五元雜環(huán)并嘧啶類MTH1抑制劑的設(shè)計、合成及生物活性評價

王 蕾，馬 俊，顧夢月，狄蓉蓉，劉 煜*，賴宜生**

(中國藥科大學 1新藥研究中心；2生命科學與技術(shù)學院，南京 210009)

MTH1(NUDT1)是MutT同源基因家族成員，具有α/β/α MutT超家族折疊結(jié)構(gòu)的特點，其主要生理功能是清除人體內(nèi)核苷酸池中受自由基氧化損傷所產(chǎn)生的8-氧代鳥嘌呤(8-oxo-dGTP)等產(chǎn)物，以防其摻入DNA復制中，從而確?；蚪M的穩(wěn)定性[1-2]。惡性腫瘤的快速增殖導致細胞內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放高濃度的自由基，造成DNA氧化損傷，從而產(chǎn)生大量的8-oxo-dGTP。為了清除這些有害的產(chǎn)物，腫瘤細胞就需要更高水平的MTH1。實際上，在肺癌、胃癌和大腸癌等多種腫瘤組織中MTH1的表達明顯上調(diào)[3-4]。因此，MTH1有望成為腫瘤治療的新靶點。

目前已報道的MTH1抑制劑主要有金屬配體類、嘧啶類、吡啶類和嘌呤類化合物[5](圖1)。其中，由瑞典Helleday小組研發(fā)的TH1579(Karonudib,結(jié)構(gòu)尚未公布)已于2017年進入Ⅰ期臨床試驗階段，用于評價腫瘤患者服用TH1579的安全性和耐受性(NCT03036228)。

Figure1 Representative MTH1 inhibitors

為了尋找新型MTH1抑制劑，本研究以TH287為基礎(chǔ)，通過分析8-oxo-dGTP的水解產(chǎn)物及TH287與MTH1蛋白結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，采用閉環(huán)、骨架躍遷和生物電子等排等藥物設(shè)計策略，結(jié)合計算機輔助藥物設(shè)計方法，設(shè)計、合成了一系列以嘌呤結(jié)構(gòu)和吡唑并嘧啶為母核的目標化合物(圖2)。體外活性測試結(jié)果表明，該類化合物顯示出良好的MTH1抑制活性，其中7個化合物的IC50小于1 μmol/L，5個化合物(I3,I4,I7-9)的活性與陽性藥TH287相當，可以作為新型MTH1抑制劑開展進一步的研究。

Figure2 Design of the target compounds

1 合成路線

化合物I1-10的合成是以6-氯鳥嘌呤與苯硼酸、相應(yīng)的胺和醇反應(yīng)得到(路線1)。化合物II1-7的合成是以2-氨基-4,6-二羥基嘧啶為原料，經(jīng)Vilsmeier-Haack反應(yīng)和氯代反應(yīng)一鍋法合成2-氨基-4,6-二氯-5-嘧啶甲醛(1)，化合物1經(jīng)環(huán)合反應(yīng)制得化合物2，化合物2與苯硼酸、相應(yīng)的胺和醇反應(yīng)得到(路線2)。目標化合物的結(jié)構(gòu)均經(jīng)MS和1H NMR確證。

Scheme1 Synthetic route of the target compoundsI1-10

Reagents and conditions:(a) 1,4-dioxane/H2O,reflux;(b) 1-butanol,reflux

Scheme2 Synthetic route of the target compoundsII1,II2-7

Reagents and conditions:(a) POCl3,DMF,reflux;(b) THF/H2O,N2H4-H2O,50 °C;(c) 1,4-dioxane/H2O,reflux;(d) 1-butanol,reflux

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

熔點采用RY-1型熔點儀測定，溫度計未經(jīng)校正；1H NMR使用ACF-300 MHz型核磁共振儀測定，TMS為內(nèi)標；MS使用Agilent 1100 Series LC/MSD Trap(SL)質(zhì)譜儀測定；IR采用尼高力iS10傅里葉變換紅外光譜儀測定。所有試劑未經(jīng)特別說明均為市售化學純或分析純產(chǎn)品。

2.2 化學合成

6-苯基-9H-嘌呤-2-胺(I1) 將6-氯鳥嘌呤(0.16 g,1 mmol)、苯硼酸(0.17 g,1.2 mmol)、碳酸鉀(0.06 g,2 mmol)和二(三苯基膦)二氯化鈀加入二氧六環(huán)和水(4∶1)的混合溶液15 mL中，氮氣保護，回流12 h，旋干溶劑，乙酸乙酯溶解，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥，柱色譜純化(EA-PE，3∶1)，得白色固體0.97 mg，收率46%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:8.06(2H,s,NH2),7.84(1H,m,NH),7.75(1H,m,CH),7.65～7.55(1H,m,ArH),7.44～7.28(4H,m,ArH);ESI-MS:m/z234.10[M+Na]+。

N6-苯基-9H-嘌呤-2,6-二胺(I2) 將6-氯鳥嘌呤(0.16 g,1 mmol)、苯胺(0.11 g,1.2 mmol)溶于正丁醇5 mL，110 ℃下封管反應(yīng)30 min，加水攪拌，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱色譜純化(EA-CH3OH，50∶1)，制得淡黃色固體0.15 g，收率67.2%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.30(1H,s,NH),9.30(1H,d,J=4.4 Hz,NH),8.03(2H,d,J=8.3 Hz,ArH),7.88～7.72(1H,m,ArH),7.26(2H,t,J=7.7 Hz,ArH),6.96(1H,d,J=9.6 Hz,CH),6.03(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z227.15[M+Na]+。

用類似的方法制備目標化合物I3-10。

N6-芐基-9H-嘌呤-2,6-二胺(I3) 淡黃色固體0.14 g，收率58.4%。mp:246 ～248 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.08(1H,s,NH),7.72(1H,m,NH),7.46(1H,m,ArH),7.33(2H,t,J=6.8 Hz,ArH),7.27(2H,d,J=7.4 Hz, ArH),7.21(1H,d,J=7.2 Hz,CH),5.69(2H,s,NH2),4.65(2H,s,CH2);ESI-MS:m/z241.15[M+Na]+。

N6-(4-甲基苯基)-9H-嘌呤-2,6-二胺(I4) 淡黃色固體0.15 g，收率61.2%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.96(1H,s,NH),8.27(1H,s,NH),7.82(2H,d,J=8.1 Hz,NH2),7.56(2H,s,ArH),7.21(2H,d,J=8.3 Hz,ArH)),5.32(1H,s,CH),2.31(3H,s,CH3);ESI-MS:m/z241.20[M+Na]+。

N6-(3-甲基苯基)-9H-嘌呤-2,6-二胺(I5) 淡黃色固體0.15 g，收率60.9%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.90(1H,s,NH),10.14(1H,s,NH),8.08(1H,s,ArH),7.82(2H,d,J=6.2 Hz,ArH),7.21(1H,dd,J=10.3,6.0 Hz,ArH),6.88(2H,d,J=7.5 Hz,NH2),6.76(1H,s,CH),2.32(3H,s,CH3);ESI-MS:m/z240.20[M+Na]+。

N6-(4-甲氧基苯基)-9H-嘌呤-2,6-二胺(I6) 淡黃色固體0.18 g，收率70.4%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.23(1H,s,NH),9.13(1H,s,NH),7.87(2H,d,J=8.8 Hz,ArH),7.77(1H,s,CH),7.02～6.74(2H,m,ArH),5.91(2H,s,NH2),3.73(3H,s,CH3)；ESI-MS:m/z257.15[M+Na]+。

N6-(3-甲氧基苯基)-9H-嘌呤-2,6-二胺(I7) 淡黃色固體0.17 g，收率66.8%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.28(1H,s,NH),9.21(1H,s,NH),7.85～7.65(2H,m,ArH),7.59(1H,d,J=8.2 Hz,CH),7.13(1H,td,J=8.1,1.7 Hz,ArH),6.56～6.44(1H,m,ArH),5.99(2H,s,NH2),3.74(3H,d,J=1.8 Hz,CH3);ESI-MS:m/z257.15[M+Na]+。

N6-(2-甲氧基苯基)-9H-嘌呤-2,6-二胺(I8) 淡黃色固體0.20 g，收率77.5%。mp:245～248 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:13.48(1H,s,NH),10.95(1H,s,NH),8.29(1H,s,ArH),7.76(2H,s,ArH),7.57(2H,s,NH2),7.27(1H,t,J=8.3 Hz,CH),6.99(1H,d,J=7.9 Hz,ArH),2.34(3H,s,CH3);ESI-MS:m/z257.15[M+Na]+。

N6-(4-氟苯基)-9H-嘌呤-2,6-二胺(I9) 淡黃色固體0.19 g，收率78.9%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.28(1H,s,NH),9.39(1H,s,NH),8.14～7.91(2H,m,ArH),7.81(1H,d,J=3.3 Hz,CH),7.18～6.95(2H,m,ArH),6.02(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z245.15[M+Na]+。

6-苯甲氧基-9H-嘌呤-2-胺(I10) 白色固體0.18 g，收率74.1%。mp:202～206 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.46(1H,s,NH),7.82(1H,d,J=4.1 Hz,CH),7.58～7.29(5H,m,ArH),6.34(2H,s,NH2),5.48(2H,d,J=4.0 Hz,CH2);ESI-MS:m/z242.15[M+Na]+。

氨基-4,6-二氯嘧啶-5-甲醛(1) 將DMF(2.4 mL,31.5 mmol)于5～10 ℃下緩慢滴加到三氯氧磷(7.5 mL,81.9 mmol)中，后加入2-氨基-4,6-二羥基嘧啶(2 g,15.74 mmol)，室溫攪拌30 min，回流24 h，冷卻至室溫，將反應(yīng)液緩慢倒入冰水100 mL中，攪拌1 h后靜置過夜，抽濾，分別用冰水和乙酸乙酯洗滌濾餅，干燥得黃色粗品，乙酸乙酯重結(jié)晶，得淡黃色固體2.45 g，收率81.3%。mp:>250 ℃(文獻值:>250 ℃[6])；IR(KBr,v):3 375.36,3 256.11,2 924.28,2 775.53,1 685.54,1 661.14 cm-1;1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.06(1H,s,CH),8.49(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z191.97[M+Na]+。

4-氯-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺(2) 將化合物1(320 mg,1.7 mmol)溶于四氫呋喃和水(3∶1)混合溶液7 mL中，升溫至50 ℃，將水合肼(170 mg,3.3 mmol)溶于水1.7 mL，緩慢滴加至反應(yīng)液中，攪拌40 min，攪拌下將反應(yīng)液倒入冰水8 mL中，靜置，抽濾，丙酮洗滌，得淡黃色固體0.23 g，收率78.4%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:13.23(1H,s,NH),7.95(1H,s,CH),7.14(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z168.05[M+Na]+。

4-苯基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺(II1) 將化合物2(0.12 g,1 mmol)、苯硼酸(0.2 g,1.2 mmol)、碳酸鉀(0.10 g,2 mmol)和二(三苯基膦)二氯化鈀加入二氧六環(huán)和水(4∶1)的混合溶液15 mL中，氮氣保護，回流12 h，旋干溶劑，乙酸乙酯溶解，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥，柱色譜純化(EA-PE，3∶1)，得白色固體0.10 g。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:11.94(1H,s,NH),9.85(1H,s,CH),7.74～7.38(5H,m,ArH),6.13(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z212.15[M+Na]+。

N4-苯基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(II2) 將化合物2(0.12 g,1 mmol)、苯胺(0.22 g,1.2 mmol)溶于正丁醇5 mL，110 ℃下封管反應(yīng)30 min，加水攪拌，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱色譜純化(EA-CH3OH，50∶1)，得黃色固體0.18 g，收率78.5%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.60(1H,s,NH),9.47(1H,s,NH),7.98(1H,s,CH),7.93(2H,d,J=8.3 Hz,ArH),7.39～7.11(2H,m,ArH),7.03(1H,t,J=7.3 Hz,ArH),6.27(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z227.15[M+Na]+。

用類似的方法制備目標化合物II3-7。

N4-(4-甲基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(II3) 黃色固體0.17 g，收率72.5%。mp:243～245 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.57(1H,s,NH),9.39(1H,s,NH),7.92(1H,s,CH),7.76(2H,d,J=8.0 Hz,ArH),7.12(2H,d,J=8.0 Hz,ArH),6.23(2H,s,NH2),2.27(3H,s,CH3);ESI-MS:m/z242.15[M+Na]+。

N4-(3-甲基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(II4) 黃色固體0.18 g，收率74.9%。mp:>250 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:11.21(1H,s,NH),9.21(1H,s,NH),7.88(1H,s,CH),7.64(1H,d,J=58.9 Hz,ArH),7.12(3H,d,J=84.3 Hz,ArH),5.20(2H,s,NH2),2.41～2.22(3H,m,CH3);ESI-MS:m/z241.15[M+Na]+。

N4-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(II5) 黃色固體0.19 g，收率72.5%。mp:237～239 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.67(1H,s,NH),9.43(1H,s,NH),7.99(1H,s,CH),7.61(1H,s,ArH),7.60～7.22(1H,m,ArH),7.21～7.18(1H,m,ArH),6.62～6.61(1H,m,ArH),6.59～6.27(2H,s,NH2),3.78(3H,s,CH3);ESI-MS:m/z257.15[M+Na]+。

N4-(4-氟基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(II6) 黃色固體0.19 g，收率78.2%。mp:236～239 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:12.59(1H,s,NH),9.53(1H,s,NH),7.99(1H,d,J=4.1 Hz,CH),7.93～7.90(1H,m,ArH),7.89(1H,s,ArH),7.13(2H,dd,J=10.3,7.1Hz,ArH),6.28(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z257.15[M+Na]+。

4-苯甲氧基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺(II7) 白色固體0.18 g，收率73.1%。mp:201～204 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:13.05～12.61(1H,m,NH),7.86～7.74(1H,m,CH),7.44(5H,d,J=35.0 Hz,ArH),6.61(2H,s,NH2),5.48(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z147.00[M+Na]+。

2.3 MTH1酶活性測試

采用孔雀石綠顯色反應(yīng)對目標化合物的MTH1抑制活性進行評價[7]。向100 mmol/L Tris-醋酸、40 mmol/L氯化鈉、10 mmol/L醋酸鎂和1 mmol/L DTT配制的反應(yīng)液中加入MTH1蛋白樣品、無機焦磷酸酶(PPase)和反應(yīng)底物dGTP，25 ℃反應(yīng)30 min；后加入孔雀石綠、鉬酸銨及吐溫20顯色45 min，酶標儀測定630 nm處吸收度。根據(jù)吸收值確定MTH1活性濃度，IC50和曲線擬合由Prism(GraphPad Software)實現(xiàn)。實驗結(jié)果如表1所示。

Table1 MTH1 inhibitory activities of the target compounds

Compd.RIC50/(μmol/L)I1Ph-9.58I2PhNH-0.119I3PhCH2NH-0.090I4p-CH3-PhNH-0.014I5m-CH3-PhNH-0.17I6p-CH3-O-PhNH-7.36I7m-CH3-O-PhNH-0.029I8o-CH3-OPhNH-0.082I9p-F-PhNH-0.062I10PhCH2O-16.52II1Ph-30.13II2PhNH-17.83II3p-CH3-PhNH-15.67II4m-CH3-PhNH-13.72II5m-CH3-O-PhNH-12.36II6p-F-PhNH-8.60II7PhCH2O-28.17TH2870.012

3 結(jié)果與討論

本研究設(shè)計并合成了17個嘌呤和吡唑并嘧啶類化合物，并探究了這些化合物作為MTH1抑制劑的活性。體外活性評價結(jié)果表明，大部分化合物對MTH1具有良好的抑制作用。初步的構(gòu)效分析表明，從母核的結(jié)構(gòu)來看，I類化合物的活性均強于II類化合物(I1vsII1，I2vsII2，I4vsII3，I5vsII4，I7vsII5，I9vsII6，I10vsII7)，說明以嘌呤為母核的活性明顯優(yōu)于吡唑并嘧啶。當苯環(huán)與母核直接相連接時，其活性低于苯環(huán)通過-NH-與母核相連接(I1vsI2，II1vsII2)，但高于苯環(huán)通過-O-與母核相連接(I10vsI3)；當將苯環(huán)與母環(huán)之間的連接鏈由-NH-延長至-CH2NH-時活性有所提高(I2vsI3)。同時，還探討了苯環(huán)上不同取代基對于活性的影響。在嘌呤類化合物中，當R處于對位時甲基(I4)和氟(I9)都具有很強活性，而甲氧基(I6)的活性較弱，但是當甲氧基位于間位時，活性則會明顯提升(I6vsI7vsI8)，而甲基位于間位時活性反而降低(I4vsI5)。另外，吡唑并嘧啶類化合物的R取代基對于活性的影響微乎其微。

為了進一步說明化合物的構(gòu)效關(guān)系，使用分子對接方法研究了化合物I4與靶蛋白MTH1活性位點中的結(jié)合模式(圖3)。

Figure3 Proposed binding mode of compoundI4

從圖3中可見，嘌呤母環(huán)可以與Phe72形成π-π堆積，并且3位N和9位NH分別與關(guān)鍵氨基酸Asp119形成氫鍵，2位NH2則分別與Asp120和Asn33形成氫鍵，而且1位N也能與Asn33形成氫鍵。除此之外，6位上的苯環(huán)伸入到蛋白口袋旁邊的疏水區(qū)內(nèi)，并且與Tyr 7形成π-π堆積，這可能是化合物I4具有較強活性的主要原因。這些信息為后續(xù)結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了理論基礎(chǔ)。