山莨菪堿預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注誘發(fā)多器官損傷的影響

周榮勝,薛小紅,李小剛,畢 陽,何 平,王 強

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科,西安 710061;2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液凈化科)

肝切除、肝移植等手術(shù)中常出現(xiàn)肝缺血/再灌注的操作,肝缺血/再灌注過程不僅造成肝本身的損傷,而且對遠(yuǎn)隔器官如肺、腎、腸道、心肌等造成損傷[1]。山莨菪堿為M膽堿受體拮抗劑,具有改善微循環(huán)作用、改善血管內(nèi)皮通透性和組織氧攝取等作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)山莨菪堿對生命重要器官如腦、肝、腎、心等器官的缺血再灌注損傷具有良好的保護作用[2]。本研究制作70%肝臟缺血再灌注損傷大鼠模型,以山莨菪堿進(jìn)行預(yù)處理,旨在探討山莨菪堿預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注誘發(fā)多器官損傷的影響,為臨床防治提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

鹽酸消旋山莨菪堿注射液(天津金耀氨基酸有限公司,批號:1409051);7600大型全自動化生化分析儀(日立公司,日本);大鼠TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(美國R&D公司);MDA、MPO和SOD試劑盒購自南京生物建成工程研究所;圖像采集系統(tǒng)、光學(xué)顯微鏡等由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)實驗室提供。

1.2 動物分組和模型制備

雄性SD大鼠60只,清潔級,6-8周齡,體質(zhì)量210-280 g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心(生產(chǎn)許可證:SYXK陜2014-003)提供,分別為假手術(shù)組(CON組)、肝臟缺血再灌注組(IR組)和山莨菪堿預(yù)處理組(ANI組),每組20只。CON組:大鼠開腹后分離肝門不做結(jié)扎;IR組:大鼠開腹后結(jié)扎肝門,阻斷肝血流60 min后,開放血流3 h后處死大鼠;ANI組:結(jié)扎肝門即阻斷肝血流前30 min,自尾靜脈注射稀釋成1 ml的山莨菪堿(2 mg/kg),其余同IR組,阻斷肝血流60 min。CON組和IR組自尾靜脈注射1 ml的生理鹽水。

按Nauta等[3]的方法制作70%肝缺血再灌注大鼠模型:術(shù)前禁食12 h,自由飲水,腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠,仰臥位固定于操作臺上。經(jīng)陰莖背靜脈注入稀釋肝素(200 U/kg),使其肝素化。自腹下部沿正中線縱行向上剪開皮膚,直至胸腹交界處。逐層打開腹腔,分離肝門及肝十二指腸韌帶,尋找到肝門,IR組和ANI組用小動脈夾夾閉肝左葉和肝中葉部分肝門,60 min后松開小動脈夾肝臟恢復(fù)血流,然后逐層關(guān)閉腹腔,3 h后處死大鼠。CON組只解剖肝門不作血管夾閉。

1.3 標(biāo)本的采集

大鼠處死前,取下腔靜脈血,分離血清,-20 ℃保存,用于檢測ALT、AST、BUN、CRE、TNF-α和IL-6。大鼠處死后,取肝左葉、右肺上葉、左腎上極和部分回腸組織置于10%中性甲醛浸泡固定,用于HE染色和免疫組化,檢測MDA、MPO含量和SOD活性。

1.4 組織形態(tài)學(xué)觀察(HE染色)

取部分肝、肺、腎和回腸組織經(jīng)過脫蠟,水化,染色,脫水,透明,封片,在100倍光鏡下觀察其組織病理形態(tài)學(xué)變化,采集圖像。

1.5 生化指標(biāo)檢測

采用全自動化生化分析儀檢測血清ALT、AST、BUN和CRE的濃度。

1.6 肝、肺、腎和回腸組織MDA、MPO含量和SOD活性的測定

取部分肝、肺、腎和回腸組織50 mg用冷生理鹽水制成肺組織勻漿,4 ℃ 3 000 r/min離心10 min,上清-80 ℃保存,檢測前再次離心取上清;分別采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量、黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性和過氧化氫還原法測定MPO活性,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.7 ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6表達(dá)

取部分保存好的血清,再次離心取上清;采用大鼠TNF-α ELISA試劑盒和IL-6 ELISA試劑盒測定TNF-α、IL-6的表達(dá),嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 光鏡下肝、肺、腎和回腸組織病理學(xué)變化

CON組肝、肺、腎和回腸結(jié)構(gòu)完整,未見明顯的異常;IR組肝、肺、腎和回腸血管充血,可見紅色滲出液,組織間水腫,有大量炎性細(xì)胞浸潤;ANI組肝、肺、腎和回腸可見充血水腫,肺間質(zhì)增厚有炎性細(xì)胞浸潤,但較IR組輕(見圖1-4)。

2.2 生化指標(biāo)變化

與CON組比較,IR組和ANI組血清ALT、AST、BUN和CRE濃度顯著增高(P<0.05);與IR組相比較,ANI組血清ALT、AST、BUN和CRE濃度顯著降低(P<0.05,見表1)。

A. CON組B. IR組 C. ANI組圖1 光鏡下三組肝組織病理學(xué)變化 (×100)Figure 1 Histopathological changes of liver tissues under light microscope in three groups (×100)

A. CON組B. IR組 C. ANI組圖2 光鏡下三組肺組織病理學(xué)變化 (×100)Figure 2 Histopathological changes of lung tissues under light microscope in three groups (×100)

A. CON組B. IR組 C. ANI組圖3 光鏡下三組腎組織HE染色結(jié)果 (×100)Figure 3 Histopathological changes of kidney tissues under light microscope in three groups (×100)

A. CON組B. IR組 C. ANI組圖4 光鏡下三組回腸組織HE染色結(jié)果 (×100)Figure 4 Histopathological changes of ileum tissues under light microscope in three groups (×100)

2.3 肝、肺、腎和回腸組織MDA含量、MPO和SOD活性變化

與CON組比較,IR組和ANI組肝、肺、腎和回腸組織MDA含量、MPO活性顯著增高(P<0.05),SOD活性顯著降低(P<0.05);與IR組相比較,ANI組肝、肺、腎和回腸組織MDA含量、MPO活性顯著降低(P<0.05),SOD活性顯著增高(P<0.05,見表2)。

表1 肝腎功能生化指標(biāo)變化的比較Table 1 Comparison of biochemical indexes of liver and kidney function among three

與CON組比較,*P<0.05;與IR組比較,#P<0.05

表2 肝、肺、腎和回腸組織MDA含量、MPO和SOD活性變化比較Table 2 Comparison of MDA content, MPO and SOD activities in liver, lung, kidney and ileum among three

與同一臟器CON組比較,*P<0.05;與同一臟器IR組比較,#P<0.05

2.4 血清TNF-α、IL-6濃度變化

與CON組比較,IR組和ANI組血清TNF-α、IL-6濃度顯著增高(P<0.05);與IR組相比較,ANI組血清TNF-α、IL-6濃度顯著降低(P<0.05,見表3)。

表3 血清TNF-α、IL-6濃度變化比較Table 3 Comparison of serum concentrations of TNF-α and IL-6 among three

與CON組比較,*P<0.05;與IR組比較,#P<0.05

3 討論

肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)是肝臟外科手術(shù)如肝部分切除、肝移植等臨床治療過程中常見并發(fā)癥,也是引發(fā)患者肝移植失敗、肝功能衰竭及愈后較差的關(guān)鍵因素。HIRI過程中產(chǎn)生大量活性氧自由基、炎性因子和內(nèi)毒素移位,造成肝細(xì)胞本身發(fā)生損傷的同時,也會使遠(yuǎn)隔臟器受到缺血/再灌注過程的損傷,如肺、腎、小腸、胰腺、腎上腺和心肌等重要器官,可能進(jìn)一步導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征[4]。HIRI的病理生理機制是多組織器官、多種因素、多種學(xué)科交叉關(guān)聯(lián)并相互制約的復(fù)雜過程,氧化應(yīng)激反應(yīng)、代謝障礙、細(xì)胞凋亡、活化細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)等被認(rèn)為參與其主要過程,產(chǎn)生的有害細(xì)胞因子是非特異性的,它們作用于全身各個器官,影響它們的功能,甚至出現(xiàn)不可逆的損傷,進(jìn)而出現(xiàn)多器官功能障礙的級聯(lián)反應(yīng)[5]。研究發(fā)現(xiàn),HIRI能加重大鼠肺損傷,導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng),上調(diào)肺組織中的HO-1及iNOS表達(dá)[6]。本實驗研究結(jié)果顯示,與CON組比較,IR組和ANI組肝、肺、腎和回腸組織HE染色病理改變顯著加重,IR組和ANI組血清AST、ALT、BUN、CRE、TNF-α和IL-6含量及肝、肺、腎和回腸組織MDA含量、MPO活性顯著增高,SOD活性顯著降低;表明肝缺血再灌注引起肝臟病理改變和肝功能受損的同時,產(chǎn)生了大量的炎性因子,造成了肺、腎和回腸的損傷。

山莨菪堿是提取自茄科植物山莨菪中的一種生物堿,與阿托品等莨菪烷類藥物同屬于M膽堿受體拮抗劑[7]。主要用于治療胃腸道痙攣收縮所引起的腹痛、感染中毒性休克等[8]。近年來研究證實山莨菪堿對多個器官缺血-再灌注損傷具有良好的保護作用[9]。有研究發(fā)現(xiàn)山莨菪堿可降低多器官功能障礙綜合征(MODS)的發(fā)生率,其機制可能是通過減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)損傷和改善血管通透性,從而減輕組織和肺水腫,改善肺氧合功能和組織氧攝取、氧代謝,降低組織細(xì)胞的缺氧而減輕或延遲器官功能損傷和MODS的發(fā)生[10]。有研究顯示,山莨菪堿聯(lián)合烏司他丁能有效抑制危重型多發(fā)傷患者炎癥反應(yīng),保護重要臟器功能[11]。山莨菪堿可能通過抑制細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1等的釋放,抑制中性粒細(xì)胞聚集和氧自由基的產(chǎn)生、穩(wěn)定細(xì)胞膜和溶酶體膜、改善和疏通微循環(huán)等作用,對重要器官缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用[12]。實驗結(jié)果顯示,山莨菪堿能減輕ANI組肝臟病理改變和降低血清AST、ALT、TNF-α和IL-6含量,表明山莨菪堿對缺血再灌注的肝臟具有保護作用。山莨菪堿是否對HIRI過程中多器官損傷具有保護作用,目前還沒有報道。因此,本實驗首先建立70%肝臟缺血再灌注損傷大鼠模型,探討山莨菪堿預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注誘發(fā)多器官損傷的保護作用。

本研究參照文獻(xiàn)[13,14]確定山莨菪堿劑量為2 mg/kg進(jìn)行預(yù)處理,實驗結(jié)果顯示,與IR組比較,ANI組肝、肺、腎和回腸組織病理改變較IR組輕,ANI組血清AST、ALT、BUN、CRE、TNF-α和IL-6含量及肝、肺、腎和回腸組織MDA含量、MPO活性顯著降低,SOD活性顯著升高。表明山莨菪堿預(yù)處理不僅能減輕肝臟缺血再灌注后肝臟本身功能受損,還能減輕肺、腎和回腸功能損傷,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥因子的釋放,對肝臟和遠(yuǎn)隔器官都具有一定的保護作用。

綜上所述,山莨菪堿預(yù)處理可減輕大鼠肝缺血再灌注誘發(fā)的多器官損傷,其機制可能與其抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制過度炎癥反應(yīng)有關(guān)。但肝缺血再灌注多器官損傷是一個多環(huán)節(jié)構(gòu)成、多因素參與的復(fù)雜過程,是否存在其他方面的因素,有待進(jìn)一步研究。