Drp1在高糖高脂誘導心肌細胞凋亡中的作用及其機制

張玉秀,錢志鑫,郭文昀,焦丕奇,梁素梅,荊 哲*

(1中國人民解放軍蘭州總醫(yī)院心血管內(nèi)科,蘭州 730050;2空軍軍醫(yī)大學生理教研室;*通訊作者,E-mail:35082774@qq.com)

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病患者主要心臟并發(fā)癥之一[1],也是糖尿病患病心血管疾病發(fā)病率居高不下的重要原因之一[2]。線粒體是細胞生存與代謝的重要細胞器之一,在細胞的生物學功能中發(fā)揮重要作用[3]。近期研究發(fā)現(xiàn),線粒體功能的紊亂與糖尿病心肌病的發(fā)生及發(fā)展密切相關,被認為是糖尿病心肌病心肌損傷的重要原因之一[4]。而其中線粒體融合與分裂這一動態(tài)平衡的穩(wěn)定,對于維持線粒體自身生物學功能至關重要[5]。

動力相關蛋白1(Drp1)是一種介導線粒體分裂的蛋白,又被稱為DLP1(dynamin-like protein 1),該蛋白屬于GTP酶系,結構為N端具有GTP酶結構域,C端為GTP酶效應結構域,中間為Dynamin同源結構域。Drp1主要分布于細胞漿中,但其結構中的一部分在線粒體管狀結構上呈點狀分布,為線粒體的分裂位點[6]。荊哲等[7]的研究證實,經(jīng)過免疫組化染色結果發(fā)現(xiàn)Drp1在心肌細胞線粒體上也同樣表達存在。

雖然,已有研究證實在心血管病相關事件中存在著線粒體分裂與融合的動力學改變[8],但目前有關線粒體動力學相關研究在糖尿病心肌病中的報道較少[9]。荊哲等[7]的研究證實,在糖尿病動物模型db/db小鼠心肌組織中Drp1的表達低于野生組,且隨年齡的增長表達逐漸降低。然而在糖尿病心肌病中,Drp1表達的改變及是否會對線粒體的生物學功能產(chǎn)生影響,并影響糖尿病心肌病心肌細胞生物學功能的報道較少。因此,本研究在前期研究的基礎上,在細胞水平采用高糖/高脂培養(yǎng)H9C2心肌細胞為模型,以此探討Drp1對于糖尿病心肌病患者心肌細胞損傷及線粒體功能的影響,期望進一步揭示糖尿病心肌病的發(fā)生及發(fā)展機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要試劑

H9C1(2-1)大鼠胚胎心肌細胞系購自中科院上海生命科學研究院。胎牛血清購自杭州四季青公司。Trizol購自美國Invitrogen公司。反轉錄及實時定量PCR檢測試劑盒購自TaKaRa公司。JC-1檢測試劑盒購自中國碧云天公司。胰酶、葡萄糖、甘露醇及軟質酸鈉購自美國Sigma公司。Mito-Sox染色試劑購自美國Invitrogen公司。DRP1抗體購自美國Santa cruz公司,β-actin抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購自武漢三鷹公司。增強型化學發(fā)光(ECL)液購自美國Advansta公司、聚偏氟乙烯(PVDF)購自美國Millipore公司。腺病毒Ad-Drp1及對照組腺病毒購自上海吉凱公司。流式細胞儀為美國BD公司BDIS品牌產(chǎn)品。

1.2 H9C2(2-1)大鼠胚胎心肌細胞的培養(yǎng)

H9C2細胞培養(yǎng)分為4組,均培養(yǎng)24 h。① 正常+空白腺病毒組(Con+Ad-EV):培養(yǎng)基中含5 mmol/L葡萄糖、20 mmol/L甘露醇和Ad-EV空白對照病毒;② 正常+Drp1過表達腺病毒組(Con+Ad-Drp1):培養(yǎng)基中含5 mmol/L葡萄糖、20 mmol/L甘露醇和Ad-Drp1過表達病毒;③ 高糖/高脂組+Ad-EV組(HGHF+Ad-EV):培養(yǎng)基中含25 mmol/L葡萄糖、500 μmol/Lol/L軟脂酸鈉和Ad-EV空白對照病毒;④ 高糖/高脂+Ad-Drp1組(HGHF+Ad-Drp1):培養(yǎng)基中含25 mmol/L葡萄糖、500 μmol/L軟脂酸鈉和Ad-Drp1過表達病毒。應用含100 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng),當細胞大約長至培養(yǎng)瓶面積80%左右時,用2.5 g/L胰酶消化,接種到6孔板中。在實驗前1 d,細胞培養(yǎng)換為20 ml/L胎牛血清培養(yǎng),以使細胞向心肌細胞分化,最后對心肌細胞進行處理。

1.3 心肌細胞感染實驗

按照吉凱公司腺病毒包裝說明,以Ad-Drp1 MOI值為120,Ad-EV MOI值為50,分別感染實驗各分組H9C2心肌細胞。37 ℃培養(yǎng)48 h;換新鮮不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至24 h,熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達后,停止干預進行后續(xù)的實驗檢測。

1.4 Drp1 mRNA水平的檢測

采用Trizol法提取心肌細胞的總RNA后反轉錄為cDNA。采用qRT-PCR法檢測,嚴格按照PCR檢測試劑盒的說明書操作。擴增Drp1基因的引物序列上游為:5′-CGTAGTGGGAACGCAGAG-3′,下游為5′-ACAGGCACCTTGGTCATT-3′;擴增內(nèi)參GAPDH基因的引物序列上游為:5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′,下游為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。

1.5 Western blot檢測Drp1蛋白表達水平

用PBS清洗細胞3次,用細胞刮將細胞刮下,嚴格按照蛋白提取試劑盒說明書提取細胞蛋白后進行聚丙烯凝膠電泳(10%分離膠,5%濃縮膠),80 V進行上層膠電泳,120 V進行下層膠電泳2 h,采用濕轉的法將蛋白轉移到PVDF膜上(100 V恒壓,1 h)。5%脫脂奶粉搖床室溫封閉1 h,DRP1抗體稀釋比例為1 ∶500,β-actin抗體稀釋比例為1 ∶3 000,4 ℃封閉過夜,兔二抗IgG抗體室溫孵育2 h,采用化學發(fā)光試劑盒進行檢測,獲得顯影條帶。

1.6 流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率

收集各組心肌細胞,900 r/min離心5 min,將細胞濃度調整至1×106個/ml。經(jīng)AnnexinⅤ/PI雙染色,流式細胞儀檢測,通過計數(shù)凋亡區(qū)細胞數(shù),得出心肌細胞的凋亡率。

1.7 MitoSOXTM染色檢測心肌細胞線粒體ROS的生成

檢測前1 d將H9C2心肌細胞消化后,進行細胞計數(shù),按照5×105個細胞/孔接種到共聚焦專用培養(yǎng)皿中,常規(guī)過夜培養(yǎng)。按照1 ∶1 000用HBSS/Ca2+/Mg2+或者PBS稀釋MitoSOX,終濃度為5 μmol/L。加入500 μl工作液,充分覆蓋細胞,37 ℃避光孵育10 min[10]。另取一個培養(yǎng)皿,加500 μl HBSS/Ca2+/Mg2+,同樣條件孵育作為陰性對照。去除MitoSOX工作液,使用溫HBSS/Ca2+/Mg2+輕微清洗3次。使用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 高糖/高脂對心肌細胞Drp1表達的誘導作用

H9C2心肌細胞經(jīng)過高糖/高脂(HGHF)培養(yǎng)后,RT-PCR檢測結果表明,與正常+空白腺病毒組(Con+Ad-EV)相比,高糖/高脂+Ad-EV組(HGHF+Ad-EV)Drp1的mRNA水平顯著降低(P<0.01),Western blot檢測結果表明與正常+空白腺病毒組(Con+Ad-EV)相比,高糖/高脂+Ad-EV組(HGHF+Ad-EV)Drp1的蛋白表達水平較正常對照組明顯減少(見圖1)。

A. Drp1的mRNA表達水平(n=3) B. Drp1的蛋白表達水平圖1 H9C2心肌細胞高糖/高脂培養(yǎng)后Drp1的表達水平Figure 1 Expression levels of Drp1 mRNA and protein in H9C2 cardiomyocytes after high glucose/high fat culture

2.2 上調Drp1抑制心肌細胞凋亡

為了進一步明確Drp1對于高糖/高脂環(huán)境下H9C2心肌細胞凋亡的影響,本研究分別在正常組及高糖/高脂培養(yǎng)的基礎上,對細胞進行了腺病毒感染,上調Drp1表達水平,采用流式細胞儀(采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙標記)檢測了處理后的H9C2心肌細胞的凋亡率。結果表明,與正常+Ad-Drp1組比較,高糖/高脂+Ad-EV組H9C2心肌細胞的凋亡率顯著升高(P<0.05),Drp1表達減少(P<0.01),高糖/高脂+Ad-Drp組較高糖/高脂+Ad-EV組相比,心肌細胞凋亡數(shù)量明顯降低(P<0.01,見圖2)。這一結果提示,在高糖/高脂環(huán)境下Drp1對H9C2心肌細胞具有保護作用。

2.3 Drp1對HGHF誘導的心肌細胞內(nèi)ROS生成的調節(jié)

與正常+Ad-EV組相比,正常+Ad-Drp1組中心肌細胞ROS的生成減少(P<0.05),高糖/高脂+Ad-EV組及高糖/高脂+Ad-Drp1組心肌細胞中ROS的水平明顯升高(P<0.01),與高糖/高脂+Ad-EV組比較,高糖/高脂+Ad-Drp1組心肌細胞的ROS水平下降(P<0.01,見圖3)，恢復到了正常+Ad-EV組水平。

3 討論

目前,心血管疾病已經(jīng)成為發(fā)展中國家及發(fā)達國家共同面對的巨大問題[11]。糖尿病是心力衰竭的重要危險因素,糖尿病心肌病是一種以心肌結構和功能的改變?yōu)樘攸c,同時不伴有冠狀動脈粥樣硬化病變及高血壓的疾病。早期主要表現(xiàn)為心肌順應性下降和舒張功能不全,晚期以收縮功能不全為主要表現(xiàn),嚴重時可發(fā)展為充血性心力衰竭[12, 13]。體內(nèi)長期處于高糖高脂環(huán)境引起心肌細胞線粒體功能障礙,是導致糖尿病心肌病發(fā)生的主要原因之一[13]。

圖2 Drp1抑制HGHF培養(yǎng)后H9C2心肌細胞凋亡情況 (n=6)Figure 2 Cardiomyocyte apoptosis of H9C2 after HGHF and upregulation of Drp1 (n=6)

圖3 Drp1對HGHF培養(yǎng)后H9C2心肌細胞ROS生成的調節(jié) (n=6)Figure 3 Effect of Drp1 on ROS production in H9C2 cardiomyocytes cultured with HGHF (n=6)

線粒體是細胞生存與代謝的重要細胞器之一,在細胞的生物學功能中發(fā)揮重要作用[3]。線粒體功能異常會導致細胞生物學功能紊亂,從而誘導細胞發(fā)生凋亡[14],與糖尿病心肌病的發(fā)生及發(fā)展密切相關。線粒體分裂融合在細胞“生死”中發(fā)揮重要作用,其調控機制對線粒體功能及細胞活性的影響是近年研究的熱點[15]。線粒體生物學活性與糖尿病心肌病的發(fā)生密切相關,是心肌損傷的重要原因之一[16]。已有研究證實在心血管病相關事件中存在著線粒體分裂與融合的動力學改變[8],而介導線粒體分裂的蛋白Drp1在心肌細胞線粒體上也同樣表達存在。荊哲等[7]的研究表明,Drp1在db/db糖尿病小鼠中的表達較野生組明顯降低,提示糖尿病心肌病的發(fā)生可能與Drp1的改變密切相關[10]。為了進一步探究Drp1在心肌細胞中的作用,本研究對Drp1的表達及其對心肌細胞凋亡的影響進行了更深層次的研究,以期對糖尿病心肌病的發(fā)病機制提供新的線索。

本研究采用高糖高脂誘導心肌細胞以模擬糖尿病心肌病中的高糖/高脂環(huán)境,首先檢測了Drp1 mRNA及蛋白的表達水平,并通過腺病毒感染心肌細胞上調Drp1的表達水平后,采用流式細胞術檢測細胞凋亡水平,結果表明上調Drp1的表達可明顯抑制心肌細胞凋亡,對心肌細胞具有保護作用,同時Drp1也可明顯抑制心肌細胞內(nèi)ROS的生成。

研究認為,ROS生成增多可明顯促進心肌細胞凋亡[17]。本研究結果表明高糖高脂刺激心肌細胞可引起Drp1表達減少,在高糖/高脂環(huán)境下,上調Drp1表達對H9C2心肌細胞凋亡及ROS生成具有抑制作用,從而保護心肌。由此可推測,心肌中Drp1改變可能引起心肌細胞內(nèi)ROS的生成,從而影響心肌細胞凋亡,最終導致糖尿病心肌病的發(fā)生。由于實驗條件等的限制,本研究并未進一步探究Drp1與ROS之間是否存在相關性及二者之間可能存在的具體信號通路機制。同時,還需要進一步明確Drp1參與的心肌細胞凋亡途徑是內(nèi)源性還是外源性凋亡途徑。