p16INK4a蛋白在胸腹水細(xì)胞蠟塊中的表達(dá)及臨床意義

郭 睿，李 曼，趙世平，黃小鐘，金雪媛，楊 軍

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:yangjundr@163.com)

準(zhǔn)確的病理診斷是腫瘤治療、療效分析、預(yù)后檢測(cè)的前提和基礎(chǔ),也是延長帶瘤生存時(shí)間、降低腫瘤死亡率、改善預(yù)后的根本。因此,尋找廣譜性好、敏感性和準(zhǔn)確率高的腫瘤標(biāo)志物顯得十分重要。胸腹水是進(jìn)展期惡性腫瘤最為常見一種臨床表現(xiàn),是腫瘤發(fā)生胸腔臟器或胸膜腔轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的繼發(fā)改變。但是,由于進(jìn)展期惡性腫瘤患者同時(shí)也會(huì)合并其他良性病變引起胸膜腔積液,比如,結(jié)核、肺心病、胸膜炎、肝硬化、低蛋白血癥、終末期腎病、惡病質(zhì)等。因此,準(zhǔn)確、快速地從胸腹水樣本中查找腫瘤細(xì)胞,確定胸腹水性質(zhì)對(duì)于判斷惡性腫瘤的進(jìn)展、評(píng)價(jià)療效、預(yù)測(cè)預(yù)后、指導(dǎo)制定治療方案具有不可替代的重要價(jià)值和意義。為此，許多學(xué)者嘗試選擇多種分子靶標(biāo)和制片技術(shù)以期提高診斷的準(zhǔn)確率[1-3]。

p16基因又叫多腫瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1,MTS),是一種調(diào)控細(xì)胞周期的抑癌基因,其編碼的p16INK4a蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi),是細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子(inhibitors of cyclin-dependent kinase 4,Ink4)和重要的抑癌基因,在細(xì)胞周期調(diào)控和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要調(diào)控作用。既往認(rèn)為,當(dāng)p16基因由于缺失、突變、甲基化造成p16INK4a蛋白異常表達(dá)時(shí),導(dǎo)致細(xì)胞的無限增殖引發(fā)腫瘤[4-6]。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)胸腹水細(xì)胞蠟塊中p16INK4a蛋白表達(dá)情況,分析其作為胸腹水惡性腫瘤相關(guān)分子靶標(biāo)的敏感性(sensitivity,SEN)、特異性(specificity,SPE)、陽性預(yù)測(cè)值(positive predictive value,PPV)、陰性預(yù)測(cè)值(negative predictive value,NPV),并探討p16INK4a蛋白表達(dá)在良惡性胸腹水的早期診斷、鑒別診斷中的意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2014-03～2015-03西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院存檔的胸腹水細(xì)胞蠟塊標(biāo)本77例,男性42例,女性35例,年齡范圍21-87歲,平均54歲。所有病例均經(jīng)病理學(xué)及臨床確診。惡性腫瘤胸腹水樣本60例,其中包括肺癌30例,乳腺癌7例,原發(fā)性肝癌5例,卵巢癌2例,其他惡性腫瘤16例;良性病變胸腹水樣本17例,其中包括細(xì)菌性肺炎7例,結(jié)核性胸(腹)膜炎3例,冠心病2例,肝硬化5例。

1.2 試劑和儀器

Anti-p16INK4a(clone 6H12)鼠單克隆抗體購自中國福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。DAB染色試劑盒,使用全自動(dòng)免疫組化儀器Ventana Bench Mark XT(瑞士,羅氏)。

1.3 HE染色和免疫組化染色方法

所有標(biāo)本均經(jīng)離心沉渣包埋、4 μm厚切片、常規(guī)HE染色及免疫組化染色。免疫組化染色采用Ventana Bench Mark XT全自動(dòng)免疫組化染色儀完成。用已知陽性標(biāo)本作對(duì)照,用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷

p16INK4a免疫組化染色按照質(zhì)/核型分子判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀[7]:①0,無著色;②+,≤10%細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的細(xì)胞質(zhì)著色;③++,10%-30%的細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)強(qiáng)的棕褐色著色,或≤70%細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)弱或中等強(qiáng)度質(zhì)著色;④+++,>30%細(xì)胞胞質(zhì)呈強(qiáng)的棕褐色著色,或>70%的胞質(zhì)呈中等強(qiáng)度著色。評(píng)分為“0”者判讀為陰性(表達(dá)缺失),評(píng)分為“+”者判讀為弱陽性(正常表達(dá)),評(píng)分為“++”和“+++”者判讀為陽性(表達(dá)上調(diào))。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理全部數(shù)據(jù),各組間陽性率差異采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)算p16INK4a診斷惡性胸腹積液的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值。

2 結(jié)果

2.1 p16INK4a蛋白在胸腹水細(xì)胞蠟塊樣本中表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示p16INK4a蛋白的表達(dá)模式為質(zhì)/核型,在不同類型的胸腹水細(xì)胞蠟塊樣本中表達(dá)強(qiáng)度不盡相同:p16INK4a蛋白在良性胸腹水細(xì)胞蠟塊樣本中呈陰性或弱陽性表達(dá),在惡性胸腹水樣本中呈陰性和不同強(qiáng)度的陽性表達(dá)(見圖1)。

p16INK4a蛋白在77例良、惡性胸腹水細(xì)胞蠟塊樣本中呈陰性(0)、弱陽性(+)、陽性(++)和強(qiáng)陽性(+++)表達(dá)的樣本比例各不相同,按照組成比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)p16INK4a蛋白表達(dá)良性、惡性胸腹水樣本之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=11.142,P=0.025),而在肺癌樣本與其他樣本之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=1.717,P=0.424,見表1)。

按照p16INK4a表達(dá)強(qiáng)度,將陰性(0)和弱陽性(+)病例合并為陰性組(≤+),將陽性(++)和強(qiáng)陽性(+++)病例合并為陽性組(≥++)后,在60例惡性胸腹水細(xì)胞蠟塊樣本中,p16INK4a蛋白表達(dá)上調(diào)(≥++)高達(dá)83.33%,其中在肺癌樣本中86.66%,其他惡性腫瘤樣本中80.00%,而在良性病變組僅為26.66%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)p16INK4a蛋白在惡性和良性病變胸腹水細(xì)胞蠟塊樣本中的陽性表達(dá)存在顯著差異(χ2=9.737,P=0.008)。但在肺癌和其他惡性腫瘤中的表達(dá)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.483,P=0.731,見表2)。

2.2 p16INK4a的敏感性、特異性和陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值

按照p16INK4a表達(dá)強(qiáng)度將陰性(-)和弱陽性(+)病例合并為陰性組(≤+)、將陽性(++)和強(qiáng)陽性(+++)病例合并為陽性組(≥++)后,以活檢結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn),p16INK4a蛋白作為肺癌性胸腹水樣本診斷指標(biāo)的敏感性為76.47%，特異性為69.23%，陽性預(yù)測(cè)值為86.67%，陰性預(yù)測(cè)值為52.94%,作為其他惡性腫瘤胸腹水診斷指標(biāo)的敏感性為75.00%，特異性為60.00%，陽性預(yù)測(cè)值為80.00%，陰性預(yù)測(cè)值為52.94%;將肺癌組與其他惡性腫瘤組樣本合并后,p16INK4a蛋白作為惡性胸腹水樣本診斷指標(biāo)的總敏感性為75.76%、特異性為64.29%、陽性預(yù)測(cè)值為83.33%、陰性預(yù)測(cè)值為52.94%(見表3)。

A.肺腺癌胸水HE染色(×20);B.肺腺癌胸水p16INK4a蛋白呈陽性表達(dá)(×40);C.肺腺癌胸水p16INK4a蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)(×40);D.卵巢癌腹水HE染色(×40);E.卵巢癌腹水p16INK4a蛋白呈弱陽性表達(dá)(×40);F.卵巢癌腹水p16INK4a蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)(×40)圖1 p16INK4a蛋白在胸腹水細(xì)胞蠟塊樣本中的表達(dá)Figure 1 Expression of p16INK4a protein in paraffin-embedded specimens from ascites and pleural effusion

表1 p16INK4a蛋白在胸腹水細(xì)胞蠟塊樣本的表達(dá) 例(%)Table 1 Expression of p16INK4a protein in paraffin-embedded specimens from ascites and pleural effusion 例(%)

a惡性腫瘤組與良性病變組比較;b肺癌組與其他惡性腫瘤組比較

表2 p16INK4a蛋白在胸腹水細(xì)胞蠟塊樣本中表達(dá) 例(%)Table 2 Expression of p16INK4a protein in paraffin-embedded specimens from ascites and pleural effusion cases(%)

a惡性腫瘤組與良性病變組比較;b肺癌組與其他惡性腫瘤組比較

表3 p16INK4a蛋白表達(dá)在診斷良、惡性胸腹水細(xì)胞蠟塊樣本診斷中的價(jià)值Table 3 The diagnostic value of p16INK4a protein expression for benign and malignancy of paraffin-embedded specimens from ascites and pleural effusion

3 討論

p16INK4a基因是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的抑癌基因。在正常細(xì)胞周期中,p16INK4a蛋白對(duì)CDK4/6-cyclinD1/Rb-E2F環(huán)路起負(fù)向調(diào)控作用,通過與周期蛋白D競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CDK4/6,引起Rb蛋白脫磷酸化而失活,阻斷細(xì)胞周期通過R點(diǎn)而停留在G1期,從而維持細(xì)胞周期、調(diào)控平衡,并在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控和增殖中發(fā)揮重要的抑制作用[8-11]。

作為一種抑癌基因,既往研究認(rèn)為在腫瘤組織中p16INK4a基因突變、缺失、啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致的p16INK4a的表達(dá)缺失或下調(diào)是其重要分子機(jī)制[12-15]。但近來研究發(fā)現(xiàn),在相當(dāng)多腫瘤中p16INK4a蛋白的表達(dá)呈顯著性上調(diào)狀態(tài)[16-19],更有學(xué)者研究報(bào)道,p16INK4a甲基化和表達(dá)可同時(shí)存在[20,21]。因此,對(duì)于p16INK4a蛋白表達(dá)水平的判讀并不能簡(jiǎn)單解讀為陰性表達(dá)或陽性表達(dá),p16INK4a蛋白的陰性表達(dá)和強(qiáng)陽性表達(dá)均是腫瘤細(xì)胞特征性的免疫表型,反映的是兩種不同的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制:p16INK4a蛋白呈現(xiàn)全陰性表達(dá),預(yù)示p16基因缺失或啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化是腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控異常的重要機(jī)制;當(dāng)p16INK4a蛋白呈現(xiàn)彌漫強(qiáng)陽性核/質(zhì)型表達(dá)時(shí),說明Rb基因突變、缺失、甲基化引起的Rb蛋白缺失、低表達(dá)或活性降低,或cyclinD1-CDK4/6過度活化引起的Rb高磷酸化是腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控異常的重要機(jī)制。

現(xiàn)已證實(shí)高危型HPV陽性的宮頸癌和癌前病變中均發(fā)現(xiàn)p16INK4a基因過表達(dá)與腫瘤的性質(zhì)和HPV感染密切相關(guān),而且采用免疫組化檢測(cè)p16INK4a的表達(dá)已成為HPV相關(guān)宮頸高級(jí)別病變及宮頸癌等惡性腫瘤分子的診斷的特異性分子靶標(biāo)而被CFDA批準(zhǔn)用于臨床[22-24]。本課題組近年來研究發(fā)現(xiàn)[25,26],除了HPV相關(guān)腫瘤,p16INK4a在多種非HPV相關(guān)惡性腫瘤中可出現(xiàn)代償性高表達(dá),而這種代償性高表達(dá)陽性率高達(dá)70%以上,其中在乳腺癌的研究中,已將p16INK4a代償性高表達(dá)作為特異性標(biāo)志,并應(yīng)用于乳腺癌的診斷和鑒別診斷[26]。

本實(shí)驗(yàn)通過將77例胸腹水制作成細(xì)胞蠟塊,采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)p16INK4a蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),p16INK4a蛋白在惡性腫瘤和良性病變胸腹水樣本中的陽性表達(dá)存在顯著差異(P<0.05),但在肺癌和其他惡性腫瘤的表達(dá)并無顯著差異。這說明p16INK4a代償性高表達(dá)是胸腔轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞周期異常的重要模式,但與惡性腫瘤的來源和組織學(xué)類型無明顯相關(guān)性。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),將胸腹水細(xì)胞蠟塊免疫組化染色結(jié)果與最終活檢結(jié)果相比,肺癌組敏感性為76.47%、特異性69.23%、陽性預(yù)測(cè)值86.67%、陰性預(yù)測(cè)值52.94%;其他惡性腫瘤組敏感性為75.00%、特異性60.00%、陽性預(yù)測(cè)值80.00%、陰性預(yù)測(cè)值52.94%;將兩組合并后其敏感性最終活檢結(jié)果相比為75.76%、特異性64.29%、陽性預(yù)測(cè)值83.33%、陰性預(yù)測(cè)值52.94%。由此可見,p16INK4a蛋白可作為廣譜腫瘤標(biāo)志物,并適用于良惡性胸腹水的診斷和鑒別診斷。

尋找腫瘤特異性標(biāo)志物一直是提高惡性腫瘤診斷準(zhǔn)確率的重要途徑[27,28],尤其是對(duì)于胸腹水等體液樣本,由于受到背景細(xì)胞的影響,單純從細(xì)胞病理學(xué)水平,以形態(tài)學(xué)判讀并不能滿足臨床診斷的需要。而p16INK4a蛋白以其特有的代償性高表達(dá)模型和廣譜特征,為良惡性胸腹水樣本的診斷和鑒別診斷提供了簡(jiǎn)單、實(shí)用的腫瘤特異性分子靶標(biāo),且具有較好的敏感性和陽性預(yù)測(cè)值,適用于良、惡性胸腹水等體液樣本的診斷和鑒別診斷。

綜上所述,p16INK4a蛋白的表達(dá)缺失和代償性高表達(dá)均是惡性胸腹水中腫瘤細(xì)胞的免疫表型特征,可以作為良惡性胸腹水等體液樣本診斷和鑒別診斷的分子靶標(biāo),且廣譜性好、敏感性和陽性預(yù)測(cè)值高,適合用于良惡性胸腹水的診斷和鑒別診斷,有助于提高惡性胸腹水的陽性檢出率。