明在 20～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系，可用于測(cè)定黃酮含量。根據(jù)最優(yōu)提取方法分別提取卡琪花蒂瑪莖和葉中的黃酮，并測(cè)得卡琪花蒂瑪?shù)那o和葉中黃酮含量分別為 27.52±4.21、35.43±14.16 mgRutin/gFW，即每克卡琪花蒂瑪莖和葉的粉末中黃酮的含量分別為 27.52±4.21、35.43±14.16 mg。

2.2 卡琪花蒂瑪中黃酮的含量

由表1可知，大豆苷和黃豆黃苷；木犀草素和槲皮素；芹菜素和染料木苷三組的出峰時(shí)間較為接近，其他 10種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品在該條件下均可以得到較好的分離。

表2 莖和葉中黃酮的HPLC分析Table 2 HPLC analysis of Stem and Leaf

由表 2可知，莖中含有染料木苷（2.44±0.012 mg/gFW）、柚皮苷（2.45±0.027 mg/gFW）、和楊梅素（10.16±2.443 mg/gFW）；葉子中含有兒茶素（9.18±1.182 mg/gFW）、黃豆黃苷（2.55±0.031 mg/gFW）、蘆丁（2.92±0.022 mg/gFW）、柚皮苷（2.50±0.017 mg/gFW ） 和 楊 梅 素 （ 10.18±2.347 mg/gFW）。其中莖中楊梅素的含量較高，葉子中含有的兒茶素和楊梅素含量較高；并且葉子中楊梅素的含量和莖中楊梅素的含量相近。莖中染料木苷和葉中的黃豆黃苷均是異黃酮，是植物雌激素，有雌二醇具有類似的功能，推測(cè)可能與卡琪花蒂瑪可以治療產(chǎn)后骨質(zhì)疏松，恢復(fù)產(chǎn)后體力等功能密切相關(guān)；而其他種類的黃酮如楊梅素，兒茶素等可能與卡琪花蒂瑪具有很好的抗氧化活性密切相關(guān)。

2.3 DPPH自由基清除能力

圖2 DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity

卡琪花蒂瑪中黃酮類物質(zhì)和Vc對(duì)DPPH清除能力見圖2。由圖2可知，DPPH自由基的清除能力與黃酮和Vc的濃度密切相關(guān)。隨著黃酮濃度的升高，對(duì)DPPH自由基的清除能力也增強(qiáng)。當(dāng)葉子中黃酮濃度在3 μg/mL時(shí)，它對(duì)DPPH自由基的清除能力就達(dá)到最大；當(dāng)莖中黃酮濃度在6 μg/mL時(shí)它對(duì)DPPH自由基的清除能力達(dá)到最大；葉子中黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50為0.99 μg/mL，莖中黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50為1.91 μg/mL；從圖中還可以看出當(dāng)黃酮濃度在1.5～6 μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著濃度的升高明顯增高，在 0.375～0.75 μg/mL和6～12 μg/mL時(shí)，隨濃度升高清除能力未出現(xiàn)明顯升高，分析可能是黃酮濃度過低時(shí)，不能夠與過量自由基中和，所以DPPH本身的顏色掩蓋了被中和的DPPH的顏色，因此不會(huì)呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性；而當(dāng)黃酮濃度過高時(shí)，DPPH自由基幾乎完全被中和，所以也不會(huì)呈現(xiàn)出劑量依賴性。并且由圖可以看出卡琪花蒂瑪中莖和葉對(duì) DPPH自由基的清除能力是Cleaf＞Cstem。

2.4 ABTS自由基清除能力

卡琪花蒂瑪中黃酮類物質(zhì)和Vc對(duì)ABTS清除能力見圖3。由圖3可知，ABTS自由基的清除能力與黃酮的濃度密切相關(guān)。當(dāng)黃酮濃度在6 μg/mL時(shí)，它對(duì)ABTS自由基的清除能力就達(dá)到最大；葉子中黃酮對(duì)ABTS自由基清除能力的IC50為2.26 μg/mL，莖中黃酮對(duì)ABTS自由基清除能力的IC50為3.60 μg/mL；并且由圖可以看出在濃度范圍為0.375至6 μg/mL時(shí)，對(duì)ABTS的清除能力Cleaf＞Cstem＞Vc。當(dāng)黃酮濃度過低，也即是抗氧化劑含量過低時(shí)，不能夠組織ABTS被氧化成綠色的 ABTS·+，當(dāng)黃酮濃度適量時(shí)，隨著黃酮濃度的升高，被氧化的 ABTS·+自由基的量就會(huì)下降，當(dāng)黃酮濃度過高時(shí)，就會(huì)阻止所有的ABTS被氧化，所以清除率就不會(huì)再隨著黃酮濃度升高而增大。

圖3 ABTS自由基清除能力Fig.3 ABTS radical scavenging activity

2.5 Fe3+還原能力

圖4 Fe3+還原能力Fig.4 Fe3+ Reducing power

卡琪花蒂瑪中黃酮類物質(zhì)和Vc對(duì)Fe3+還原能力見圖4。由圖4可知，F(xiàn)e3+還原能力與黃酮和Vc的濃度密切相關(guān)。當(dāng)葉子中黃酮濃度在12 μg/mL時(shí)，它對(duì)Fe3+還原能力就達(dá)到最大；當(dāng)莖中黃酮濃度在 12 μg/mL時(shí)它對(duì)Fe3+還原能力達(dá)到最大；并且由圖可以看出在濃度范圍為0.375至12 μg/mL時(shí)，對(duì)Fe3+還原能力Cleaf＞Cstem＞Vc。并且在1.5至12 μg/mL 時(shí)，黃酮對(duì)Fe3+的還原能力呈顯著相關(guān)性。

3 結(jié)論

3.1 卡琪花蒂瑪莖和葉子中的總黃酮含量分別為27.52±4.21、35.43±14.16 mgRutin/gFW。其中，莖中含有染料木苷（2.44±0.012 mg/gFW）、柚皮苷（2.45±0.027 mg/gFW）、和楊梅素（10.16±2.443 mg/gFW）；葉子中含有兒茶素（9.18±1.182 mg/gFW）、黃豆黃苷（2.55±0.031 mg/gFW）、蘆?。?.92±0.022 mg/gFW）、柚皮苷（2.50±0.017 mg/gFW）和楊梅素（10.16±2.347 mg/gFW）。

3.2 莖和葉中的黃酮的抗氧化能力在不同的抗氧化體系中均有顯著效果：其中莖中黃酮對(duì)DPPH、ABTS自由基清除能力的 IC50值分別為 1.91、3.60 μgRutin/mL，葉子中黃酮對(duì) DPPH、ABTS自由基清除能力相對(duì)較好，IC50值分別為 0.99、2.26 μgRutin/mL。

3.3 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知卡琪花蒂瑪莖中黃酮含量約占2.8%，葉中黃酮含量約占3.5%，均高于葛根[14]中1.2%黃酮和具有類似功能的益母草[15]中0.28%黃酮；并且卡琪花蒂瑪葉中黃酮含量高于莖中黃酮含量?？ㄧ骰ǖ佻斨泻肯鄬?duì)較多的黃酮-兒茶素和楊梅素具有很好抗氧化、抗癌[5]和減少骨質(zhì)疏松[7]的作用與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中卡琪花蒂瑪具有很好抗氧化活性相呼應(yīng)，為進(jìn)一步開發(fā)利用卡琪花蒂瑪中黃酮提供了理論基礎(chǔ)。