動態(tài)超高壓微射流技術(shù)對蔓三七葉中黃酮的提取研究

涂招秀，謝欣，胡居吾＊，黃斌華

（1.江西省科學(xué)院，江西南昌 330096；2.江西華紫仁農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，江西贛州 330000）

蔓三七，又名平臥菊三七、蛇接骨、續(xù)命草、神仙草，味辛、微苦、性涼，為多年生草本藥食兩用植物。蔓三七莖葉營養(yǎng)豐富，富含粗多糖和綠原酸，同時還含有總黃酮、維生素A、維生素C、氨基酸和有機(jī)鈣等成分。民間利用其通經(jīng)活絡(luò)，消腫止痛，消炎止咳，治療跌打損傷，支氣管肺炎、肺結(jié)核等[1]?，F(xiàn)代生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)研究證明，蔓三七具有通經(jīng)活絡(luò)、消炎止咳、散淤消腫、活血生肌等功效[2]，能延緩衰老、激活免疫細(xì)胞、改善機(jī)體免疫功能、提高人體免疫力，增強(qiáng)人體的新陳代謝并對記憶障礙有一定改善作用[3]；具有降血壓、降血糖和預(yù)防慢性腎病、抑制乙型肝炎的顯著效果[4]；對預(yù)防和治療心腦血管疾病、糖尿病等有一定的療效[5]；還具有抗病毒、抗菌活性、抑制骨髓癌和志賀樣毒素細(xì)胞的活性[6]。

動態(tài)超高壓微射流技術(shù)是一種新興的超微細(xì)化技術(shù)[7]，目前常被用于滅菌作用[8]、多糖的提取[9]、蛋白質(zhì)改性[10]等。運(yùn)用動態(tài)超高壓微射流技術(shù)來提取黃酮的研究相對較少。

本實驗采用正交實驗優(yōu)化動態(tài)超高壓微射流技術(shù)提取蔓三七葉中黃酮的最佳工藝參數(shù)，以達(dá)到提高蔓三七葉中黃酮的得率為目的，為全面開發(fā)和利用蔓三七提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔓三七，江西華紫仁農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，烘干、粉碎后過20目篩備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心；其余試劑，均為國產(chǎn)分析純。

MFIC高壓微射流均質(zhì)機(jī)（M-700 Series），美國Microfluidics公司生產(chǎn)；高壓均質(zhì)機(jī)（GY50-6S），上海華東高壓均質(zhì)機(jī)廠生產(chǎn)；可見分光光度計（722G），上海馳唐實業(yè)有限公司生產(chǎn)；電子分析天平（AL104），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取在120 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品0.2000 g，置于100 mL容量瓶中，加80%乙醇70 mL，置于水浴上微熱使溶解，冷卻至室溫，加乙醇至刻度，搖勻。精密吸取10 mL置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得0.2 mg/mL蘆丁對照品溶液。

精密量取對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL和7.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，加乙醇6 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，后加5%氫氧化鈉試液10.0 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以乙醇為參比，用1 mL比色皿，于紫外可見分光光度計上，在400～600 nm波長處進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，對照品溶液在510 nm處有最大吸收，因此選擇510 nm作為測定波長。在510 nm波長處測定體系的吸收度，以吸收度（A）為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 蔓三七葉黃酮提取的流程

蔓三七葉粉末→一定濃度的乙醇浸泡→過夜→高壓預(yù)均質(zhì)（30 MPa，2次）→動態(tài)超高壓微射流均質(zhì)→乙醇冷凝回流提?。?0 ℃，2次）→合并提取液→離心→抽濾→測定吸光度→計算黃酮得率。

1.2.3 蔓三七葉黃酮得率的計算

取0.5mL提取液，按照1.2.1的方法測定其在510 nm下的吸光度，按照式（1）計算黃酮的得率。

1.2.4 單因素實驗

本實驗中，提取溫度、乙醇濃度、提取時間、提取次數(shù)、微射流均質(zhì)壓力、料液比等因素為影響蔓三七葉黃酮得率的主要因素。通過前期研究，確定液料比為15:1（mL: g），提取次數(shù)為2次。本實驗主要研究提取溫度、乙醇濃度、提取時間和微射流均質(zhì)壓力四個因素對蔓三七葉黃酮得率的影響。

1.2.5 正交實驗設(shè)計

根據(jù)上述單因素的實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、微射流均質(zhì)壓力（D）對蔓三七葉黃酮得率影響較大。因此，采用四因素三水平的正交試驗方法對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以類蔓三七葉黃酮得率為評價指標(biāo)，設(shè)計方案見表1。

表1 正交實驗因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=5.8579C+0.0012，R2=0.9996，在0～0.05 mg/mL范圍內(nèi)其吸光度值與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇濃度對蔓三七葉黃酮得率的影響

分別稱取100.00 g干燥的蔓三七葉粉末（過20目），液料比15:1 (ml:g)，加入分別為50%、60%、70%、80%和90%濃度的乙醇，浸泡過夜，先經(jīng)過30 MPa預(yù)均質(zhì)后，在80 MPa微射流壓力下處理2次，65℃水浴提取1.5 h，提取兩次，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對黃酮得率的影響

由圖1可知，在乙醇濃度為50%～70%范圍內(nèi)，蔓三七葉黃酮得率隨著乙醇濃度的增加而增大，并且在乙醇濃度為70%時達(dá)到最大值，此時得率為1.93%；在乙醇濃度為70%～90%范圍內(nèi)，乙醇濃度繼續(xù)上升，黃酮得率緩慢下降，在乙醇濃度為90%時，蔓三七葉黃酮得率為1.82%。蔓三七葉黃酮得率隨著乙醇濃度的上升而下降，主要是因為當(dāng)體系中的乙醇濃度大于70%后，物料中脂溶性雜質(zhì)（如葉綠素）等大量溶解到體系中，從而降低了蔓三七葉黃酮的得率。因此，選擇乙醇濃度為70%較合適。

2.2.2 提取溫度對蔓三七葉黃酮得率的影響

分別稱取100.00 g蔓三七葉粉末，按液料比15:1(ml:g)加入70%濃度的乙醇，浸泡過夜，經(jīng)30 MPa預(yù)均質(zhì)后，立刻在80 MPa微射流壓力下處理2次，提取溫度選擇50、55、60、65 ℃和70 ℃水浴提取1.5 h，提取兩次，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，在提取溫度為50～65 ℃范圍內(nèi)，蔓三七葉黃酮得率隨著提取溫度的上升而增加，且能顯著影響蔓三七葉黃酮得率。在提取溫度為50 ℃時，蔓三七葉黃酮得率為1.61%，而在提取溫度為65℃時，蔓三七葉黃酮得率達(dá)到1.92%。但當(dāng)溫度超過65 ℃后，蔓三七葉黃酮得率隨著溫度的上升而緩慢下降，在提取溫度為70 ℃時，蔓三七葉黃酮得率為1.87%，由于在高溫下蔓三七葉黃酮中的某些在高溫下易分解的活性成分被氧化分解，因此，用蘆丁做標(biāo)準(zhǔn)品去測量產(chǎn)品中的蔓三七葉黃酮含量下降，從而影響了其得率。因此，選擇提取溫度為65 ℃較合適。

2.2.3 提取時間對蔓三七葉黃酮得率的影響

分別稱取100.00 g蔓三七葉粉末，按液料比15:1 (mL:g)加入70%濃度的乙醇，浸泡過夜，經(jīng)30 MPa預(yù)均質(zhì)后，立刻在80 MPa微射流壓力下處理2次，提取溫度65 ℃水浴提取，提取時間選擇0.5、1、1.5、2 h和2.5 h，提取兩次，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，蔓三七葉黃酮得率隨著時間的延長先增加而后趨于平緩，在1.5 h內(nèi)時，黃酮得率升高較快，而超過1.5 h后，黃酮得率變化不大。因此，選擇提取時間為1.5 h較合適。

圖2 提取溫度對黃酮得率的影響

圖3 提取時間對黃酮得率的影響

2.2.4 微射流均質(zhì)壓力對蔓三七葉黃酮得率的影響

分別稱取100.00 g蔓三七葉粉末，按液料比15:1 (mL:g)加入70%濃度的乙醇，浸泡過夜，經(jīng)30 MPa預(yù)均質(zhì)后，分別在立刻微射流均質(zhì)壓力選擇60、70、80、90 MPa和100 MPa下處理2次，提取溫度65℃水浴提取1.5 h，提取兩次，結(jié)果如圖4所示。從圖4可知，在微射流均質(zhì)壓力為60～90 MPa范圍內(nèi)，蔓三七葉黃酮得率隨著微射流均質(zhì)壓力的增大而增加，在壓力為90 MPa時達(dá)到最大值，得率達(dá)到1.94%。而后隨著均質(zhì)壓力的進(jìn)一步加大，蔓三七葉黃酮得率趨于平緩且略微下降。微射流均質(zhì)后再提取時，使得蔓三七葉黃酮得率隨著均質(zhì)壓力的上升而顯著提高，其原因是均質(zhì)壓力越大，使得物料的細(xì)胞破碎程度越高，從而使得物料中有效成分黃酮類物質(zhì)更完全地溶出。

圖4 微射流均質(zhì)壓力對黃酮得率的影響

2.3 正交實驗的結(jié)果與分析

從表2比較4個因素的極差R值，RA＞RC＞RB＞RA，即乙醇濃度＞提取時間＞提取溫度＞壓力，說明因素A對指標(biāo)的影響最大。根據(jù)K值實驗結(jié)果可見，最佳工藝組合為A3B2C3D2，即乙醇濃度80%、提取溫度65 ℃、提取時間2.0 h、壓力80 MPa。依照優(yōu)化條件進(jìn)行重復(fù)試驗，此時蔓三七葉黃酮的得率為1.95%，提取率為94.8%。

表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

3 結(jié)論

本實驗研究了動態(tài)超高壓微射流對蔓三七葉黃酮得率的影響。通過正交實驗法確定了微射流均質(zhì)熱醇提取蔓三七葉黃酮的最佳條件：乙醇濃度80%、提取溫度65 ℃、提取時間2.0 h、微射流均質(zhì)壓力80 MPa、微射流均質(zhì)次數(shù)2次、液料比15:1 (ml:g)、提取次數(shù)2次。此時，蔓三七葉黃酮的得率為1.95%。