山西呂梁市產(chǎn)ESBL大腸埃希菌基因型和耐藥性分析

陳利榮,賈艷梅,王亞鵬,任天琪,車昌燕,李晉華

(1山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系生物學(xué)教研室,汾陽 032200;2山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系生物化學(xué)教研室;3山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系病原微生物與免疫學(xué)教研室;4山西醫(yī)科大學(xué)附屬汾陽醫(yī)院檢驗科;#共同第一作者;*通訊作者,E-mail:clr928@163.com)

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase, ESBL)是絲氨酸蛋白酶的衍生物,能夠水解青霉素、廣譜及超廣譜頭孢菌素及單環(huán)β-內(nèi)酰胺酶抗菌藥物[1],主要由腸桿菌科中的大腸埃希菌產(chǎn)生[2]。由于ESBL由質(zhì)粒介導(dǎo),可以通過多種方式在細(xì)菌間傳遞,所以ESBL的產(chǎn)生是導(dǎo)致細(xì)菌對多種抗菌藥物耐藥的重要機(jī)制之一。大腸埃希菌是醫(yī)院感染的常見病原菌,近年來產(chǎn)ESBL大腸埃希菌感染的報道呈持續(xù)上升趨勢[3]。但目前關(guān)于呂梁地區(qū)產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的基因型和耐藥性尚未見報道,所以了解呂梁地區(qū)產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的基因型分布并分析其對臨床常用抗菌藥物的耐藥性,可以為臨床合理有效地使用抗菌藥物、控制耐藥菌株的播散和流行提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集2014-01～2015-10山西省呂梁市汾陽醫(yī)院從患者痰液、尿液等分泌物中分離的大腸埃希菌87株,同一患者不重復(fù)留取。大腸埃希菌質(zhì)控菌株ATCC25922和ATCC35218購于國家臨床檢驗中心。

1.1.2 抗菌藥物及試劑 藥敏紙片(頭孢曲松、頭孢噻肟、氨曲南、頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟/克拉維酸)購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司,M-H培養(yǎng)基購自英國OXOID公司。LB培養(yǎng)基、質(zhì)粒提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、10×Buffer緩沖液、dNTP及DNA marker購自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的鑒定 采用ATB細(xì)菌鑒定儀從臨床標(biāo)本中分離出的細(xì)菌進(jìn)行鑒定,篩選出大腸埃希菌。將經(jīng)鑒定的大腸埃希菌配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?均勻涂布在M-H平板上,并將藥敏紙片頭孢噻肟(30 μg)和頭孢噻肟/克拉維酸(10 μg)、頭孢他啶(30 μg)和頭孢他啶(30 μg)/克拉維酸(10 μg)均勻貼于M-H平板上,35 ℃左右培養(yǎng)18-24 h后,測量抑菌環(huán)直徑,兩對紙片中只要其中一對紙片加克拉維酸者比不加克拉維酸者的抑菌環(huán)直徑≥5 mm時,即確證為產(chǎn)ESBL菌株。

1.2.2 產(chǎn)ESBL大腸埃希菌基因型分析 根據(jù)GenBank中登錄的各型ESBL基因序列設(shè)計3對引物(見表1),由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。對證實產(chǎn)ESBL的菌株,常規(guī)試劑盒提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定ESBL基因型。

表1 各組ESBL引物序列和擴(kuò)增片段長度Table 1 ESBL primer sequences and amplified fragment length

1.2.3 大腸埃希菌的抗菌藥物敏感試驗 采用ATB細(xì)菌藥敏分析儀進(jìn)行細(xì)菌藥敏試驗,結(jié)果評價按照2014年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standard Institute,CLSI)推薦的判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。

2 結(jié)果

2.1 篩選并鑒定出42株產(chǎn)ESBL大腸埃希菌

共收集大腸埃希菌87株,經(jīng)初篩試驗和確證試驗檢出42株產(chǎn)ESBL大腸埃希菌(見圖1),陽性率為48.3%。

圖1 ESBL表型確證試驗陽性結(jié)果Figure 1 The positive result of ESBL phenotype confirmation test

2.2 產(chǎn)ESBL大腸埃希菌耐藥基因型的分布情況

42株產(chǎn)ESBL大腸埃希菌均可擴(kuò)增出ESBL基因,含耐藥基因CTX型10株,TEM型4株,SHV型1株,同時含兩種及兩種以上基因型達(dá)27株,各基因型分布見表2,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。

表2 產(chǎn)ESBL大腸埃希菌基因型分布Table 2 Genotype distribution of ESBL-producing E.coli

M.Marker;1-2.CTX型;3-4.SHV型;5-6.TEM型圖2 產(chǎn)ESBL大腸埃希菌PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 PCR amplification results of E.col producing ESBL

2.3 分離出的大腸埃希菌的抗菌藥物敏感試驗結(jié)果

藥敏結(jié)果顯示42株產(chǎn)ESBL大腸埃希菌對阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、頭孢噻吩、頭孢他啶和頭孢呋辛全部耐藥,對左氧氟沙星、頭孢西丁、頭孢噻肟、頭孢吡肟、復(fù)方新諾明、妥布霉素、阿米卡星、慶大霉素、替奈米星和環(huán)丙沙星的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌,對美洛培南和亞胺培南則全部敏感(見表3)。

表3 大腸埃希菌87株對18種抗菌藥物的耐藥性分析Table 3 Resistance analysis of 87 strains of E.coli to 18 kinds of antimicrobial agents

3 討論

大腸埃希菌是人體的正常菌群,廣泛存在于自然界和人體腸道,當(dāng)人體免疫力降低或菌群失調(diào)時可成為條件致病菌,引起感染性疾病發(fā)生,是目前醫(yī)院感染最常見的病原菌之一[4]。目前臨床上廣譜抗菌藥物,特別是三代頭孢菌素的廣泛使用,導(dǎo)致新的耐藥菌株不斷出現(xiàn),其中產(chǎn)ESBL是大腸埃希菌對β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物耐藥的重要機(jī)制[3]。

ESBL能水解幾乎所有β-內(nèi)酰胺酶類和單酰胺類抗菌藥物,由質(zhì)粒介導(dǎo)并能通過結(jié)合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化等方式在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移和播散[5],造成嚴(yán)重的醫(yī)院感染并給臨床治療帶來極大的困難。近年來醫(yī)院感染產(chǎn)ESBL的大腸埃希菌的檢出率逐年升高[3]。

本研究結(jié)果顯示呂梁地區(qū)臨床分離的87株大腸埃希菌中42株產(chǎn)ESBL,檢出率高達(dá)48.3%。ESBL的主要型別有TEM、SHV和CTX型,細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥本質(zhì)上發(fā)生于基因水平,所以分析抗性基因?qū)﹃U明細(xì)菌的耐藥機(jī)制有重要意義。產(chǎn)ESBL細(xì)菌呈世界性流行,但不同地區(qū)流行的基因型不同[6],本研究中的42株產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的ESBL主要為CTX+TEM雙基因型(占52.38%),其次為CTX型(占23.81%)和TEM型(占9.52%)。不同類型的ESBL具有不同的底物水解譜,同時攜帶CTX和TEM型兩種β-內(nèi)酰胺酶基因,產(chǎn)生兩種酶不僅增加了ESBL的產(chǎn)量,同時也拓寬了水解底物的范圍,從而增加了細(xì)菌的耐藥性并拓寬了其耐藥譜[7]。本研究的藥敏結(jié)果顯示,產(chǎn)ESBL大腸埃希菌和非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌對碳青霉烯類的美洛培南和亞胺培南均無耐藥,敏感率為100%,與國內(nèi)有關(guān)報道相一致[8-11];除外美洛培南和亞胺培南,產(chǎn)ESBL大腸埃希菌對常用16種抗菌藥的耐藥率均高于非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌。產(chǎn)ESBL大腸埃希菌相對較敏感的抗菌藥物有頭霉素類的頭孢西丁和氨基糖苷類的阿米卡星,提示臨床治療產(chǎn)ESBL大腸埃希菌引起的嚴(yán)重感染時可首選美洛培南和亞胺培南進(jìn)行治療,頭孢西丁可作為次選藥物,也可以與阿米卡星聯(lián)合治療。

本研究比較了山西呂梁地區(qū)ESBL陽性和陰性大腸埃希菌的耐藥性,并分析了產(chǎn)ESBL菌株的相應(yīng)基因型。產(chǎn)ESBL大腸埃希菌由于耐藥性高且對多種抗菌藥物均可產(chǎn)生耐藥性,容易引起感染甚至暴發(fā)流行,應(yīng)引起臨床上的高度重視,尤其是攜帶多種基因型的情況。加強(qiáng)對產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的檢測與監(jiān)測,對于已發(fā)生的感染應(yīng)盡早給予相應(yīng)的隔離措施并采取合理有效的治療方案,防止和減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。