不同濃度硒處理對豆瓣菜生長及硒富集的影響

李克強(qiáng)，陳發(fā)波，林立金，廖明安*，黃科文，李華雄，薛莞莞

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130；2.長江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶 408100；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬研究所，成都 611130；4.四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果研究所，四川內(nèi)江 641000）

硒是人體必需微量元素，在人體中起到抗癌、抵御多種疾?。ㄈ绶乐剐哪X血管疾病、克山病等）、延緩衰老等作用，人體補(bǔ)充適量硒可增強(qiáng)免疫力[1-2]。由于無機(jī)硒酸鹽對人體毒性大[3]，要滿足人體對硒元素的需求，目前常采用土壤施硒或葉面噴硒的方法，由植物將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，并通過糧食作物或蔬菜進(jìn)入食物鏈以供人或動(dòng)物利用[4-5]。不同植物對硒的耐受能力及吸收能力有很大差異，人們根據(jù)植物富集硒的能力差異，劃分出原生硒富集植物、次生硒富集植物和非富硒植物3種類型。原生硒富集植物即硒超富集植物，當(dāng)其生長在高硒土壤中，硒含量可高于 1 000 mg/kg，如豆科黃芪屬（Astragalus sp.）、假含羞草屬（Neptunia sp.）、十字花科雞冠花屬（Stanleya sp.）等屬中的植物；次生硒富集植物硒含量可高達(dá)數(shù)百mg/kg，分布在紫苑屬（Aster sp.）、濱藜屬（Atriplex sp.）、草木犀屬（Melilotus sp.）和云苔屬（Brassica sp.）等屬中[6-8]。而大部分蔬菜則屬于非富硒植物，雖然能吸收并積累硒，但其富集能力有限且不能在過高硒濃度條件下生長[9-11]。因此，篩選出一種生長迅速、對硒富集量大且耐受性強(qiáng)的硒富集蔬菜很有必要。

豆瓣菜（Nasturtium officinale）又叫西洋菜，屬十字花科豆瓣菜屬，為一、二年生水生草本植物，原產(chǎn)歐洲地中海東部，約二十世紀(jì)初引至我國栽種[12]。國內(nèi)豆瓣菜屬于豆瓣菜屬的共有2種植物，即豆瓣菜以及西藏豆瓣菜，這2個(gè)種在全國大部分地區(qū)為野生狀態(tài)，沿海地區(qū)常用作綠葉水生蔬菜栽培[13]。已有研究表明，水生蔬菜有很強(qiáng)的富集能力，對常量金屬元素平均富集系數(shù)為2～150倍；稀有元素平均富集量總體上高于陸生蔬菜[14]。同時(shí)研究表明部分十字花科植物具有較強(qiáng)的硒積累能力[7-9，15]。鑒于此，本試驗(yàn)以十字花科水生野菜豆瓣菜為研究對象，探究不同硒濃度處理對豆瓣菜生長、硒富集的影響，以期了解豆瓣菜硒積累與耐受特性，并篩選出有利于其生長的最佳硒濃度。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤為水稻土，取自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)農(nóng)田（30°71′N，103°86′E），pH 7.42，有機(jī)質(zhì) 31.73 g/kg，全氮 1.05 g/kg，全磷 0.37 g/kg，全鉀 25.71 g/kg，堿解氮56.13 mg/kg，速效磷 17.15 mg/kg，速效鉀 56.65 mg/kg，全硒0.35 mg/kg。土壤理化性質(zhì)按照參考文獻(xiàn)[16-17]的方法測定。

豆瓣菜植株盆栽于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)大棚，植株健壯，未受硒污染，無病蟲害。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2016年9—12月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)溫江校區(qū)進(jìn)行。2016年9月，將土壤風(fēng)干、壓碎、過5 mm篩后，分別稱取3.0 kg裝于10 cm×22 cm（高×直徑）的塑料盆內(nèi)，每盆施入無機(jī)復(fù)合肥3 g作基肥，之后加入分析純Na2SeO3溶液，使其與土壤充分混勻，保持淹水狀態(tài)，自然放置平衡4周后再次混合備用。土壤中加入的四價(jià)硒濃度分別為 0（CK）、5、10、25、50、75、100 mg/kg。2016年10月，選擇長勢一致，約 5 cm長的枝條扦插至盆中，每盆扦插3株，每個(gè)處理重復(fù)6次。盆隨機(jī)擺放于溫室，盆間距10 cm，每7 d交換位置以減弱邊際效應(yīng)的影響，保持淹水2 cm。試驗(yàn)過程中未受硒污染與環(huán)境脅迫，及時(shí)除草、防蟲。

1.2.2 樣品采集及測定方法

60 d后測定豆瓣菜葉片光合色素含量，并選取每株豆瓣菜植株頂部幼嫩葉片測定抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性，考馬斯亮藍(lán)比色法測定可溶性蛋白含量[18]。之后整株收獲，將豆瓣菜根、莖、葉分離并用自來水洗凈，再用去離子水沖洗3次。之后于110℃殺青15 min，75℃烘干至恒重，稱重，粉碎，過0.149 mm篩備用。稱取烘干樣品，采用硝酸-高氯酸消煮，氫化物原子熒光光譜法測定豆瓣菜各部分硒含量[19]。稱取烘干地上部，采用蒽酮比色法測定豆瓣菜地上部可溶性糖含量[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

每個(gè)處理使用每盆中3株豆瓣菜平均數(shù)據(jù)作1個(gè)重復(fù)用于數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)采用SPSS進(jìn)行方差分析（Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較），用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析。

根冠比=根部生物量（g/株）/地上部生物量（g/株）

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=植物地上部分硒含量（mg/kg）/根部硒含量（mg/kg）

硒積累量（μg/株）=硒含量（mg/kg）×生物量（g/株）

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度硒處理對豆瓣菜生物量的影響

由表1可知，不同濃度硒處理后，豆瓣菜各部分生物量均呈先上升后下降的趨勢。其中根部生物量僅在硒濃度為10 mg/kg時(shí)顯著高于（P＜0.05）對照，莖稈生物量除硒濃度為100 mg/kg時(shí)顯著低于（P＜0.05）對照外，其余各處理均較對照顯著提高（P＜0.05）。就葉片而言，當(dāng)硒濃度為5～25 mg/kg時(shí)，其生物量較對照顯著提高（P＜0.05），而100 mg/kg則顯著降低（P＜0.05）。地上部生物量在5～50 mg/kg硒濃度處理后均顯著提高（P＜0.05），其中以10 mg/kg效果最佳，該處理地上部生物量較對照提高16.97%（P＜0.05）。100 mg/kg處理對豆瓣菜造成的毒害最嚴(yán)重，使其根部與地上部生物量分別降低 36.27%（P＜0.05）、7.77%（P＜0.05）。豆瓣菜根冠比在施硒處理后均低于對照（P＜0.05），且隨著硒濃度的上升呈下降趨勢。

2.2 不同濃度硒處理對豆瓣菜光合色素含量的影響

由表2可知，豆瓣菜光合色素含量隨硒濃度上升均呈先升后降的趨勢，且在硒濃度為10 mg/kg時(shí)有最大值，這與豆瓣菜生物量類似。在硒濃度為0～50 mg/kg范圍內(nèi)，各處理間葉綠素與類胡蘿卜素含量差異均不顯著（P＞0.05）；而當(dāng)硒濃度為 75～100 mg/kg時(shí)，則顯著下降（P＜0.05）。就葉綠素a/b而言，各處理與對照間無顯著差異（P＞0.05），但10 mg/kg與25 mg/kg處理的結(jié)果顯著大于（P＜0.05）75 mg/kg與100 mg/kg。

表1 不同濃度硒處理下豆瓣菜生物量Table1 N.officinale biomass under different concentrations of Se

表2 不同濃度硒處理下豆瓣菜光合色素含量Table2 N.officinale photosynthetic pigment content under different concentrations of Se

2.3 不同濃度硒處理對豆瓣菜葉片抗氧化酶活性與可溶性蛋白含量的影響

5～25 mg/kg的外源硒處理未使豆瓣菜葉片SOD活性較對照顯著降低（P＜0.05），而當(dāng)硒濃度升高至50～100 mg/kg時(shí)，SOD 活性顯著降低（P＜0.05）（表 3）。豆瓣菜葉片POD與CAT活性隨處理濃度的升高均呈先上升后下降的趨勢。葉片POD活性除100 mg/kg外其余各處理酶活性均較對照顯著升高（P＜0.05），其中以10 mg/kg與25 mg/kg的POD活性最高，分別較對照提高了 35.93%（P＜0.05）、36.91%（P＜0.05）。葉片CAT活性在硒濃度為10 mg/kg時(shí)顯著高于（P＜0.05）對照，而 100 mg/kg時(shí)則顯著低于（P＜0.05）對照。外源硒處理均顯著降低（P＜0.05）了豆瓣菜葉片可溶性蛋白含量，在硒濃度5～100 mg/kg范圍內(nèi)，呈先升后降的趨勢，其中10 mg/kg與25 mg/kg處理的可溶性蛋白含量顯著大于（P＜0.05）其余施硒處理。

表3 不同濃度硒處理下豆瓣菜葉片抗氧化酶活性與可溶性蛋白含量Table3 N.officinale leaf antioxidant enzyme activity and soluble protein content under different concentrations of Se

2.4 不同濃度硒處理對豆瓣菜地上部可溶性糖含量的影響

由圖1可知，不同濃度硒處理后豆瓣菜地上部可溶性糖含量較對照均降低，且隨硒濃度的升高其含量呈先下降再上升最后持續(xù)降低的趨勢。除硒濃度為25 mg/kg處理外，其余各處理與對照間的差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05），其中以100 mg/kg處理的地上部可溶性糖含量最低。各施硒處理間可溶性糖含量表現(xiàn)為10、25 mg/kg硒濃度處理顯著高于（P＜0.05）75、100 mg/kg處理。

圖1 不同濃度硒處理下豆瓣菜地上部可溶性糖含量Figure1 N.officinale shoot soluble sugar content under different concentrations of Se

2.5 不同濃度硒處理對豆瓣菜硒含量的影響

由表4可知，外源施硒后，豆瓣菜根、莖、葉、地上部硒含量較對照均顯著提高（P＜0.05），且硒含量隨著外源硒濃度的升高而升高。統(tǒng)計(jì)分析表明，豆瓣菜根、莖、葉、地上部硒含量與外源硒濃度在0.01水平上均呈顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.999、0.990、0.998、0.996。由此可見，外源硒濃度在0～100 mg/kg范圍內(nèi)，豆瓣菜各部分硒含量與外源硒濃度呈極顯著線性關(guān)系。就轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)來說，在硒濃度0～100 mg/kg范圍內(nèi)均小于1，且隨硒濃度的升高總體呈先下降再上升最后再下降的趨勢。各施硒處理的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均顯著低于（P＜0.05）對照，其中以25 mg/kg處理的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)顯著高于（P＜0.05）其余各施硒處理。

2.6 不同濃度硒處理對豆瓣菜硒積累量的影響

由圖2可知，外源施硒后豆瓣菜根部及地上部硒積累量隨硒濃度的升高而升高，這一結(jié)果與硒含量類似。統(tǒng)計(jì)分析表明豆瓣菜各部位硒積累量與外源硒濃度在0.01水平上均呈顯著正相關(guān)，以yr表示豆瓣菜根部硒積累量，ys表示其地上部分硒積累量，x表示硒濃度，其根部及地上部分硒積累量隨外源硒濃度變化的函數(shù)關(guān)系如下：yr=1.627x+16.472（r=0.983，P=0.000 07）、ys=1.542x+8.522（r=0.985，P=0.000 05）。

3 討論

對于大多數(shù)蔬菜來說，適宜濃度的硒能促進(jìn)植株生長，但過量的硒會(huì)對植株產(chǎn)生毒害，這一結(jié)果在番茄、萵苣、菠菜、白菜、胡蘿卜等蔬菜作物上已得到證實(shí)[21-24]。本試驗(yàn)中豆瓣菜也表現(xiàn)為適宜濃度的硒促進(jìn)其生長，過量濃度則抑制生長，但與一般蔬菜不同，豆瓣菜表現(xiàn)出了對高濃度硒更強(qiáng)的耐性，這是表明豆瓣菜為硒富集植物的重要依據(jù)。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)的生理功能體現(xiàn)在通過二硫鍵、氫鍵、范德華力等形成一定的結(jié)構(gòu)，多肽鏈之間或內(nèi)部的正常二硫鍵由硫氫基兩兩形成[25]。在一般植物中，硒不加區(qū)分地替代了硫的功能，以硒氨基酸的形式組合進(jìn)入蛋白質(zhì)，導(dǎo)致二硫鍵無法形成，使得蛋白質(zhì)不正確折疊，相應(yīng)的蛋白質(zhì)和酶失去原有的功能，對植物造成毒害；而硒富集植物則將硒轉(zhuǎn)化為硒甲基半胱氨酸等非蛋白氨基酸，從而對高濃度的硒有很強(qiáng)的耐性[26-27]，因此一般植物對硒很敏感，低濃度的硒就能對一般植物造成毒害。有研究表明，外源添加亞硒酸鈉使土壤硒添加濃度為20 mg/kg時(shí)，小白菜、芥菜、生菜與菠菜的地上部、地下部生物量均顯著降低[28]，并且一般非富硒植物硒含量＞50 mg/kg就會(huì)使植物中毒，影響生長[15]。本試驗(yàn)中，當(dāng)外源硒濃度為25 mg/kg時(shí)，豆瓣菜根部與地上部硒含量分別為170.29、71.22 mg/kg，但該濃度下豆瓣菜并未受毒害，其地上部生物量反而顯著升高（P＜0.05）。而當(dāng)硒濃度高達(dá) 75 mg/kg，豆瓣菜地上部硒含量為158.49 mg/kg時(shí)，其地上部生物量任未顯著降低（P＞0.05），由此可見豆瓣菜對高濃度的硒具有很強(qiáng)耐性，初步判斷為硒富集植物。同時(shí)由于豆瓣菜根部硒含量高于地上部，因此適宜濃度的硒更有利于豆瓣菜地上部的生長而過量的硒對豆瓣菜根部的毒害作用更明顯，使得豆瓣菜根冠比隨著外源硒濃度的升高而降低?？偟膩碚f，外源硒濃度為5～50 mg/kg均有利于豆瓣菜生長，其中以10 mg/kg效果最佳。

表4 不同濃度硒處理下豆瓣菜硒含量Table4 N.officinale Se content under different concentrations of Se

圖2 不同濃度硒處理下豆瓣菜硒積累量Figure2 N.officinale Se accumulation under different concentrations of Se

光合色素含量是評(píng)價(jià)光合作用的重要因素，能從側(cè)面反映出植物的生長狀況。本試驗(yàn)結(jié)果表明外源施用一定濃度（5～50 mg/kg）的硒雖能提高豆瓣菜光合色素的積累，但未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。而當(dāng)硒濃度過高時(shí)（75～100 mg/kg）就會(huì)對豆瓣菜光合色素造成不利影響，影響其光合作用，進(jìn)而影響其生長。硒對葉綠素含量的影響可能與硒作用于葉綠素合成過程中兩種重要的含巰基的酶有關(guān)[29]，同時(shí)臺(tái)培東等[30]的研究表明，低濃度的硒能促進(jìn)葉綠素前體 ALA（δ-aminolevalinic acid）的合成，但濃度過高則會(huì)對ALA的合成產(chǎn)生抑制作用。在光合作用中，只有少數(shù)特殊狀態(tài)的葉綠素a可以吸收光能并將之轉(zhuǎn)化，而大多數(shù)的葉綠素a和全部的葉綠素b只能傳遞光能[31]，本試驗(yàn)結(jié)果顯示硒濃度為10、25mg/kg的處理較75、100 mg/kg的豆瓣菜葉綠素a/b的比值更高，因此適宜濃度（10、25 mg/kg）的硒處理更加有利于豆瓣菜光能的吸收，從而促進(jìn)豆瓣菜生長。

硒與重金屬類似，能使硫醇發(fā)生強(qiáng)烈的氧化還原反應(yīng)，以二價(jià)硒化物形態(tài)為氧化催化劑，繼續(xù)氧化諸如GSH之類的硫醇，還原氧產(chǎn)生自由基超氧化合物（O2-）[32-33]，從而影響酶和蛋白質(zhì)的活性。在植物體內(nèi)，SOD、POD和CAT共同組成活性氧清除系統(tǒng)，有效清除自由基和過氧化物，其活性高低與硒脅迫下植物抗逆性大小有一定相關(guān)性[34-35]。本試驗(yàn)中，適宜濃度的硒能誘導(dǎo)POD（硒濃度5～75 mg/kg）和CAT（硒濃度10 mg/kg）活性的上升，有利于其抵抗逆境，這可能是豆瓣菜能耐受高濃度的硒的原因之一。但過高濃度的硒會(huì)導(dǎo)致SOD（硒濃度50～100 mg/kg）和CAT（硒濃度100 mg/kg）活性下降，說明硒對豆瓣菜抗氧化酶的影響存在劑量效應(yīng)。植物組織內(nèi)的酶蛋白多為可溶性蛋白，當(dāng)外源施硒后，豆瓣菜可溶性蛋白含量顯著下降（P＜0.05），但外源硒濃度為5～25 mg/kg的豆瓣菜的生物量及抗氧化酶活性卻并未降低。這是由于硒富集植物大量合成含硒游離氨基酸，使得可溶性蛋白合成原材料減少，但起初一些重要的蛋白質(zhì)及酶并未受其影響，而當(dāng)硒濃度過高時(shí)，硒的毒害作用便表現(xiàn)出來。這也解釋了施硒處理的豆瓣菜可溶性蛋白含量呈先升高后持續(xù)降低的趨勢?？扇苄蕴鞘菂⑴c植物滲透調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)[36]，當(dāng)外源硒濃度較低時(shí)，并不能引起豆瓣菜的防御性反應(yīng)，而是直接影響可溶性糖結(jié)構(gòu)或抑制了其合成，因此可溶性糖含量下降；隨著硒濃度的上升，豆瓣菜的保護(hù)機(jī)制啟動(dòng)，可溶性糖大量合成從而保護(hù)其細(xì)胞免受損傷；而當(dāng)硒濃度進(jìn)一步升高，脅迫加重使得這種防御措施失效，導(dǎo)致可溶性糖含量隨著硒濃度升高持續(xù)降低。

植物對不同化學(xué)形態(tài)的硒存在不同的吸收機(jī)制，有研究表明，正四價(jià)的硒大多通過特殊的陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道以被動(dòng)擴(kuò)散形式滲透到植物細(xì)胞內(nèi)[26，37]。本試驗(yàn)中，外源施硒能顯著地提高（P＜0.05）豆瓣菜硒含量，且硒含量與外源硒濃度呈極顯著線性正相關(guān)，這一結(jié)果是四價(jià)硒（Ⅳ）的吸收機(jī)制所決定的，細(xì)胞外高濃度的硒更有利于豆瓣菜對硒的吸收；同時(shí)這一結(jié)果也揭示了外源硒濃度與豆瓣菜各部位硒含量緊密的聯(lián)系（0～100 mg/kg范圍內(nèi)），為生產(chǎn)特定硒含量的豆瓣菜提供了參考。不同形態(tài)的硒在植物體內(nèi)的運(yùn)輸與分布也存在差異，其中四價(jià)硒（Ⅳ）先轉(zhuǎn)化為六價(jià)硒（Ⅵ）及有機(jī)硒化合物才能運(yùn)輸?shù)降厣喜浚湮账俾蚀笥谵D(zhuǎn)化速率，因此大部分在根部積累[15，38]，這種轉(zhuǎn)化特性解釋了豆瓣菜硒轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均小于1這一結(jié)果。同時(shí)，這一轉(zhuǎn)運(yùn)過程受硒的調(diào)控，當(dāng)外源硒濃度較低時(shí)，豆瓣菜轉(zhuǎn)運(yùn)能力低，而當(dāng)硒濃度上升到一定時(shí)，硒的轉(zhuǎn)運(yùn)能力被顯著地提高（P＜0.05），但這種調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。有研究表明，蔬菜雖然可以吸收并積累硒，但一般非富硒植物體內(nèi)硒含量不超過25 mg/kg，即使生長在富硒土壤中也不會(huì)超過100 mg/kg[11]，本試驗(yàn)中外源硒濃度為100 mg/kg時(shí)豆瓣菜地上部分硒含量為213.18 mg/kg，根部硒含量高達(dá)651.55 mg/kg，因此進(jìn)一步證明豆瓣菜為一種次生硒富集植物。與硒含量類似，硒積累量與硒濃度（0～100 mg/kg范圍內(nèi)）呈顯著正相關(guān)。但隨著硒濃度的繼續(xù)升高，即硒濃度高到嚴(yán)重影響豆瓣菜生長時(shí)，硒積累量將不會(huì)繼續(xù)升高甚至反而降低，具體變化趨勢有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，豆瓣菜對硒的耐受范圍廣、富集能力強(qiáng)，是一種次生硒富集植物，其硒含量、硒積累量與外源硒濃度呈極顯著線性正相關(guān)。適宜濃度的硒有利于豆瓣菜生長，當(dāng)外源硒濃度為10 mg/kg時(shí)，效果最佳。