青海審定小麥品種抗葉銹病基因的分子鑒定

劉 韜，吳麗軍，甘曉龍，張 波，劉寶龍，陳文杰，張連全，劉登才，張懷剛,4

(1.中國科學院 西北高原生物研究所，西寧 810008； 2.四川農(nóng)業(yè)大學 小麥研究所，成都 611130；3.中國科學院大學，北京 100049；4.青海省作物分子育種重點實驗室，西寧 810008)

小麥葉銹病(Wheat leaf rust)作為小麥的三大銹病之一，是由小麥葉銹菌(Pucciniatirticina)引起的真菌病害，影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，對小麥生產(chǎn)具有極大威脅，嚴重爆發(fā)時減產(chǎn)50%[1-4]。研究培育小麥葉銹病抗病品種是小麥生產(chǎn)上最為經(jīng)濟和安全有效的方法。全面了解目前生產(chǎn)小麥品種的抗葉銹性及其所含有的抗葉銹基因、發(fā)掘新的葉銹病抗源已經(jīng)成為有效控制小麥葉銹病害的一個重要環(huán)節(jié)。

至今，國際上已發(fā)現(xiàn)抗小麥葉銹病基因超過100個，其中正式命名的有72個[5]。大部分已分子作圖并獲得緊密連鎖或共分離的分子標記。Temam等[6]利用RILs定位14個小麥抗葉銹基因 Lr1、Lr9、Lr10、Lr19、Lr20、Lr24、Lr27、Lr31、Lr32、Lr34、Lr35、Lr40、Lr46、Lr47，其中， Lr34、Lr35和 Lr46為成株抗性位點。Baszczyk等[7]對 Lr9、Lr19、Lr20、Lr21、Lr24、Lr25、Lr26、Lr28、Lr29和 Lr37的分子標記在小麥抗葉銹病育種中進行有效驗證，發(fā)現(xiàn)除 Lr21和 Lr25的分子標記以外都具有高度特異性；Vida等[8]對 Lr9、Lr24、Lr25、Lr29、Lr35和 Lr37的分子標記進行鑒定，認為這些分子標記可以有效地檢測到未知背景的小麥品種所含有的抗葉銹病基因。 Lr9來源于小傘山羊草，對中國葉銹病優(yōu)勢小種表現(xiàn)極高的抗性，在生產(chǎn)上有很大利用價值[9]。

近年來，隨著全球氣候變化，青海也變得濕潤多雨，成為小麥銹病的繁育地。而葉銹菌孢子對環(huán)境的適應能力強于條銹菌和稈銹菌孢子，既耐低溫也耐高溫。因此，葉銹病入侵青海并爆發(fā)將成為可能。2017年6月，中科院西北高原生物研究所張懷剛課題組在青海西寧周邊考察時發(fā)現(xiàn)，西寧大通縣長寧鎮(zhèn)(N36°49′，E101°45′)種植的部分小麥感染葉銹病(圖1)，不過未大規(guī)模爆發(fā)。所以了解青海當?shù)貙彾ㄐ←溒贩N抗葉銹基因的分布狀況，通過基因聚合培育抗葉銹病品種非常迫切。

圖1 發(fā)現(xiàn)于青海西寧的葉銹病感病株葉片F(xiàn)ig.1 Wheat leaf rust detected in Xining,Qinghai province

本研究利用與6個抗葉銹基因緊密連鎖的分子標記，對青海省審定的66個小麥品種進行抗葉銹基因檢測，調(diào)查青海省當?shù)仄胀ㄐ←溒贩N葉銹病抗性基因的分布情況，以期為小麥葉銹病抗病育種提供材料和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

青海省審定的小麥品種66份(表1)。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 采集小麥新鮮葉片，在液氮中冷凍研磨后，用CTAB法[10]提取基因組DNA，用微量紫外檢測儀NANODROP2000C(Thermo)測量DNA質(zhì)量濃度。將DNA均稀釋到200 mg/L，用10 g/L的瓊脂糖膠在110 V電壓下電泳30 min，檢測DNA的質(zhì)量。

1.2.2 特異性引物的選擇 小麥抗葉銹病基因 Lr1[11]、 Lr9[12]、 Lr24[13]、 Lr29[14]、 Lr34[15]、 Lr42[16]是目前發(fā)現(xiàn)的能夠有效抵抗小麥葉銹病的抗性基因。上述基因已經(jīng)被分別定位到小麥染色體上： Lr1 定位到5DL[17]， Lr9 定位到6BL[17]， Lr24 定位到3DL[17]， Lr29 定位到7DS[17]， Lr34 定位到7DS[17]， Lr42 定位到1D[16]。根據(jù)查閱相關(guān)NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)、GrainGenes2.0(https://wheat.pw.usda.gov)、參考文獻得到與抗性基因相應的引物序列22對，通過試驗對比，選取穩(wěn)定性比較高的6對引物(表2)進行相應的抗性基因擴增，各引物目的片段大小見表2。引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增以及電泳檢測 用6對引物對66份小麥品種的基因組進行PCR擴增分析。PCR擴增體系(20 μL)為：10×Taqbuffer(200 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2) 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，2.5 U/μLTaqDNA polymerase 0.4 μL，各引物正反序列均為5 pmol，DNA 200 ng。PCR程序為：95 ℃變性4 min，然后35個循環(huán)95 ℃變性30 s，55 ℃～68 ℃復性(各引物根據(jù)試驗前期摸索的最適退火溫度確定)30 s，72 ℃延伸30 s～1 min(根據(jù)目的片段大小確定)，最后72 ℃延伸10 min。不同的PCR產(chǎn)物根據(jù)各基因目的條帶大小，制作各自的瓊脂糖分離膠或PAGE膠；然后瓊脂糖膠在TAE緩沖液中，110 V電壓下，電泳30 min；取出后在凝膠成像儀中拍照保存。而PAGE膠在TBE緩沖液中，160 V電壓下，電泳2 h，將膠在置于含EB的TBE溶液(10 μL∶100 mL)中浸泡10 min，取出后在凝膠成像儀中拍照保存。

表1 66份青海省審定小麥品種Table 1 66 wheat cultivars released in Qinghai province

表2 微衛(wèi)星引物Table 2 SSR markers

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物的篩選及最適退火溫度的確定

由于參考文獻和數(shù)據(jù)庫中給出的引物有多對，最終篩選到最適合的6對引物和其最適退火溫度(表2)： Lr1的引物WR003，63 ℃； Lr9的引物J13，68 ℃； Lr24的引物S1302-609，55 ℃； Lr29的引物OPY10，60 ℃； Lr34的引物CSLV34，55 ℃； Lr42的引物Wmc432，55 ℃。

2.2 各抗性基因在普通小麥中的分布

分別用確定的6對引物及最適退火溫度對66份青海審定小麥品種分別進行PCR擴增檢測，部分電泳圖如圖2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表3)，在66份小麥品種中，有16份含有 Lr1，占24.24%；有18份含有 Lr24，占27.27%；有31份含有 Lr29，占46.97%；有5份含有 Lr34，占7.58%；有23份含有 Lr42，占34.85%。

在66份青海青海審定小麥品種中均未檢測出 Lr9抗性基因(表3)。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在檢測的小麥品種中同時含有2個抗性基因的品種有17份(表3)，占25.76%；同時含有3個或3個以上的品種有9份，占13.64%(表3)。綜上可以看出，同時含有多個抗葉銹病基因的品種很少，每個品種的抗葉銹病基因過于單一。

M1.1 kb plus DNA ladder；M2.50 bp DNA ladder；1-18.部分檢測樣品 Some detected samples

表3 66份青海審定小麥品種抗葉銹基因檢測結(jié)果統(tǒng)計Table 3 Molecular detection results of leaf rust resistance genes in 66 wheat cultivars released in Qinghai province

(續(xù)表3 Continued table 3)

3 討 論

在中國，葉銹病發(fā)病地主要為長江流域，多為西南和華東地區(qū)。但近年來，隨著全球氣候變暖，青海也變得濕潤多雨，逐年成為小麥銹病的繁育地。葉銹病對環(huán)境的適應能力強于條銹病和稈銹病，既耐低溫也耐高溫。因此，葉銹病入侵青海并突然爆發(fā)將成為可能。2017年7月對西寧周邊區(qū)縣進行調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，在西寧大通縣長寧鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)小麥葉銹病感病株(圖1)。雖后期未見該病在西寧周邊爆發(fā)，但這一現(xiàn)象足以說明青海部分地區(qū)已逐漸滿足小麥葉銹病的發(fā)病條件。本研究以66份青海省審定的小麥品種為試驗材料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有10份材料不含有以上6種任何一種抗性基因，32份供試材料只含有其中1種抗性基因，研究結(jié)果表明：對青海省春小麥主栽品種‘阿勃’和‘高原448’[18]而言，‘高原448’不含以上6個抗葉銹病基因的任何一個，而‘阿勃’也只含有1個(表5)。這是一個危險信號，一旦小麥葉銹病孢子的某小種適應青海氣候環(huán)境，極有可能引起葉銹病在青海爆發(fā)，導致小麥減產(chǎn)和品質(zhì)下降。本研究也有不足之處，結(jié)論有可能不準確，因為目前抗葉銹病的基因還未完全發(fā)現(xiàn)，這些小麥品種中可能存在未曾檢測到的其他抗葉銹病基因。

本研究的另一結(jié)果表明，供試材料中含有的抗性基因極其單一，42份不含有或只含有1個抗性基因，占供試材料的63.64%。因此，引進、發(fā)掘和合理利用優(yōu)良種質(zhì)資源，使一個品種同時聚合多個抗性基因，提高小麥抗性基因的多樣化，是防治小麥葉銹病的有效措施。

本研究明確了青海審定66份小麥品種的抗葉銹性及其抗葉銹基因的單一性等問題，為小麥種質(zhì)的抗葉銹性評價提供基礎(chǔ)信息；同時，也為青海省的小麥抗病育種提供依據(jù)和材料。