丙氨酸依賴型轉(zhuǎn)氨酶高通量快速檢測(cè)方法的建立

劉 歡，吳旭日，陳依軍

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院化學(xué)生物學(xué)研究室，南京 210009)

臨床使用的手性藥物中近70%都含有手性胺或其衍生物結(jié)構(gòu)，如神經(jīng)類藥物屈昔多巴、心血管藥物西那卡塞、抗高血壓藥物阿里克侖以及抗感染藥物氨曲南母核等[1-2]。手性胺類化合物是一類通用性強(qiáng)、價(jià)值高的“平臺(tái)化合物”，對(duì)藥物和精細(xì)化工品的開發(fā)意義重大。近些年酶法合成技術(shù)已逐漸成為手性胺制備的重要手段，并在制藥產(chǎn)業(yè)綠色化進(jìn)程中表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景[3]?？捎糜谑中园飞锖铣傻拿钢饕ㄋ饷浮⒚摎涿负娃D(zhuǎn)氨酶三大類[4]。水解酶制備手性胺，原子經(jīng)濟(jì)性較差[5]。脫氫酶的立體選擇性和底物譜均有待改善[6]。轉(zhuǎn)氨酶由于種類豐富、底物譜廣、立體選擇性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，仍是手性胺及其衍生物酶法合成的重要催化劑。

現(xiàn)有的轉(zhuǎn)氨酶已難以滿足快速增長的手性胺類藥物和精細(xì)化工品的研發(fā)需求，急需從自然界篩選新轉(zhuǎn)氨酶或改造現(xiàn)有轉(zhuǎn)氨酶。目前，文獻(xiàn)已報(bào)道過的轉(zhuǎn)氨酶活性篩選方法可分為直接和間接法兩種[13]，但這些方法大多需要依賴特定底物或產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)變化來實(shí)現(xiàn)，廣譜適用性存在一定局限。自然界中，大多數(shù)ω-轉(zhuǎn)氨酶都可以識(shí)別丙氨酸[16]，所以針對(duì)丙氨酸或其反應(yīng)產(chǎn)物(丙酮酸)建立轉(zhuǎn)氨酶的篩選方法將具有較好的通用性。VfTA是一種來源于河流弧菌的ω-轉(zhuǎn)氨酶，現(xiàn)已被應(yīng)用于多種手性胺類藥物的生物合成[9]。本研究以VfTA作為模式轉(zhuǎn)氨酶，針對(duì)其催化丙氨酸脫氨生成丙酮酸的特性，在反應(yīng)體系中偶聯(lián)丙酮酸氧化酶和辣根過氧化物酶，并加入顯色劑3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)成功建立了一種丙氨酸依賴型轉(zhuǎn)氨酶活性篩選新方法。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

丙酮酸氧化酶(≥15 U/mg，上海源葉生物公司)；辣根過氧化物酶(HRP，≥250.0 U/mg，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(美國Fermentas公司)；蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(美國Genway公司)；色譜乙腈和三氟乙酸(美國Tedia 公司)；蛋白胨和酵母粉(英國Oxoid公司)；焦磷酸硫胺素(TPP)、磷酸吡哆醛、L-丙氨酸、D-丙氨酸、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、乙醛酸和苯乙酮均購自阿拉丁試劑有限公司；其余試劑均為市售分析純。VfTA表達(dá)菌株為中國藥科大學(xué)化學(xué)生物學(xué)研究室保存。

1.2 儀 器

pH計(jì)(瑞士Mettler-Toledo公司)；分析天平(德國Sartorius公司)；純水儀(英國ELGA Labwater公司)；高壓蒸氣滅菌鍋(日本Tomy公司)；分析液相色譜儀和Agilent C18色譜柱(美國安捷倫科技有限公司)；蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)；搖床(美國NBS公司)；凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)；高壓細(xì)胞破碎儀(英國Constant Systems公司)；酶標(biāo)儀(美國BioTek儀器有限公司)。

2 方 法

2.1 VfTA的誘導(dǎo)表達(dá)和活性測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15]，0.5 mmol/L IPTG和25 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)10 h后，5 000 r/min 冷凍離心20 min收集菌體，菌體高壓破碎，12 000 r/min冷凍離心30 min后獲得VfTA粗酶液，然后SDS-PAGE分析和酶活檢測(cè)。

VfTA活性測(cè)定體系：50 mmol/L的(S)-α-MBA；10 mmol/L的丙酮酸；0.1 mmol/L的PLP；10 μLVfTA粗酶液和0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)。37 ℃下反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間后加入等體積甲醇終止，離心取上清液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。1個(gè)酶活單位定義為每分鐘生成苯乙酮的量(mmol)。比活力為每毫克總蛋白所含的活力單位數(shù)。色譜條件：色譜柱Agilent C18(100 mm×4.6 mm，3 μm)，流動(dòng)相A為超純水(含0.1% TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(0.1% TFA)，30%等度洗脫10 min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫為40 ℃，檢測(cè)波長為208 nm，流速為0.3 mL/min。

2.2 基于顏色反應(yīng)的轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定方法的可行性考察

如圖1所示，基于顏色反應(yīng)的轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定方法的基本原理為：(1)VfTA催化底物氨化的同時(shí)氨基供體L-丙氨酸脫氨生成丙酮酸；(2)丙酮酸氧化酶催化丙酮酸氧化產(chǎn)生H2O2；(3)辣根過氧化物酶HRP催化顯色劑TMB氧化，使反應(yīng)液由淡黃色變成橙紅色。轉(zhuǎn)氨反應(yīng)：底物乙醛酸10 mmol/L,L-丙氨酸350 mmol/L，磷酸吡哆醛(PLP)100 μmol/L、14.4 U/mLVfTA粗酶液和0.1 mmol/L KH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH 7.0)，室溫反應(yīng)2 h后，離心取上清液進(jìn)行顯色反應(yīng)。TMB顯色反應(yīng)體系中：TPP 15 μmol/L，F(xiàn)AD 30 μmol/L，丙酮酸氧化酶1.5 U/mL，TMB 0.5 mmol/L 和0.1 mmol/L KH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH 7.0)。25 ℃反應(yīng)30 min后，加入HRP 1.5 U/mL反應(yīng)20 min，觀察顏色變化并掃描最大吸收波長。

2.3 最佳反應(yīng)溫度和pH考察

參照“2.2”項(xiàng)下方法，分別在不同反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行TMB顯色反應(yīng)，比較不同溫度下反應(yīng)液的顏色變化以及在400 nm處的吸收度差異。在最佳反應(yīng)溫度條件下，考察pH的影響。

Figure1 Colorimetric method for the assay of alanine-dependent transaminase

HRP:Horseradish peroxidase;TMB:3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine;R1and R2represent different substituent groups

2.4 丙酮酸氧化酶與辣根過氧化物酶的用量考察

在最優(yōu)反應(yīng)溫度和pH條件下，參照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色反應(yīng)。綜合考察1.5～4.5 U/mL丙酮酸氧化酶用量和1.5～4.5 U/mL辣根過氧化物酶用量對(duì)400 nm處吸收度的影響。

2.5 TMB的最佳用量?jī)?yōu)化

在已優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，參照“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行TMB顯色反應(yīng)，考察不同TMB濃度(0～1 mmol/L)對(duì)顏色反應(yīng)的影響。

2.6 底物和氨基供體濃度的優(yōu)化

在已優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，綜合考察氨基供體L-丙氨酸和底物乙醛酸的用量對(duì)顏色反應(yīng)的影響。L-丙氨酸濃度分別設(shè)置為50，100，200，350，500 mmol/L。乙醛酸的濃度分別設(shè)置為10，20，30 mmol/L。

2.7 反應(yīng)時(shí)間的選擇

在已優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，參照“2.2”項(xiàng)下方法，考察轉(zhuǎn)氨反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)的影響。反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為30，60,90，120，150，180 min。

2.8 轉(zhuǎn)氨酶用量與吸收度的線性關(guān)系

確定最佳反應(yīng)條件后，考察不同VfTA用量對(duì)基于顏色反應(yīng)的轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定方法的影響。VfTA用量分別為0.45，0.9，1.8，3.6，7.2，14.4，21.6 U/mL。另外，又將商業(yè)化轉(zhuǎn)氨酶ATA117應(yīng)用于此活性測(cè)定方法，考察該方法的通用性。ATA117用量分別為0.5，1，2，4，6，8，10 U/mL。

3 結(jié) 果

3.1 VfTA的可溶性表達(dá)

轉(zhuǎn)氨酶VfTA是一種來源于河流弧菌VibriofluvialisJS17的L-丙氨酸依賴型ω-轉(zhuǎn)氨酶，活性形式為同源二聚體，相對(duì)分子質(zhì)量為100 kD，單亞基的計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量約為50 kD。利用文獻(xiàn)報(bào)道的誘導(dǎo)表達(dá)條件[10]，實(shí)現(xiàn)了VfTA在大腸埃希菌E.coliBL21中的可溶性表達(dá)，破碎液上清液比活力約為9.8 U/(min·mg)。如圖2所示，單亞基相對(duì)分子質(zhì)量約為50 kD，且可溶性表達(dá)量占總可溶蛋白的30%以上。

Figure2 Expression level ofVfTA inE.colicells

M:Marker;Lane 1:InsolubleVfTA in cell debris;Lane 2:SolubleVfTA in cell extract

3.2 基于顏色反應(yīng)的轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定新方法

如圖3所示，添加轉(zhuǎn)氨酶VfTA的反應(yīng)液顏色由淺黃色變成橙紅色，而不添加VfTA的反應(yīng)液則一直呈現(xiàn)淺黃色。反應(yīng)液最大吸收波長為400 nm，實(shí)驗(yàn)組吸收度為0.395，而陰性對(duì)照組為0.121。由此可看出，基于顏色反應(yīng)的丙氨酸依賴型轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定方法具有可行性。

Figure3 Feasibility of the colorimetric assay method

***P<0.001vscontrol group

3.3 最佳反應(yīng)溫度

方法中涉及轉(zhuǎn)氨酶、丙酮酸脫氫酶和HRP 3種不同類型的酶，因此溫度選擇更加重要。如圖4所示，27，32或42 ℃條件下，反應(yīng)液顏色相對(duì)較淺且無明顯差異，37 ℃時(shí)橙色明顯加深。400 nm處吸收度也顯示37 ℃時(shí)數(shù)值最高，選擇37 ℃為最佳反應(yīng)溫度。

3.4 最佳反應(yīng)pH

pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響主要體現(xiàn)在對(duì)酶的活性基團(tuán)解離、活性中心構(gòu)象改變和催化殘基離子化3個(gè)方面[12]。如圖5所示，當(dāng)pH 7.5時(shí)，溶液顏色最深，其次為pH 8.5，過酸或過堿時(shí)，反應(yīng)液顏色均較淺。同樣，pH 7.5的反應(yīng)液在400 nm處的吸收度也最高。因此，選擇7.5作為最佳反應(yīng)pH。

Figure5 Effect of pH on the colorimetric detection

3.5 最佳丙酮酸氧化酶與HRP用量

活性測(cè)定方法中，丙酮酸氧化酶催化丙酮酸生成H2O2，而HRP則利用H2O2氧化TMB，從而產(chǎn)生顏色變化，因此丙酮酸氧化酶與HRP的活性需要匹配。如圖6所示，隨著丙酮酸氧化酶和HRP活力的增加，顯色產(chǎn)物在400 nm處的吸收度整體呈上升趨勢(shì)，但趨勢(shì)變化不明顯，吸收度均為0.85左右，表明兩種酶對(duì)顯色反應(yīng)影響不顯著。當(dāng)丙酮酸氧化酶與HRP用量均為3 U/mL時(shí)，吸收度相對(duì)最高。因此，丙酮酸氧化酶與HRP用量均定為3 U/mL。

3.6 最佳TMB用量

在轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定方法中，TMB氧化是反應(yīng)液顏色變化的主要原因。如圖7所示，當(dāng)TMB濃度為0時(shí)，反應(yīng)液呈現(xiàn)淡黃色；隨著TMB濃度的增加，反應(yīng)液顏色逐漸加深。當(dāng)TMB濃度為0.75 mmol/L時(shí)，400 nm處的吸收度達(dá)到最高值1.16，而繼續(xù)增加TMB濃度，顏色并無顯著變化，吸收度也不再增加，所以最終選擇0.75 mmol/L作為TMB的最佳使用濃度。

3.7 最佳底物和氨基供體濃度

對(duì)于轉(zhuǎn)氨酶而言，底物濃度越高，更有利于反應(yīng)平衡向產(chǎn)物方向移動(dòng)，但是濃度過高又有可能抑制轉(zhuǎn)氨酶活性，所以氨基受體和供體濃度的匹配同樣重要[12]。由圖8可知，當(dāng)反應(yīng)液中的L-丙氨酸濃度為200 mmol/L，底物乙醛酸濃度為20 mmol/L時(shí)，A400 nm可達(dá)到最高值1.36。隨著L-丙氨酸濃度的升高，400 nm處的吸收度則逐漸下降，這可能是由L-丙氨酸產(chǎn)生的底物抑制效應(yīng)所造成。

3.8 最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間的確定

如圖9所示，雖然吸收度整體變化不明顯，但可觀察到當(dāng)?shù)陀?0 min時(shí)，A400 nm處吸收度并未達(dá)到飽和，但高于2.5 h后，吸收值反而會(huì)降低。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，90 min對(duì)應(yīng)的吸收度大小為1.349±0.028(即1.321～1.377之間)；反應(yīng)120 min與150 min后對(duì)應(yīng)的吸收度均為1.362±0.015(即1.347～1.377之間)，從數(shù)值上可看出，最適反應(yīng)時(shí)間為2 h。

3.9 轉(zhuǎn)氨酶用量與吸收度的線性關(guān)系

如圖10-A所示，在0.9～14.4 U/mL范圍內(nèi)，VfTA活力與吸收度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.066 2x+0.384 1，r=0.998 0。如圖10-B所示VfTA用量為0.45 U/mL時(shí)，其吸收度與陰性對(duì)照(即不加酶)無差異，因此轉(zhuǎn)氨酶VfTA用量的檢測(cè)限為0.45 U/mL。

如圖11-A所示，當(dāng)使用ATA117作為轉(zhuǎn)氨酶，D-氨基酸作為氨基供體時(shí)，在2～10 U/mL范圍內(nèi)，活力數(shù)與吸收度呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.106 4x+0.112 7，r=0.979 8。如圖11-B所示，當(dāng)ATA117用量為0.5 U/mL時(shí)，400 nm處吸收度的平均值為0.132，與陰性對(duì)照組的0.123基本無差異，而添加量為1 U/mL時(shí)，吸收度為0.152，與陰性對(duì)照有一定較小的差異，綜合判定該法的ATA117用量檢測(cè)限可定為0.5 U/mL。

Figure10 Effect ofVfTA activity on the colorimetric detection

Figure11 Effect of commercial transaminase ATA117 activity on the colorimetric detection

4 討 論

轉(zhuǎn)氨酶是手性胺及其衍生物立體選擇性合成的重要生物催化劑，但現(xiàn)有的轉(zhuǎn)氨酶難以滿足日益增長的化合物合成需求，新酶的發(fā)掘至關(guān)重要。Green等[8]利用鄰苯二甲胺作為底物胺，其經(jīng)轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生成相應(yīng)的亞胺，經(jīng)一系列結(jié)構(gòu)變化最終生成黑色沉淀可判斷轉(zhuǎn)氨酶的活性，該法最大優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)便、快捷，不需其他檢測(cè)儀器輔助，當(dāng)轉(zhuǎn)化率僅為5%時(shí)仍可檢測(cè)到，但該法不能精確定量，只適用于粗篩。在Turner的工作基礎(chǔ)上，Weiβ等[17]利用乙醛酸為底物，偶聯(lián)甘氨酸氧化酶與HRP進(jìn)行顯色反應(yīng)，ω-轉(zhuǎn)氨酶活力檢測(cè)靈敏度可達(dá)50 mU/mg。Scheidt 等[18]改用熒光檢測(cè)法，通過檢測(cè)熒光體6-甲氧基-2-萘乙酮于450 nm波長處藍(lán)色熒光的發(fā)射強(qiáng)度來確定轉(zhuǎn)氨酶活性，利用此方法轉(zhuǎn)氨酶VfTA活力的檢測(cè)限最高可達(dá)0.00125 U/mL，轉(zhuǎn)氨酶ATA113和ATA117活力的檢測(cè)限最高可達(dá)0.03 U/mL。此法采用熒光檢測(cè)，靈敏度較高，但是必須采用1-(6-甲氧基-2-萘基)乙胺作為底物胺，通用性受限。

本研究以VfTA作為模式轉(zhuǎn)氨酶，偶聯(lián)丙酮酸氧化酶和辣根過氧化物酶構(gòu)建了基于顏色變化的丙氨酸依賴型轉(zhuǎn)氨酶酶活檢測(cè)和篩選方法。通過反應(yīng)條件的系統(tǒng)優(yōu)化，該方法的檢測(cè)限可達(dá)到0.45 U/mL(28 mU/mg)轉(zhuǎn)氨酶酶活力，且可根據(jù)顏色變化快速判斷活力情況，達(dá)到了丙氨酸依賴型轉(zhuǎn)氨酶的篩選要求，可減少篩選工作量，縮短新酶篩選周期。紫外分光光度法不及上述熒光檢測(cè)靈敏度高，但由于大多數(shù)ω-轉(zhuǎn)氨酶均識(shí)別丙氨酸，所以該基于顏色反應(yīng)篩選方法通用性很好，可作為轉(zhuǎn)氨酶研究和手性胺立體選擇性合成的重要工具。