電刺激對軟骨細胞增殖及細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

劉小利,李慧娟

(1長治醫(yī)學院基礎醫(yī)學部物理教研室,長治 046000;2長治醫(yī)學院中心實驗室)

骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是目前常見的一種骨關節(jié)疾病,其發(fā)病與軟骨細胞的凋亡密切相關。由于軟骨細胞增殖能力低下,在常規(guī)體外培養(yǎng)條件下,軟骨細胞在經(jīng)過一定的倍增后會逐漸喪失增殖能力從而停止分裂,應用藥物刺激等生物化學方法可以使細胞增殖,但細胞的生物學特性將發(fā)生改變[1,2]。因此,體外培養(yǎng)軟骨細胞的過程中,在提高軟骨細胞增殖能力的同時并保持細胞正常的生理功能是目前面臨的一個難題[3]。目前已知,在體外培養(yǎng)細胞過程中應用外加電刺激的方式可以影響細胞增殖[4],且電場對細胞增殖的影響具有“窗口效應”[5],但對體外培養(yǎng)的軟骨細胞施加電刺激時所用的波形、頻率、電壓、刺激時間等條件以及在不同條件下電刺激對軟骨細胞增殖的影響并無詳細闡述。

早在1977年,Kaiser等[6]發(fā)現(xiàn)在糖皮質(zhì)激素誘導胸腺細胞的凋亡過程中,出現(xiàn)了Ca2+內(nèi)流增強,其他實驗也表明對于大多數(shù)細胞由于細胞內(nèi)鈣離子濃度增加,細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑被激活從而誘發(fā)了細胞凋亡[7-9],但是也有實驗認為細胞凋亡是由于細胞內(nèi)鈣離子濃度降低導致的[10],而細胞增殖的同時細胞內(nèi)鈣離子濃度顯著增高[11]。因此,在體外培養(yǎng)軟骨細胞過程中,細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化和細胞增殖之間的關系仍有待進一步確認。

本文使用函數(shù)信號發(fā)生器采用不同的電刺激參數(shù)對體外培養(yǎng)的大兔軟骨細胞予以電刺激,使用CCK-8試劑檢測細胞增殖,為體外培養(yǎng)軟骨細胞增殖尋求合適的電刺激參數(shù);使用Fluo-3 AM對細胞熒光染色后利用多功能酶標儀檢測細胞內(nèi)的Ca2+濃度,明確細胞內(nèi)Ca2+濃度是如何隨著電刺激參數(shù)的改變而變化的,進而確定軟骨細胞增殖與Ca2+濃度之間的關系,并探討Ca2+濃度變化對細胞增殖影響的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

3-5日齡家兔肋骨軟骨細胞(武漢原生原代生物科技有限公司,PriCells),低糖DMEM培養(yǎng)基(含L-谷氨酰胺,丙酮酸鈉,HyClone,美國),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),0.25%胰蛋白酶(HyClone,美國),青霉素-鏈霉素溶液(青霉素的含量為10 kU/ml,鏈霉素的含量為10 mg/ml)、CCK-8試劑盒、鈣離子熒光探針Fluo-3 AM(碧云天生物技術有限公司)。CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo 3111,美國),倒置顯微鏡(OLYMPUS DP26,日本),臺式離心機(BECKMAN Microfuge22R,美國),多功能酶標儀(TECAN Infinite M200,瑞士),函數(shù)信號發(fā)生器(SDG1005,深圳市鼎陽科技有限公司),213型鉑片電極(6 mm×2 mm×0.15 mm,上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)與傳代

軟骨細胞培養(yǎng):將購買的原代家兔肋軟骨細胞置于37 ℃,CO2含量5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。細胞培養(yǎng)液選用低糖DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s modi-fied eagle medium,DMEM)+20%胎牛血清+1%的雙抗(青霉素+鏈霉素)。觀察軟骨細胞貼壁及生長情況,待軟骨細胞相互融合生長至90%時,進行傳代。

1.3 電刺激裝置

用SDG1005型函數(shù)信號發(fā)生器對體外培養(yǎng)的軟骨細胞進行電刺激,可根據(jù)實驗要求調(diào)整電刺激信號的輸出波形,電壓幅值、頻率等參數(shù)。鉑是惰性金屬,化學性質(zhì)穩(wěn)定,在實驗過程中鉑電極附近不會產(chǎn)生影響細胞生長的副反應。實施電刺激之前,將鉑電極經(jīng)高壓滅菌處理,一端與函數(shù)信號發(fā)生器的CH1通道輸出線相連,另一端插入6孔細胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。

1.4 實驗分組

將第2代軟骨細胞隨機分組,血細胞計數(shù)板計數(shù),將細胞按照4×104/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi),于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h進行電刺激實驗。實驗共分5組,設置電刺激參數(shù)為:方波波形,占空比20%,頻率1 Hz,每24 h刺激20 min,連續(xù)刺激3 d。按刺激電壓大小分為電壓1 V組,電壓2 V組,電壓3 V組,電壓5 V組和電壓0 V的無刺激組。在超凈工作臺中分別對電壓1 V,2 V,3 V,5 V各組細胞施加電刺激,刺激完畢后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。無刺激組只插入電極但不進行電刺激。每日在電刺激之前通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)和生長情況,根據(jù)情況更換培養(yǎng)液。

1.5 細胞增殖檢測

采用CCK-8法檢測細胞增殖。連續(xù)電刺激3 d,將各組細胞于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)生長24 h取出培養(yǎng)板,將每組細胞分別用0.25%的胰蛋白酶消化為1 ml的單細胞懸液,接種于96孔,每組均設10個復孔,確保每孔細胞懸液均為100 μl。放入培養(yǎng)箱12 h,分別于各孔中加入10 μl CCK-8試劑,震蕩均勻后繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h,用酶標儀于450 nm波長處檢測各組細胞的吸光度(OD值)。

1.6 細胞內(nèi)Ca2+濃度測定

實驗之前配置Fluo-3 AM溶液,將Fluo-3 AM溶于無水DMSO,終濃度為5 μmol/L,-20 ℃避光保存。同樣取連續(xù)電刺激3 d的細胞,將細胞放入培養(yǎng)箱生長24 h,將每組細胞分別用0.25%的胰蛋白酶消化為1 ml的單細胞懸液,接種于黑色96孔板,每組設10個復孔,每孔100 μl細胞懸液。待細胞貼壁后,小心吸取各孔內(nèi)的細胞培養(yǎng)液,將細胞用DPBS洗滌2次,加入Fluo-3 AM溶液1 μl,將細胞放入37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min進行熒光探針裝載。再次用DPBS洗滌細胞,去除多余的Fluo-3 AM。使用Infinite M200多功能酶標儀測定細胞內(nèi)Ca2+濃度,用I-Control軟件分析并讀取熒光值,選擇板型為96孔黑板,測量方式為頂部測量,激發(fā)波長488 mm,發(fā)射波長526 nm。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 細胞增殖檢測

CCK-8檢測各組細胞吸光度值(OD值)。刺激電壓1 V,2 V,3 V和5 V的各組細胞吸光度值分別為0.594 3±0.031,0.633 1±0.025,0.773 5±0.020和0.142 5±0.011,無刺激組的細胞吸光度值為0.581 3±0.014。檢測結果表明,占空比20%的方波波形,采用頻率1 Hz,每日刺激20 min,連續(xù)刺激3 d的情況下,當刺激電壓分別為1 V,2 V,3 V時,細胞的吸光度值隨著電壓升高而增加,表明適當?shù)碾姶碳た梢蕴岣唧w外軟骨細胞增殖。電壓1 V組與無刺激組相比,細胞數(shù)量略有增加,但是差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05),電壓2 V和3 V組細胞與無刺激組細胞相比數(shù)量增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中電壓3 V組細胞增殖顯著(P<0.01)。但是當刺激電壓增大到5 V時,細胞吸光度值反而遠低于無刺激組(P<0.01),對細胞增殖有抑制作用。

2.2 細胞形態(tài)觀察

連續(xù)電刺激3 d,使用倒置顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài)。電壓1 V組細胞與無刺激組相比,細胞數(shù)量和形態(tài)都沒有明顯差別;電壓2 V組細胞與無刺激組相比,細胞的形態(tài)規(guī)則,數(shù)量略有增加;電壓3 V組與無電刺激組相比細胞分布密集,數(shù)量明顯增多,且細胞的形態(tài)規(guī)則成梭形,透光度好;電壓5 V組細胞分布密度小,數(shù)目明顯減少,形態(tài)呈不規(guī)則的多角形,生長狀態(tài)不佳(見圖1)。

A.電壓1 V; B.電壓2 V; C.電壓3 V; D.電壓5 V; E.電壓0 V圖1 電刺激3 d的細胞 (×10)Figure 1 Effect of electrical stimulation for 3 d on chondrocytes (×10)

2.3 細胞內(nèi)Ca2+濃度

取生長良好的電壓1 V,2 V,3 V和無刺激組的細胞進行Ca2+濃度測定。測得各組細胞Ca2+濃度分別為31.57±5.21,36.58±4.50,55.65±5.45和31.36±4.29。結果表明電壓為1 V,2 V,3 V時,各組細胞的胞內(nèi)Ca2+濃度隨著電壓升高而增加。電壓1 V組細胞與無刺激組細胞的胞內(nèi)Ca2+濃度基本無差別,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。電壓2 V組和電壓3 V組細胞的胞內(nèi)Ca2+濃度均比無刺激組細胞胞內(nèi)Ca2+濃度高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中電壓3 V組細胞的胞內(nèi)Ca2+濃度與無刺激組細胞相比明顯提高(P<0.01)。由于測定的Ca2+濃度值反映的是Fluo-3與細胞內(nèi)的Ca2+結合后的熒光強度,且熒光強度與Ca2+濃度呈正比。本實驗在用Fluo-3 AM加載細胞時,每孔細胞液的體積相等,因此,測定的細胞Ca2+濃度值越高,反映該組細胞數(shù)目越多?？梢缘贸鼋Y論,在施加電刺激之后電壓1 V,2 V和3 V的各組細胞數(shù)目隨著電壓的升高而增加,當電壓為3 V時細胞增殖最為顯著。

3 討論

對于不同類型的細胞,電刺激促進細胞增殖的具體參數(shù)是不同的[12,13]。本文實驗結果證實使用占空比為20%的方波波形,電壓3 V,頻率1 Hz,每日刺激20 min連續(xù)刺激3 d,可以明顯促進體外軟骨細胞增殖(P<0.01)。Vaca-Gonz?lez等[14]的實驗表明4 mV/cm的電場作用30 min,軟骨細胞增殖是由于細胞膜去極化引起的。Brighton等[15]的研究表明20 mV/cm的電場可使軟骨細胞增加50%,Wang等[16]在進一步研究中闡明該電場可提高軟骨細胞蛋白多聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的合成。但是Akanji等[17]利用三維軟骨細胞-瓊脂糖模型系統(tǒng)研究直流電對細胞增殖和基質(zhì)合成的實驗表明電場對細胞增殖、蛋白質(zhì)合成和mRNA表達水平?jīng)]有影響。本文認為只有周期性變化電場對軟骨細胞有影響,而直流電或者波形變化無規(guī)律的電場對軟骨細胞增殖可能不起作用。

作為細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的第二信使,Ca2+具有調(diào)節(jié)細胞功能、參與細胞信號跨膜傳遞和介導細胞對外界刺激的應答等重要作用[18]。Ca2+在正常狀態(tài)下主要存在于細胞外,細胞內(nèi)游離的Ca2+含量很低。Beit-Or等[10]在測定體外培養(yǎng)的雞骺軟骨細胞增殖分化的實驗中表明,在軟骨細胞老化過程中細胞內(nèi)游離Ca2+含量逐漸下降,根據(jù)軟骨生長因子引起的Ca2+濃度下降與細胞分化增強的關系,認為Ca2+濃度升高可導致軟骨細胞增殖。Rodan等[19]的實驗也表明電刺激促進軟骨細胞增殖是由于外界周期性電場對細胞形成微擾導致細胞Ca2+內(nèi)流,進而促進軟骨細胞DNA合成導致的。本文認為在體外培養(yǎng)軟骨細胞過程中,適宜的電刺激使得軟骨細胞外的Ca2+內(nèi)流從而導致細胞內(nèi)Ca2+濃度升高,軟骨細胞可能通過電壓門控型鈣通道(L型)的開放導致Ca2+內(nèi)流,使細胞內(nèi)的Ca2+濃度增高[20],具體過程為在外加周期性電場作用下,細胞膜去極化從而激活電壓門控型Ca2+通路,導致Ca2+內(nèi)流,而細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加又加速了細胞膜的復極化,從而促進軟骨細胞增殖。

綜上所述,本實驗結果表明適宜的電刺激信號可以促進軟骨細胞增殖,并且軟骨細胞增殖能力的提高與Ca2+密不可分,關于不同參數(shù)的電刺激信號,如電刺激波形、刺激頻率、刺激時長等對細胞增殖的影響及其生物學機制還有待進一步研究,為軟骨損傷相關疾病的治療與康復提供一定的實驗依據(jù)。