非O157型產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌分子進(jìn)化和流行特征分析

馬崇禮，楊俊，段合波，畢旺來(lái)

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Shinga Toxin-producing Escherichia coli，STEC）是一大類(lèi)能產(chǎn)生志賀毒素的大腸埃希菌總稱(chēng)，是重要的食源性致病菌[1]。感染嚴(yán)重者可引起出血性結(jié)腸炎（HC）、溶血性尿毒綜合征（HUS）和血栓性血小板減少性紫癜（TTP）等并發(fā)癥，HUS和TTP的病死率較高[2]。產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌具有多種血清分型，根據(jù)其O抗原可以分為174種，根據(jù)其H抗原可分為53種[3]。從血清學(xué)分類(lèi)來(lái)看，大腸桿菌O157:H7是產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌中致病力最強(qiáng)、流行趨勢(shì)最廣、發(fā)病率最高的流行株，一直受到公共衛(wèi)生和食品安全領(lǐng)域的重點(diǎn)關(guān)注。但近年來(lái)，世界各地報(bào)道了由非O157型產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌引起的多起疫情，最著名的事件就是2011年德國(guó)大腸桿菌O104:H4暴發(fā)疫情，一共造成約4400人感染，死亡50例，850人發(fā)展為HUS，需長(zhǎng)期治療[4]。

非O157型產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌引發(fā)的公共衛(wèi)生事件逐漸突顯[5]，2012年因美國(guó)感染產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌而發(fā)病的231157個(gè)病例中，59.7%為非O157：H7血清型感染，40.3%為O157:H7感染[6]。目前發(fā)現(xiàn)，有超過(guò)200種非O157血清型的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌能引起人類(lèi)疾病[7]。美國(guó)1983—2002年期 間，O26、O45、O103、O111、O121和 O145血清型感染導(dǎo)致的人群發(fā)病率占非O157型產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌致病總?cè)藬?shù)的75%，這6種血清群也被稱(chēng)為“Top Six”[7]。范如岳等人鑒定了中國(guó)不同來(lái)源的434株非O157產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌分離株，除不可分型菌株外，共檢測(cè)出82種O血清群和28種H型，其中O20:H30、O2:H32和O2:H45為優(yōu)勢(shì)血清型[8]。由此可見(jiàn)，我國(guó)非O157產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌主要流行株與其他國(guó)家可能存在不同之處。

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌分布廣泛，可以畜禽肉、蔬菜、水果等為載體傳播，因此對(duì)人類(lèi)健康的危害極大[9]。產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌最主要的毒力因子是志賀毒素。志賀毒素（Stx）具有細(xì)胞毒性、腸毒性、神經(jīng)毒性作用，是毒性最強(qiáng)的細(xì)菌毒素，可損害機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腸道、腎臟[10]。志賀毒素可分為志賀毒素1（Stx1）和志賀毒素2（Stx2），志賀毒素2致病力強(qiáng)于志賀毒素1，是導(dǎo)致病人得HUS的最主要原因[11]。志賀毒素1的編碼基因stx1具有高度保守性，而志賀毒素2的編碼基因stx2序列變化很大，可分為stx2、stx2c、stx2d、stx2e 和 stx2f等亞型[12]。

目前，國(guó)際上尚無(wú)統(tǒng)一的分離鑒定非O157產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)方法。由于非O157產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌血清型眾多，營(yíng)養(yǎng)條件多樣化，至今還未找到某種特定的生化特征，能有效地從食品或臨床樣本中分離非O157型產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌。非O157血清型產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌檢測(cè)技術(shù)相較O157更加困難，即便病人感染了非O157型產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌，臨床上也較難確認(rèn)[13]。由于攜帶志賀毒素編碼基因是產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的共有特征，因此采用PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)stx是分離和鑒別產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌最有效的方法[14]。由于志賀毒素2的致病力明顯強(qiáng)于志賀毒素1，本文主要對(duì)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)有的非O157型產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌志賀毒素2基因序列進(jìn)行分析，以期為開(kāi)發(fā)非O157型產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌分子快速檢測(cè)試劑盒、制定防控對(duì)策等提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從 NCBI GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)搜索并下載截至2017年8月時(shí)公布的全部非O157型產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌志賀毒素2基因（stx2）全長(zhǎng)序列，將序列提交到EBI網(wǎng)站（http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/）上進(jìn)行多序列比對(duì)。除DNA序列信息外，還從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收集了每個(gè)菌株的血清型、采集年代、采集地點(diǎn)、宿主類(lèi)型等流行病學(xué)信息。

1.2 進(jìn)化樹(shù)分析

用mega 4.1軟件采用鄰位相連法（Neighborjoining）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。根據(jù)基本的進(jìn)化樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，采用1000次Bootstrap抽樣對(duì)樹(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。

2 結(jié)果與分析

從NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫(kù)共下載197條stx2基因全長(zhǎng)序列，用于多序列比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。由于所用序列比較多，圖1僅列出其中53條具有代表性的序列所構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)。進(jìn)化樹(shù)的主要節(jié)點(diǎn)Bootstrap值均在50%以上，表明所得到的樹(shù)的結(jié)構(gòu)可信?；騺喰头诸?lèi)綜合了進(jìn)化樹(shù)結(jié)果和NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫(kù)序列亞型信息。從圖1可知，stx2基因可以分為7種基因亞型，分別為stx2a、stx2c、stx2d、stx2e、stx2g、stx2v和 stx2f。

表1列舉了197株攜帶stx2基因的分離株的血清型和基因亞型信息。其中，stx2d共有45條序列，主要來(lái)自德國(guó)、美國(guó)、澳洲和日本，部分來(lái)自中國(guó)、丹麥、比利時(shí)、波蘭和加拿大；stx2v共有42條，主要來(lái)自于美國(guó)、德國(guó)、比利時(shí)和加拿大，部分來(lái)自荷蘭、中國(guó)、日本等；stx2a共有40條，主要來(lái)自美國(guó)、加拿大和挪威，部分來(lái)自法國(guó)、德國(guó)、荷蘭、比利時(shí)等；stx2c共有36條，主要來(lái)自美國(guó)、中國(guó)和比利時(shí)，部分來(lái)自德國(guó)、印度、瑞士等；stx2e共有16條，絕大部分來(lái)自德國(guó)，部分來(lái)自中國(guó)和越南；stx2g共有11條，來(lái)自于德國(guó)、西班牙、日本、美國(guó)、中國(guó)等；基因亞型最少的是stx2f，共有7條，來(lái)自于美國(guó)、德國(guó)和日本。我國(guó)公布的非O157菌株基因型主要屬于stx2c、stx2d、和 stx2e。

圖1 進(jìn)化樹(shù)分析

197株產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌中最主要的血清型為O121，菌株主要來(lái)源于美國(guó)、挪威、意大利、加拿大和荷蘭。除O121血清型外，還有O26、O104、O111、O174、O93、O170、O8、O2、O91和O45等血清型。我國(guó)流行的血清型分布廣泛，有O159、O8、O163、O49和O74等。

3 討論

近年來(lái)，由非O157血清型大腸桿菌致病菌引起的食物中毒事件持續(xù)增長(zhǎng)，因此檢測(cè)非O157血清型的致病性大腸桿菌非常重要。志賀毒素是大腸桿菌導(dǎo)致人類(lèi)發(fā)病的主要毒力因子，目前國(guó)際上非O157產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌序列大多是由美國(guó)、歐洲提交的，而我國(guó)所提交的序列較少。目前歐美等國(guó)主要檢測(cè)以O(shè)121血清型為代表的“Top Six”，而本文從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)采集到的流行病學(xué)信息分析可知，我國(guó)非O157產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌流行的血清型并非“Top Six”。因此我國(guó)需要針對(duì)性研發(fā)DNA探針雜交等新型檢測(cè)方法，來(lái)取代基于菌株間表型差異的傳統(tǒng)培養(yǎng)分離檢測(cè)方法，進(jìn)而提升檢測(cè)的快速性和準(zhǔn)確性。

表1 菌株血清型、基因型

本文通過(guò)對(duì)世界各地非O157型產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌stx2基因進(jìn)行分子進(jìn)化分析，從中可以了解到該類(lèi)致病菌流行和演變趨勢(shì)，為以后的防控提供一定的理論支持。