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    miR-200b對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231的負(fù)性調(diào)控作用

    2018-09-07 10:26:10張寅斌閆婉君趙小瑤盛倩文管海濤張淑群
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)克隆家族

    劉 棣,張寅斌,閆婉君,趙小瑤,盛倩文,許 朋,管海濤,張淑群

    (西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科,陜西西安 710004)

    乳腺癌的全球發(fā)病率在女性患者惡性腫瘤發(fā)病中居首位,是常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。三陰性乳腺癌是乳腺癌中較特殊的類型,缺少激素受體、表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá),侵襲轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng),惡性程度高,目前缺乏有效的治療手段[2-4]。因此,需要進(jìn)一步研究三陰性乳腺癌的發(fā)病機(jī)制及生物學(xué)行為,尋找新的靶點(diǎn)。近年來(lái),對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)制的研究轉(zhuǎn)向了微小RNA(microRNA, miRNA),它是非編碼的單鏈RNA,含有18~25個(gè)核苷酸序列,在人類發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡及激素分泌等多種生理過(guò)程發(fā)揮重要作用。研究表明,miR-200在多種腫瘤中異常表達(dá)[5-6],而對(duì)于其在乳腺癌中的作用及功能機(jī)制仍存在爭(zhēng)議[6-7]。本研究通過(guò)檢測(cè)miRNA-200b在各種分子分型乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá),以及它對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲等能力的影響,探討miR-200b在三陰性乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的可能作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1細(xì)胞株及試劑人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、BT-474、MDA-MB-453、SKBR3、MDA-MB-468、MDA-MB-231來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;RPMI 1640培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品,miR-200b mimics、miR-200b inhibitor、negative control來(lái)自Dharmacon公司;引物由華大基因公司合成,RT-PCR相關(guān)試劑來(lái)自TaKaRa公司。

    1.2方法

    1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及RNA提取 在含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。采用Trizol提取總RNA。

    1.2.2定量PCR檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞miR-200家族表達(dá)量 定量PCR采用SYBR試劑盒進(jìn)行。反應(yīng)體系50 μL,95 ℃ 5 min, 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 78 ℃ 20 s,共40個(gè)循環(huán),收集反應(yīng)數(shù)據(jù)。U6 snRNA作為內(nèi)參。

    1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 因?yàn)榧韧鶎?duì)miR-200b的研究不甚清楚,所以選取miR-200家族中的miR-200b進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取MDA-MB-231細(xì)胞(5×104/L)接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(2×105/孔),分別以miR-200b mimic,inhibitor,negative control轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌2次,加入100 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

    1.2.4克隆形成實(shí)驗(yàn) 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞(200個(gè)細(xì)胞/孔),含100 mL/L FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。5 g/L結(jié)晶紫在室溫下染色1 h。計(jì)數(shù)每板克隆形成數(shù)量,計(jì)算克隆形成效率(colony forming efficiency, CFE)。

    1.2.5四唑鹽比色法(MTT)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力 取細(xì)胞5×104/L,鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(100 μL/孔),分別在轉(zhuǎn)染后24、48、72 h進(jìn)行MTT檢測(cè)。酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度。

    1.2.6細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲實(shí)驗(yàn) 采用transwell小室,預(yù)鋪Matrigel,取5×104/L的細(xì)胞接種于小室的上層,加不含F(xiàn)BS培養(yǎng)基。含100 mL/L FBS的培養(yǎng)基加入小室下層。24 h后以結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1乳腺癌細(xì)胞miR-200家族的表達(dá)Trizol法提取totalRNA,Real-time PCR檢測(cè)各種分型乳腺癌細(xì)胞株中miR-200a/b/c的表達(dá)。結(jié)果顯示,分別與MDA-MB-231和MDA-MB-468組相比,miR-200a/b/c在MCF-7、BT-474、MDA-MB-453組中均處于高表達(dá)水平(P<0.05,圖1)。miRNA-200家族在Luminal型和Her-2表達(dá)型乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)量高于三陰性型的表達(dá)(P<0.05,圖1)。miR-200家族在三陰性乳腺癌中的表達(dá)較為特殊。

    圖1乳腺癌細(xì)胞中miR-200a/b/c的表達(dá)情況

    Fig.1 The expression ofmiR-200a/b/c in breast cancer cell lines

    與MCF-7、BT-474、MDA-MB-453組比較,*P<0.05。

    2.2miR-200b對(duì)克隆形成率的影響研究顯示,miR-200家族對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用存在較多分歧,而對(duì)miR-200b的研究較少,所以本研究選取miR-200b在三陰性乳腺癌細(xì)胞中做進(jìn)一步研究。轉(zhuǎn)染miR-200b inhibitor和mimics后,檢測(cè)各組細(xì)胞克隆形成情況。與control組相比,inhibitor組MDA-MB-231的克隆形成率增高(P<0.05)。而與control組相比較,miR-200b mimics組腫瘤細(xì)胞克隆形成率降低(P<0.05,圖2)。

    2.3miR-200b對(duì)細(xì)胞增殖的影響在MDA-MB-231細(xì)胞中,通過(guò)inhibitor下調(diào)miR-200b表達(dá),與negative control(NC)組相比,inhibitor組在48 h和72 h時(shí),細(xì)胞增殖增高(P<0.05,圖3)。通過(guò)miR-200b mimics上調(diào)miR-200b表達(dá)后,miR-200b組在48 h、72 h時(shí),細(xì)胞增殖降低(P<0.05)。

    圖2miR-200b對(duì)細(xì)胞克隆形成率的影響

    Fig.2 The influence of miR-200b on MDA-MB-231 cell colony formation (NC:negative control)

    A:miR-200b抑制劑對(duì)MDA-MB-231克隆形成率的影響;B:miR-200b mimics對(duì)MDA-MB-231克隆形成率的影響。與NC組比較,*P<0.05。

    圖3miR-200b對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響

    Fig.3 The effect of miR-200b on MDA-MB-231 cell proliferation (NC: negative control)

    A:miR-200b抑制劑對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響;B:miR-200b mimics對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響。與NC組比較,*P<0.05。

    2.4miR-200b對(duì)細(xì)胞侵襲力的影響通過(guò)transwell小室方法,檢測(cè)miR-200b對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞侵襲力影響。和control組對(duì)比,miR-200b inhibitor組的細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)。而miR-200b mimics組的細(xì)胞數(shù)量少于對(duì)照組(P<0.05,圖4)。提示miR-200b能抑制MDA-MB-231細(xì)胞株的侵襲能力。

    圖4miR-200b對(duì)細(xì)胞侵襲力的影響

    Fig.4 The effect ofmiR-200b on cell invasion (NC:negative control)

    A:miR-200b抑制劑對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲力的影響;B:miR-200b mimics對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲力的影響。與NC組比較,*P<0.05。

    3 討 論

    乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅女性健康。三陰性乳腺癌(ER、PR和Her-2均為陰性)是乳腺癌中的一個(gè)類型,其發(fā)病年齡低、惡性程度較高、預(yù)后較差,臨床實(shí)踐中除了化療,缺少其他有效的治療手段[2-4]。三陰性乳腺癌多因短期內(nèi)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而治療失敗。因此,針對(duì)三陰性乳腺癌的相關(guān)研究,一直是臨床腫瘤領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。

    作為近來(lái)發(fā)現(xiàn)的miRNAs,它對(duì)腫瘤的調(diào)控作用,越來(lái)越受到重視。通過(guò)研究miRNAs對(duì)乳腺癌的影響,以及通過(guò)調(diào)控miRNAs來(lái)靶向調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),是目前研究的新方向,也是較有希望的治療模式。已有研究發(fā)現(xiàn),不同的miRNAs與乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥相關(guān),其中miR-200家族與雌激素受體拮抗劑(fulvestrant)密切相關(guān)[8]。既往研究表明,miR-200在多種腫瘤中異常表達(dá)[5-6],miR-200家族對(duì)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移方面作用的報(bào)道存在較多爭(zhēng)議[6-7,9-10]。KORPAL等[11]研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-200表達(dá)后,乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯增高[11]。CHOI[12]的研究發(fā)現(xiàn),在三陰性乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)miR-200a/200b/429或miR-141/200c,都會(huì)抑制癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移,其中miR-141/200c能夠更高效地在三陰性乳腺癌中分泌VEGF-A激活FAK/PI3K/AKT信號(hào)通路,從而抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。而PERDIGAO-HENRIQUES[10]的研究顯示,miR-200c抑制TGF-β/BMP信號(hào)通路,促進(jìn)表皮基因表達(dá),從而通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)來(lái)抑制細(xì)胞的侵襲力。有研究表明miR-200抑制三陰性乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[9,13]。由此可見(jiàn),miR-200家族在腫瘤細(xì)胞,尤其是三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移中的作用還存在不同的意見(jiàn)[13],有必要進(jìn)一步研究。

    本研究針對(duì)miR-200家族在三陰性乳腺癌細(xì)胞中的作用進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)miR-200a/b/c在不同分子分型的乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平存在差異,三陰性乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)明顯低于Luminal型和Her-2型乳腺癌,表明miR-200a/b/c的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在三陰性和非三陰性乳腺癌中存在差異[14,8]。我們進(jìn)一步研究了miR-200b在三陰性乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移方面的作用,通過(guò)上調(diào)低表達(dá)的miR-200b,發(fā)現(xiàn)三陰性細(xì)胞MDA-MB-231的侵襲能力被抑制。miR-200b具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、克隆形成以及侵襲力的作用。由此可見(jiàn),miR-200b在三陰性癌細(xì)胞株MDA-MB-231中發(fā)揮抑癌作用,miR-200與ER、PR、Her-2分子的關(guān)系,以及miR-200在不同分子分型乳腺癌的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其下游復(fù)雜的信號(hào)通路有待進(jìn)一步闡明。近年來(lái)的研究結(jié)果,miRNAs可能成為有希望的腫瘤診斷、治療手段。結(jié)合既往miRNAs在惡性腫瘤中的研究[15],miR-200b被認(rèn)為可能作為三陰性乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn),為其治療提供新的思路。

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