色譜分析中的串聯(lián)技術(shù)

劉育堅, 杜甫佑, 劉智敏, 司小喜, 許志剛*

(1. 昆明理工大學理學院, 云南 昆明 650500; 2. 桂林理工大學化學與生物工程學院, 電磁化學功能物質(zhì)廣西重點實驗室, 廣西 桂林 541004; 3. 云南中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心, 云南 昆明 650231)

色譜法本身是一個高效的分離過程,目前只有與檢測器串聯(lián)才能實現(xiàn)目標組分的分離檢測。色譜柱是色譜分離的“心臟”,組分能否分開,關(guān)鍵在于色譜柱,其次在于色譜條件的選擇。色譜分析中常使用一根色譜柱,然而單根色譜柱的柱效是有限的,面對極為相似的復(fù)雜組分,單一色譜柱往往不能滿足分離要求。采用分離性能不同甚至互補的兩根或多根色譜柱串聯(lián),可以大大提高分離效果。因此,柱串聯(lián)技術(shù)是一種分離技術(shù)升級,不是簡單的兩根色譜柱隨機組合。而多維色譜技術(shù)則進一步改進了單一色譜溶劑系統(tǒng)難以同時分析組分極性相差甚遠成分的難題。另外,檢測器的串聯(lián)也可以方便地實現(xiàn)不同種類、具有不同響應(yīng)信號分析物的同時檢測。

本文綜合報道了自2010年色譜串聯(lián)技術(shù)的研究進展,并且在相關(guān)研究[1-3]的基礎(chǔ)上聚焦色譜分離中的串聯(lián)技術(shù),包括柱串聯(lián)技術(shù)、檢測器串聯(lián)技術(shù)和多維色譜,為廣大分離分析工作者提供新的技術(shù)選擇,最后指出色譜串聯(lián)技術(shù)發(fā)展中遇到的困難以及未來的發(fā)展趨勢。

1 柱串聯(lián)分離技術(shù)

1.1 液相色譜中的柱串聯(lián)技術(shù)

液相色譜固定相種類繁多,已有適用于正相色譜的極性柱、適用于反相色譜的非極性柱、適用于水相的親水作用色譜柱、適用于高鹽溶液的離子色譜柱、適用于手性分離的手性柱等。液相色譜柱的串聯(lián)需要考慮流動相與色譜柱的兼容性以及串聯(lián)柱之間分離性能的互補性。

反相液相色譜柱與親水相互作用色譜柱的串聯(lián)易于實現(xiàn),可用于分析極性和非極性化合物。極性化合物與普通反相色譜柱的固定相結(jié)合較弱,通常出現(xiàn)保留時間不穩(wěn)定的情況,而在親水作用色譜柱上可以實現(xiàn)極性化合物的保留,但分離效果較弱,將反相液相色譜柱與親水作用色譜柱進行串聯(lián),可實現(xiàn)分離效果互補。朱麗波等[4]將C18色譜柱與親水作用色譜柱進行串聯(lián),應(yīng)用超高效液相色譜-質(zhì)譜法同時分離測定了丙烯酰胺、己內(nèi)酰胺、聯(lián)苯胺和苯胺。Granafei等[5]建立了親水作用色譜柱串聯(lián)反相色譜柱的方法,分離了大豆中的磷脂混合物。Falasca等[6]采用C18色譜柱與親水作用色譜柱分離從樹鼩腦提取物中分離了多種疏水性較大差異的季銨化合物,包括乙酰膽堿,膽堿,肉毒堿,乙酰肉堿和其他7種低極性?；鈮A。反相液相柱串聯(lián)親水作用色譜柱,有利于混合物樣品中極性與非極性物質(zhì)的分離,成功應(yīng)用于葡萄酒中的酚類[7]、小鼠血清代謝物[8]、藥物[9]及啤酒[10]等樣品的分析。

對于復(fù)雜體系中的多類別結(jié)構(gòu)類似化合物的分離,雙柱有時難以滿足分析的需求,需要多柱串聯(lián),以提高色譜分離的容量以及分辨率,以獲得更大的分離度。對于填充色譜柱,增加色譜柱長度或降低固定相的粒徑可以提高色譜的分辨率,但也導(dǎo)致色譜柱柱壓會成比例增加。Shaaban等[11]基于3根填充亞2 μm顆粒的色譜柱串聯(lián),同時為了降低色譜柱的柱壓,高效分離13種非甾體抗炎藥和11種磺胺類藥物,在80 ℃的柱溫下進行分離。整體式色譜柱則具有相對較低的色譜柱柱壓以及良好的性能,可用于連接多根色譜柱。Dear等[12]使用6根烷基鍵合的二氧化硅整體柱,理論塔板數(shù)達到40 000,對動物體內(nèi)的尿液及膽汁體液中尿嘧啶、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丁酯和蒽等藥物代謝物進行分離鑒定。在分析大體積的生物流體時,整體柱也表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性,Sandron等[13]將11根整體C18柱串聯(lián),獲得了理論塔板數(shù)高達110 000的高容量色譜柱,分析了海洋溶解有機物中的半極性和非極性組分,證明了主要組分為富含羧基的脂環(huán)族分子。

手性對映體的分離通常需要使用特殊的手性色譜柱,直接使用C18柱無法拆分對映體,而手性柱分離不同物質(zhì)的能力較弱。將C18柱與手性色譜柱進行串聯(lián),結(jié)合C18柱的分離能力以及手性色譜柱的對映體拆分能力,可實現(xiàn)甲狀腺素及其結(jié)構(gòu)類似物三碘甲狀腺氨酸對映體的同時拆分[14]。Iwasaki小組[15,16]建立了常規(guī)硅膠柱和手性柱串聯(lián)分析單酸二?；视?種異構(gòu)體以及單酰甘油3種對映異構(gòu)體的拆分方法。Perera等[17]將C18柱分別與3種手性柱串聯(lián),對16種手性藥物進行了拆分,在使用極性有機溶劑-水作為流動相時依舊獲得了較高的手性分離的能力。本課題組[18]也用C18柱與手性冠醚柱串聯(lián),在反相色譜條件下拆分了3種手性芳香族氨基酸的6種對映體(見圖1),結(jié)果表明:手性柱和流動相的選擇是影響串聯(lián)分離的重要因素,而雙柱的串聯(lián)次序?qū)Ψ蛛x基本沒有影響,C18柱強化了不同種類氨基酸之間的分離度,也為手性柱進一步對對映體的分離提供了足夠的空間距離,兩者的串聯(lián)實現(xiàn)了分離功能的互補。

圖 1 C18柱串聯(lián)冠醚手性柱拆分3種氨基酸外消旋體[18]Fig. 1 Separation of three amino acid enantiomers by C18 column tandem crown ether chiral column[18]

1.2 氣相色譜中的柱串聯(lián)技術(shù)

串聯(lián)氣相色譜作為傳統(tǒng)一維氣相色譜的補充,具有改裝簡單、易于操作和維護的優(yōu)點,并克服了分辨率不足、峰容量不夠高的缺點。為了減少分析時間,通過調(diào)節(jié)壓力改變流速是氣相色譜分離中的關(guān)鍵技術(shù)之一。Sacks小組[19]在解決氣相色譜串聯(lián)柱選擇性方面做了大量工作:一方面通過改變串聯(lián)柱連接點處的載氣壓力,影響組分在兩根色譜柱上的保留時間,連接點處的載氣壓力通過計算機進行控制,另一方面采用在兩根色譜柱的結(jié)合點上施加相對短的壓力脈沖,降低組分共洗脫的風險,提高分離的選擇性[20,21];相比于第一種方法,后者不會影響物質(zhì)洗脫順序以及分辨率,同時消除了樣品損失和進樣口污染的風險。該技術(shù)進一步應(yīng)用于農(nóng)藥混合物[22]、檸檬油[23]、揮發(fā)性化合物[24-26]、橙油[27]的分離。另外,該小組[28]還改進了脈沖加熱的方法,通過快速加熱和快速冷卻第二根色譜柱柱溫來改善分離度,應(yīng)用于大氣中13種物質(zhì)的分離。Wittrig等[29]通過調(diào)節(jié)雙柱結(jié)合處的壓力調(diào)節(jié)氣相色譜的分離,在12 min內(nèi)實現(xiàn)36個有機揮發(fā)性化合物的分離。Lv等[30]采用大氣壓氣相色譜電離源串聯(lián)質(zhì)譜分析食品中的溴化阻燃劑,將一小段毛細管色譜柱連接到分析柱的末端,用于改善高沸點化合物的色譜行為。Ma等[31]將極性和非極性的色譜柱串聯(lián),用于分析冰酒中的香氣化合物。Veschetti等[32,33]建立了等溫下壓力可調(diào)節(jié)的毛細管串聯(lián)柱分離的理論模型,并且使用新的毛細管連接進行對照實驗。而Jespers等[34]進一步將雙柱串聯(lián)技術(shù)應(yīng)用于氣相色譜的中進行程序升溫,得到了程序升溫氣相色譜的動力學圖。Guéguen等[35]采用雙柱氣相色譜-電子捕獲檢測器提高選擇性,應(yīng)用于樹皮及空氣樣品中多氯聯(lián)苯的分析。

1.3 超臨界流體色譜中的柱串聯(lián)技術(shù)

超臨界流體色譜是一種廣泛應(yīng)用于食品和藥物分析的分離技術(shù),其流動相主要為超臨界CO2和少量有機溶劑,色譜柱及其串聯(lián)技術(shù)和液相色譜的極為類似。Di等[36]使用兩根色譜柱測定血漿樣品中依澤替米貝的藥代動力學特性,West等[37]將C18柱和親水作用色譜柱串聯(lián)分析了25種合成藥物中的雜質(zhì),柱串聯(lián)顯示了更高的分離能力和更好的選擇性。超臨界流體色譜柱串聯(lián)在手性分析方面也有重要的應(yīng)用,Barnhart等[38]使用兩根不同種類的手性柱串聯(lián)分析了含有4個對映異構(gòu)體的手性藥物,Lesellier等[39]將一根手性填充柱與不同數(shù)量的填充柱串聯(lián),用于順式/反式-β-胡蘿卜素的分離,結(jié)果表明一根手性色譜柱與5根整體柱串聯(lián)時獲得了最佳的分離效果。

此外,也有串聯(lián)柱的快速篩選方法方面的研究。Welch等[40]使用兩個不同軟件控制兩個六位高壓閥,每個閥控制5根不同色譜柱,對商業(yè)化的超臨界流體儀進行改進,能夠從10根不同的色譜柱中篩選25種不同的串聯(lián)方式,用于復(fù)雜組分的分離。Wang等[41]十分關(guān)注超臨界流體色譜分離中的柱壓,深入研究了柱壓和串聯(lián)柱順序?qū)Ψ蛛x的影響,并通過調(diào)節(jié)色譜柱的柱壓,控制串聯(lián)色譜柱手性分離的選擇性。

2 檢測器串聯(lián)技術(shù)

檢測器是色譜分析系統(tǒng)的核心部件之一,常見的有紫外吸收檢測器、熒光檢測器、蒸發(fā)光檢測器、電化學檢測器、氫火焰離子化檢測器、質(zhì)譜檢測器等。這些檢測器在常規(guī)分析中有足夠的靈敏度、選擇性和可靠性。然而,對于復(fù)雜的生物、醫(yī)學、環(huán)境、食品樣品,單個檢測技術(shù)有時無法響應(yīng)所有分析物,比如光電二極管陣列檢測器在液相色譜中廣泛使用,但對于紫外吸收較弱的化合物,如環(huán)糊精、多糖等,則需要采用蒸發(fā)光閃射檢測器;采用硫化學發(fā)光檢測器只能得到硫化物的相關(guān)信息。因此,使用基于不同原理的兩種或多種檢測器的串聯(lián),通過一次進樣分析,即可同時檢測樣品中性質(zhì)差異較大或具有不同相應(yīng)信號的混合物,極大提高工作效率。表1中詳細介紹了色譜分析中不同檢測器的串聯(lián)技術(shù)用于復(fù)雜樣品的分析。此外,色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)已十分成熟,如LC-MS、GC-MS、LC-MS/MS等,在此不再贅述。檢測器的串聯(lián)技術(shù),為復(fù)雜樣品的分析提供了一種新的途徑,可以更高效的獲得更多的樣品信息,這項技術(shù)的關(guān)鍵在于檢測器的串聯(lián)接口以及不同檢測器對流動相的兼容,這也一定程度上增加了儀器的成本。

表 1 檢測器串聯(lián)分析不同樣品

DDT: dichlorodiphenyltrichloroethane; DAD: diode array detector; RI: refractive index; UHPLC: ultra high performance liquid chromatography; ELSD: evaporative light scattering detector; ECD: electron capture detector; NPD: nitrogen phosphorus detector; FPD: flame photometric detector; PID: photoionization detector.

3 多維色譜

多維色譜不僅僅使用多根色譜柱及多個檢測器,色譜柱之間通過切換閥或壓力平衡裝置作為接口。多維色譜技術(shù)包括二維色譜、三維色譜、高維色譜。分離的維度以正交為依據(jù),串聯(lián)是實現(xiàn)多維分離的一種重要技術(shù)。對于天然產(chǎn)物、中藥藥物和蛋白質(zhì)組分的分離,需要具有更大峰容量和更高分辨率的多維色譜技術(shù)來完成。

二維色譜的方法和技術(shù)較為成熟。傳統(tǒng)二維氣相色譜采用中心切割法,通常只能對部分組分進行分離,無法對全部組分進行準確的定性和定量。新的處理方法采用連續(xù)多次的中心切割方法,將一維分得的大部分色譜峰轉(zhuǎn)移到第二維色譜柱繼續(xù)分離而無需分餾。Lipok等[58]采用2D-GC與離子遷移譜和質(zhì)譜相結(jié)合,用于金盞菊和銀杏葉樣品中化合物的分離,該2D-GC則需要較長的調(diào)制時間(20 s)和較長的第二維毛細管(7 m)。全二維氣相色譜在兩支色譜柱之間裝有一個接口,起捕集、聚集、再傳送的作用,它是全二維氣相色譜中最重要的部件,被稱為調(diào)制器。經(jīng)第一根色譜柱分離后的每一個色譜峰,均經(jīng)調(diào)制器調(diào)制后再以脈沖方式傳送到第二根色譜柱進一步分離,全二維氣相色譜具有選擇性好和峰容量高等優(yōu)點。全二維氣相色譜可應(yīng)用于奶油中脂肪酸[59]、石油中飽和烴組分[60]、植物油中微量脂肪酸烷基酯和甾醇[61]、土壤中多環(huán)芳烴[62,63]等樣品和組分的分析。Chow等[64]對第二維分離進行程序控溫,色譜柱在柱溫箱內(nèi)通過強制對流冷卻,可有效改善分離效果。

二維液相色譜也可分為中心切割模式和全二維液相色譜。二維液相色譜與液相色譜柱串聯(lián)具有相似之處,即可根據(jù)分析樣品選擇不同的色譜分離模式搭建二維液相色譜系統(tǒng),如:反相色譜與強陽離子交換色譜相結(jié)合,用于肽段的分離[65];全自動停留系統(tǒng)的尺寸排阻色譜與反相色譜的聯(lián)用,用于花生肽的分析[66];親水相互作用色譜和反相色譜相結(jié)合,在全二維液相色譜模式下分析甘草成分[67];反相色譜與手性色譜相結(jié)合,將超快速手性色譜應(yīng)用于第二維色譜分析中,提高手性分離效率[68]等。此外,Apel等[69]先使用正相色譜在近臨界條件下通過流動相梯度法分離封端不同和支化度不同的聚合物,第二維采用尺寸排阻色譜獲得分析物的分子量分布。為了降低全二維色譜分離蛋白質(zhì)的時間,張祥民課題組[70]將“多維”與“陣列”技術(shù)相結(jié)合,即第一維采用陰離子交換色譜,第二維采用8根反相液相色譜柱和8根蛋白捕集柱,開展了多循環(huán)并行分離血漿中高豐度蛋白。第一維和第二維系統(tǒng)溶劑不兼容會影響二維液相的分辨率和靈敏度,Stoll等[71]采用新型閥技術(shù)解決第一維和第二維系統(tǒng)流動相兼容問題,且無需要額外的泵控制、操作方便。

不同類型的色譜分離技術(shù)亦能串聯(lián),已有液相色譜與氣相色譜串聯(lián)分別用于小鼠體內(nèi)礦物油飽和烴[72]、橄欖油中三甲基甲硅烷基-4,4′-去甲基甾醇[73]、食用油中的甾醇[74]、化妝品中飽和烴和礦物油中芳烴的測定[75]等相關(guān)報道,也有液相色譜串聯(lián)超臨界流體色譜用于芳香油組分的研究[76]和木質(zhì)素中的酚類物質(zhì)的測定[77]。

面對極性差異巨大、組分含量懸殊的復(fù)雜樣品,十分有必要構(gòu)建更高維的色譜系統(tǒng)。在強陽離子交換色譜與反相色譜前增加一維色譜用于在線除鹽,使得三維色譜系統(tǒng)可獲得更準確的蛋白質(zhì)識別[78]; Anderson等[79]則在第一維分離中使用凝膠柱,初步分離蛋白質(zhì)組分,后續(xù)進一步對點狀念珠藻的蛋白質(zhì)組進行鑒定;Zhang等[80]將弱陰離子交換和弱陽離子交換材料填充的混合床離子交換柱用于復(fù)雜樣品的第一維分離,進一步鑒定來自小鼠乳房腫瘤細胞裂解物中的肽。尺寸排阻色譜對蛋白質(zhì)組學樣品中分子量范圍分布廣泛的化合物表現(xiàn)出良好的分離性能,能將不同大小的蛋白分離至各組分中。Moore等[81]采用尺寸排阻色譜-反相色譜-毛細管區(qū)帶電泳分析了雞卵清蛋白肽。Al-Daghri等[82]第一步使用高效尺寸排阻色譜分離蛋白質(zhì)組分,反相色譜收集水解后的混合肽餾分,最后在反相納米噴霧FT-MS對餾分進行全血清蛋白質(zhì)組學分析。而Spicer等[83]將3D RPLC-MS系統(tǒng)用于蛋白質(zhì)和肽段的分離,相較于低維的色譜系統(tǒng),高維系統(tǒng)具有更高的分辨率。Song等[84]構(gòu)建親水相互作用色譜-湍流色譜-反相液相(HILIC-TFC-RPLC)色譜平臺,TFC收集HILIC分離的非極性化合物并轉(zhuǎn)移至下一維進行分離,進一步將復(fù)雜基質(zhì)中親水和疏水物質(zhì)進行分離。Wang等[85]采用停流界面來實現(xiàn)在線3D-LC系統(tǒng),酰胺柱作為第一維柱,將弱極性代謝物和極性代謝物被分離成不同的組分,氟苯基柱和C18柱分別作為第二維和第三維分離柱,用于分析大豆提取物中的黃酮化合物。Gst?ttner等[86]將商用的2D-LC改造成4D-LC,第一維分離中使用陽離子交換柱,第二維使用反相色譜柱收集第一維的組分,第三維則對上一維組分進行胰蛋白酶消化,最后一維獲得肽的色譜圖。

此外,也有氣相色譜、液相色譜和超臨界流體色譜之間的多維色譜構(gòu)建。Edam等[87]在全二維氣相色譜前增加一維液相色譜,構(gòu)建三維系統(tǒng)(LC-GC×GC), LC系統(tǒng)可以分離飽和和不飽和烷烴組分,避免GC×GC出現(xiàn)峰重疊。將SFC替代LC與GC×GC連接可輕松地除去超臨界CO2而不會損失揮發(fā)性樣品組分,從而消除了共洗脫溶劑的引入以及稀釋效應(yīng)。搭建SCF-GC×GC可用于復(fù)雜樣品中烴類化合物的分析[88,89]。Synovec小組則采用兩個六端口隔膜閥作為接口串聯(lián)三維氣相色譜(GC×GC×GC),結(jié)合化學計量學中的平行因子對全三維氣相色譜的分離進行方法評估[90];該小組進一步將飛行時間質(zhì)譜引入到全三維氣相色譜中,增加高溫隔膜閥,有助于提高操作溫度、減少樣品裂解及有利于譜峰識別[91]。Yan等[92]設(shè)計了一種自動化的三維氣相色譜分析裝置,該裝置結(jié)合了1DGC、MDGC(GC-GC)和GC×GC,開發(fā)植物天然提取物的三維色譜(GC-GC×GC)分析方法。Mitrevski等[93]將生物燃料油中的含氧化合物通過GC×GC的方法從基質(zhì)中分離,然后通過中心切割法將含氧化合物轉(zhuǎn)移到下一維GC分離,完成(GC×GC-GC)方法的搭建。該項技術(shù)進一步應(yīng)用于(GC×GC-GC-GC)完成肟的順反異構(gòu)及其對映體的分離(見圖2)[94]。

圖 2 GC×GC-GC-GC分離肟的順反異構(gòu)及其對映體[94]Fig. 2 Separation of oxime cis-trans isomers and enantiomers by GC×GC-GC-GC[94]

4 結(jié)論與展望

分離與檢測一直以來都是分析學科的焦點,并且也逐漸成為許多應(yīng)用型和交叉學科中急需解決的重要問題的關(guān)鍵性技術(shù)環(huán)節(jié)之一。傳統(tǒng)的色譜技術(shù)兼?zhèn)淞朔蛛x和檢測雙重功能,但單一的分離和單一的檢測技術(shù),都越來越難以滿足超痕量樣品分析、復(fù)雜樣品分析、組學分析等需求。串聯(lián)技術(shù)的運用,極大地加強了分離與檢測的幅度和深度,不同的分離方法、分離模式的串聯(lián)可實現(xiàn)分離的優(yōu)勢互補,不同的檢測技術(shù)、檢測儀器的串聯(lián)可實現(xiàn)不同信號響應(yīng)的同時監(jiān)測,這為獲取更加豐富和更加廣泛的物質(zhì)信息提供了技術(shù)保障。

然而,在色譜分析的串聯(lián)技術(shù)中,也還有諸多的難點。(1)不同功能模塊的串聯(lián),對接口有極高的技術(shù)要求,要便于拆卸和連接,也要保證良好的密閉性,同時還必須死體積盡量?。?2)樣品、色譜固定相和檢測器三者相容性好,這需要大量的嘗試和樣品分析,才能建立高效、通用的分析方法；(3)不同檢測器的同時配備,增加了儀器成本。雖如此,但分離技術(shù)、檢測技術(shù)的不斷深入、融合,依舊是目前獲得樣品精準信息的最有效途徑。