雞DIO2基因的克隆與生物信息分析

李笑，陳燁，付強(qiáng)，張配穎，牛文曉，黃天成

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定071000）

正常體溫在維持動(dòng)物機(jī)體內(nèi)環(huán)境恒定和各項(xiàng)生理功能的正?；顒?dòng)中具有極其重要的作用[1]。飲食后的產(chǎn)熱作用（即食后體增熱）和冷應(yīng)激導(dǎo)致的非顫抖產(chǎn)熱（Non-Shivering Thermogenesis,NST）作用是禽類(lèi)主要的兩種產(chǎn)熱類(lèi)型[2]。在恒溫動(dòng)物體內(nèi)，甲狀腺激素對(duì)于能量消耗、生熱、進(jìn)化和生長(zhǎng)等生物學(xué)功能起主要調(diào)節(jié)作用。在寒冷條件下，甲狀腺素分泌增加，促進(jìn)糖和脂肪在機(jī)體內(nèi)的分解以增加產(chǎn)熱，動(dòng)物機(jī)體處在嚴(yán)熱條件下，就會(huì)降低甲狀腺素的功能，基礎(chǔ)代謝水平降低，以減少熱的產(chǎn)生[3]。存在于血液中的酪氨酸碘化物四碘甲腺原氨酸（Tetraiodothyronine,T4）和組織中有生物活性的三碘甲腺原氨酸（Triiodothyronine,T3）是甲狀腺激素的主要組成部分，DIO2能夠催化無(wú)活性的T4轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腡3，是催化不同活性甲狀腺激素相互轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶[4]。在冷應(yīng)激的條件下，甲狀腺功能衰退,動(dòng)物肌肉中DIO2的活性增加，這表明在寒冷條件下,DIO2在骨骼肌中具有很重要的作用。然而對(duì)禽類(lèi)低溫調(diào)節(jié)機(jī)制研究還不是很清楚。DIO2基因主要在嚙齒類(lèi)動(dòng)物的下丘腦中表達(dá)，在甲狀腺、腹部脂肪也有表達(dá)；另外在綿羊、鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)的下丘腦組織中也有表達(dá)，由此可見(jiàn)DIO2基因在不同物種多個(gè)組織中均有表達(dá)。本研究對(duì)雞DIO2基因進(jìn)行克隆，確定了該基因在肌肉中的表達(dá)，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息分析，旨在為進(jìn)一步研究DIO2基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集壩上長(zhǎng)尾雞的肌肉組織，液氮速凍后于-70 ℃冰箱保存。

1.2 試劑與儀器

TransZol Up RNA提取試劑盒、TransScript Onestep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒；TransStart Taq DNA Polymerase均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

從Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)下載雞DIO2基因序列（Gallus gallus-5.0 Chr 5:40,594,965-40,606,615），以 該 序列作為模板，利用在線工具PRIMER3進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為1400bp。擴(kuò)增引物：正引物為5＇-GAATTCATCCGGCAGAAGAG-3＇，反引物為5＇-CACACCACCAGCACATTTTC-3＇。引物由北京華大基因科技公司合成。

1.4 總RNA提取與cDNA反轉(zhuǎn)錄

使用TransZol法提取雞肌肉的總RNA，經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)后置于-70℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：總 RNA1μg，Anchored Oligo(dt) Primer(0.5μg/μL)1μL，2×TS Reaction Mix10μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix1μL，gDNARemover1μL，RNasefree Water補(bǔ)充到20μL。將組織總RNA、Anchored Oligo(dt) Primer與無(wú)RNA酶的水溫和混勻，65 ℃靜置5min，冰浴2min，然后再加入其他反應(yīng)組分。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42 ℃靜置15min，85 ℃加熱5s失活TransScript RT/RI與 gDNA Remover，4 ℃保存。

1.5 DIO2基因擴(kuò)增與檢測(cè)

DIO2基因擴(kuò)增反應(yīng)體系（20μL）：模板1μL，10×TransStartTaq Buffer(+Mg2+)2μL，正 反 向 引物各 1μL（濃度10 mM），2.5mM dNTPs 1.6μL，TransStartTaq Polymerase0.4μL（2.5U），用ddH2O補(bǔ)至20μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3min；94 ℃變性30s，57 ℃退火30s，72 ℃延伸90s，共設(shè)40個(gè)循環(huán)；72 ℃擴(kuò)增10min；4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)后送華大基因測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

用BLAST程序?qū)λ鶞y(cè)定的結(jié)果進(jìn)行同源序列比對(duì)；用MEGA5.0的軟件進(jìn)行分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建；用BioEdit軟件分析DIO2編碼的不同物種的氨基酸。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞DIO2基因的克隆

通過(guò)Trizol法提取的雞肌肉組織的RNA，電泳后可看到清晰的18S和28S兩條條帶，說(shuō)明所提取的RNA質(zhì)量較好，可以用于下一步的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后獲得片段大小為1400bp的條帶（見(jiàn)圖1）。

圖1 肌肉DIO2基因PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 雞DIO2基因序列分析

將擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物送去華大基因測(cè)序，應(yīng)用BLAST程序?qū)y(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。測(cè)序結(jié)果顯示，克隆的雞肌肉組織的DIO2基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的DIO2基因序列（序列號(hào)：NP_989445）存在差異（黑色下劃線處）。將所克隆出來(lái)的基因序列與Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中雞DIO2基因（序列號(hào)：ENSGALT00000044669.2）同源性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其相似性為99%，表明成功克隆出DIO2基因。

2.3 雞DIO2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

選擇壩上長(zhǎng)尾雞與原雞（NP_989445.2）、火雞（XP_003206693.3）、朱鹮（XP_009475507.1）、暴風(fēng)鹱（XP_009573608.1）、波斑鴇（XP_010125525.1）、卷羽鵜鶘（XP_009491378.1）、紅喉潛鳥(niǎo)（XP_009510468.1）、白鷺（XP_009806638.1）鴕鳥(niǎo)（XP_015720714.1）、普通鸕鶿（XP_009644932.1）、日本鵪鶉（XP_009668786.1）和濱鷸（XP_014797434.1）等進(jìn)行了多重序列比較，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，DIO2基因在不同物種中具有較高的保守性。應(yīng)用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，壩上長(zhǎng)尾雞與日本鵪鶉的相應(yīng)序列聚為一支，進(jìn)化樹(shù)在分類(lèi)學(xué)與形態(tài)方面一致性較高，說(shuō)明成功克隆了雞的DIO2基因。

圖2 肌肉DIO2基因與數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST結(jié)果圖

圖3 雞與其他物種DIO2氨基酸序列多重比對(duì)

圖4 雞與其他物種DIO2的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

本研究根據(jù)從Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)下載的雞DIO2基因序列，并且以該序列為模板，采用在線工具Primer3.0對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，成功克隆出壩上長(zhǎng)尾雞總長(zhǎng)為1039bp的DIO2基因序列的一部分，此序列包括完整的編碼區(qū)840bp，共編碼279個(gè)氨基酸，通過(guò)序列分析結(jié)果表明雞DIO2基因在不同物種之間具有很高的保守性。由生物信息學(xué)的方法對(duì)DIO2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，得到氨基酸的核心組成。

DIO2作為動(dòng)物體內(nèi)重要的平衡體溫因子，在低溫條件下對(duì)于動(dòng)物體溫的調(diào)節(jié)有著重要作用，對(duì)其分子結(jié)構(gòu)和功能的研究已成為目前研究的熱點(diǎn)。由于骨骼肌的生熱能力克服了褐色脂肪組織（BAT）生熱的缺乏，所以敲除解耦聯(lián)蛋白1基因的小鼠，在寒冷條件依然是存活的。此外，在甲狀腺功能衰退的動(dòng)物中其骨骼肌和紅肌在冷應(yīng)激4小時(shí)后DIO2活性上調(diào)，表明T3的局部生成在骨骼肌處于冷應(yīng)激環(huán)境中發(fā)揮重要的作用。在生物體逐漸適應(yīng)冷應(yīng)激環(huán)境的過(guò)程中，T3在骨骼肌的生熱期起著至關(guān)重要的作用。經(jīng)證明DIO2的活性在慢肌處于冷應(yīng)激3天后發(fā)揮作用，在快肌處于冷應(yīng)激10天后發(fā)揮作用，并且伴隨著耗氧量增加以及T3靶基因在快肌和慢肌兩種組織中的表達(dá)。即使在4 ℃下10天后，血清T3的濃度也保持不變，BAT和慢收縮肌肉DIO2已經(jīng)正?；瘯r(shí)，快肌中DIO2活動(dòng)在這種適應(yīng)條件下對(duì)循環(huán)T3有明顯的促進(jìn)作用。但以前在雞的肌肉中并沒(méi)有研究，在本次試驗(yàn)中，選取了壩上長(zhǎng)尾雞的肌肉組織進(jìn)行RNA提取并進(jìn)行了RT-PCR及DIO2基因克隆，結(jié)果顯示，DIO2基因在雞的肌肉中是表達(dá)的，為研究其在骨骼肌中參與體溫調(diào)節(jié)機(jī)制提供了依據(jù)。

通過(guò)對(duì)不同物種的DIO2基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)壩上長(zhǎng)尾雞與日本鵪鶉遺傳距離最近，并且各個(gè)物種間的DIO2氨基酸序列差別不大，所以DIO2基因序列是保守的。本實(shí)驗(yàn)中所選取的不同物種均屬于鳥(niǎo)類(lèi)，它們具有相同的進(jìn)化起源，遺傳進(jìn)化距離較近，這可能是造成壩上長(zhǎng)尾雞與日本鵪鶉遺傳距離最近的原因之一；而且本實(shí)驗(yàn)中獲得的DIO2基因序列表明，其與不同物種的DIO2基因均具有較高的同源性，這可能也是造成壩上長(zhǎng)尾雞與日本鵪鶉遺傳距離最近的原因之一。另外，本次試驗(yàn)只選取了肌肉組織較為單一，對(duì)DIO2基因的功能研究還并不透徹，DIO2在不同組織中的表達(dá)情況以及分子調(diào)控機(jī)制仍然需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

在壩上長(zhǎng)尾雞的肌肉組織中成功克隆出DIO2基因，編碼區(qū)全長(zhǎng)1039bp，與Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中的雞的DIO2基因同源性為99%，共編碼279個(gè)氨基酸，其中亮氨酸含量最高（12.5%）；聚類(lèi)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，不同物種的DIO2基因與雞DIO2基因在脫氧核苷酸序列和氨基酸序列都表現(xiàn)出高度的保守性；進(jìn)一步證明DIO2序列的保守性較高。