姜黃素通過抑制心肌組織炎癥反應(yīng)改善自身免疫性心肌炎大鼠的心功能

王麗君,霍建華,張衛(wèi)萍,張 勇,王 晨,周 娟,袁祖貽,郜珊珊*

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,西安 710061;2陜西省分子心臟病學(xué)重點實驗室;3環(huán)境與疾病相關(guān)教育部重點實驗室;*通訊作者,E-mail:gaoshanshj@163.com)

實驗性自身免疫性心肌炎(experimental autoimmune myocarditis,EAM)，簡稱自身免疫性心肌炎，是一種炎癥免疫性疾病,主要由T細胞介導(dǎo),在疾病的進展過程中,其釋放的多種炎性物質(zhì)吸引巨噬細胞、肥大細胞等多種炎性細胞及其分泌的炎癥細胞因子參與[1,2]。EAM可由感染性或非感染性因素導(dǎo)致,感染性因素最常見的是病毒感染,如柯薩奇病毒、巨細胞病毒、流感病毒等。病毒導(dǎo)致心肌炎的主要機制包括:病毒對心肌的直接毒性作用;病毒激活體內(nèi)的T淋巴細胞,由其介導(dǎo)并導(dǎo)致心肌細胞中大量炎性細胞浸潤;病毒誘導(dǎo)心肌細胞發(fā)生凋亡[3,4]。

姜黃素是中國傳統(tǒng)中藥姜黃的主要活性成分,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗凝、降血脂、改善胰島素抵抗等多種藥理學(xué)作用[5]。研究發(fā)現(xiàn),姜黃素能夠改善心力衰竭大鼠以及兔的心功能狀態(tài)[6,7],另外有研究表明,姜黃素能夠減輕心肌梗死大鼠模型心肌缺血再灌注損傷[8],而姜黃素是否能夠改善自身免疫性心肌炎大鼠心功能,且該作用是否與姜黃素的抑制炎癥作用有關(guān),目前尚未完全研究清楚,因此本研究采用大鼠后足墊注射豬心肌免疫球蛋白建立自身免疫性心肌炎大鼠模型,觀察姜黃素干預(yù)是否能夠抑制心肌組織炎癥反應(yīng)從而延緩自身免疫性心肌炎大鼠心臟結(jié)構(gòu)變化,并改善其心功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

6周齡SPF級雄性Lewis大鼠18只,體質(zhì)量230-280 g,購自北京維通利華實驗動物有限公司(生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0011)。姜黃素、豬心肌肌球蛋白、弗氏完全佐劑、DAPI均購自美國Sigma公司;玉米油購自中國長壽花食品股份有限公司;伊紅、蘇木素購自美國Amresco公司;OCT包埋劑購自上海Leica有限公司。

免疫大鼠所用抗原佐劑乳化液由豬心肌肌球蛋白和弗氏完全佐劑乳化后獲得。制備方法為:兩個注射器分別吸取等量豬心肌肌球蛋白和弗氏完全佐劑(含有1 mg/ml的結(jié)核分枝桿菌),連接到三通管其中的兩頭上,兩個注射器不斷配合對推,每次對推3 min,對推8-10次后檢查是否達到完全乳化，完全乳化的豬心肌肌球蛋白呈乳白色,將其滴入水平面后不會擴散,若乳化不完全則繼續(xù)對推直至完全乳化。整個操作過程在冰上進行,乳化液在1 h內(nèi)完成注射。

1.2 自身免疫性心肌炎大鼠模型的建立

18只大鼠隨機分為對照組(Con組),模型組(EAM組)及姜黃素處理組(Cur組),每組6只。對照組(Con組):實驗第0天和第7天,后足墊皮下注射弗氏完全佐劑(左右后足墊各0.1 ml),同時每天以玉米油灌胃;模型組(EAM組):實驗第0天和第7天,后足墊皮下注射抗原佐劑乳化液(左右后足墊各0.1 ml),每天以玉米油灌胃;姜黃素處理組(Cur組):實驗第0天和第7天,后足墊皮下注射抗原佐劑乳化液(左右后足墊各0.1 ml),每天給予姜黃素[50 mg/(kg·d)]灌胃,共21 d。大鼠飼養(yǎng)在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心SPF級實驗動物房,自由飲水、自由攝食,普通SPF級無菌飼料喂養(yǎng)直至實驗結(jié)束。

1.3 心動超聲檢測大鼠心臟結(jié)構(gòu)與功能

姜黃素干預(yù)21 d,實驗第22天,腹腔注射90 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg甲苯噻嗪的混合溶液麻醉大鼠,心動超聲檢查大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化,測量內(nèi)容包括:心率(heart rat,HR),左室收縮末內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter,LVEDs),左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS),射血分數(shù)(ejection fraction,EF),左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPW),左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd)。由一位經(jīng)驗豐富超聲專業(yè)醫(yī)生測定心動超聲指標,各項測量值均取5個連續(xù)心動周期采樣獲得的平均值。

1.4 實時定量PCR(RT-PCR)檢測心肌炎癥相關(guān)指標IL-1β、iNOS、MMR、KLF-4、Arg-1的表達

取大鼠心肌組織,提取RNA并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GUSB為內(nèi)參,行RT-PCR檢測各因子表達。核酸引物序列由上海捷瑞基因公司合成(見表1)。

表1 炎癥相關(guān)因子RT-PCR核酸引物序列Table 1 Primer sequences of inflammation-related factors for real-time PCR

1.5 蘇木素-伊紅染色(HE染色)觀察大鼠心肌炎癥細胞浸潤程度并計算HE染色病理評分

取大鼠整個心臟,生理鹽水沖洗,4%多聚甲醛固定,25%蔗糖溶液中脫水,待脫水完全,濾紙吸干水分,OCT復(fù)合物包埋,冰凍切片。從心尖部開始向心底部連續(xù)橫切,切片厚度為8 μm。HE染色,200倍和400倍熒光顯微鏡掃描,隨機觀察3個不重疊病變區(qū)域,并對病變區(qū)域進行評分:0分,正常心肌組織;2分,心肌組織有病變,且病變區(qū)域超過橫切面的1%但小于10%;3分,心肌組織有病變,且病變區(qū)域超過橫切面的10%但小于50%;4分,心肌組織病變超過橫切面的50%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對EAM大鼠心率的影響

實驗第22天,麻醉大鼠后行心動超聲檢查,EAM組大鼠心率較Con組大鼠明顯增快(445.5±8.00vs564±10.93,P<0.01),提示大鼠心功能惡化。給予50 mg/(kg·d)姜黃素灌胃后,Cur組大鼠較EAM組大鼠心率明顯下降(564±10.93vs479.7±11.56,P<0.01),提示大鼠心功能改善。

數(shù)值以均數(shù)±標準誤表示;與Con組比較,**P<0.01;與EAM組比較,##P<0.01圖1 姜黃素對EAM大鼠心率的影響Figure 1 Effect of curcumin on the heart rate of EAM rats

2.2 姜黃素對EAM大鼠左室結(jié)構(gòu)及功能的影響

超聲心動圖的結(jié)果顯示,與Con組相比,EAM組大鼠LVEDd和LVPW無顯著變化,但LVFS和EF顯著降低,LVEDs顯著增加,這表明心肌炎大鼠出現(xiàn)左心室收縮功能障礙。Cur組大鼠LVFS和EF較EAM組大鼠明顯改善,LVEDs明顯縮小,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),表明姜黃素能夠改善心肌炎引起的左心室收縮功能障礙。

表2 大鼠心臟超聲結(jié)果及血液動力學(xué)改變Table 2 Echocardiographic and hemodynamic parameters of the

EF:射血分數(shù);LVEDs:左室收縮末內(nèi)徑;LVEDd:左室舒張末內(nèi)徑;LVFS:左室短軸縮短率;LVPW:左室后壁厚度;與Con組比較,**P<0.01;與EAM組比較,##P<0.01

2.3 姜黃素對EAM大鼠心肌細胞炎癥因子表達的影響

炎性細胞因子IL-1β和iNOS表達的水平能夠反映細胞或組織炎性狀態(tài)。RT-PCR結(jié)果顯示,EAM組大鼠心肌細胞中IL-1β和iNOS表達顯著升高,提示心肌炎大鼠心肌細胞內(nèi)的高炎癥狀態(tài)。給予姜黃素干預(yù)后,二者表達明顯降低(P<0.01)。與對照組相比,Cur組大鼠心肌組織炎性因子的表達差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 姜黃素對EAM大鼠心肌細胞抗炎因子表達的影響

RT-PCR結(jié)果顯示:EAM組大鼠心肌細胞內(nèi)MMR、Arg-1及KLF-4的表達均較Con組降低降低,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。給予姜黃素干預(yù)21 d,Cur組大鼠心肌組織MMR和Arg-1的表達較Con組及EAM組明顯升高(P<0.01)。Cur組大鼠KLF-4表達與Con組差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與EAM組大鼠相比,其表達明顯升高(P<0.05,見圖3)。

2.5 姜黃素對EAM大鼠心肌炎癥細胞浸潤程度的影響

HE染色顯示,Con組大鼠心肌組織中炎性細胞浸潤較少;EAM組大鼠心肌中有大量炎性細胞浸潤。姜黃素干預(yù)后,Cur組大鼠心肌組織中炎性細胞浸潤明顯減少(見圖4)。與Con組相比,EAM組HE染色病理評分升高(0.57±0.34vs5±1.0,P<0.01)。雖然與Con組相比,Cur組HE染色的病理評分仍有增加(0.57±0.34vs1.36±0.56,P<0.05),但與EAM組相比,Cur組大鼠心肌組織HE染色的病理評分明顯降低(5±1.0vs1.36±0.56,P<0.01),提示姜黃素可顯著減少心肌炎大鼠心肌組織炎性細胞的浸潤。

數(shù)值以均數(shù)±標準誤表示;與Con組比較,**P<0.01;與EAM組比較,##P<0.01圖2 RT-PCR檢測姜黃素對EAM大鼠心肌細胞炎癥因子表達的影響Figure 2 Effect of curcumin on expression of inflammatory factors in myocardium of EAM rat by RT-PCRs

數(shù)值以均數(shù)±標準誤表示;與Con組比較,*P<0.05,**P<0.01;與EAM組比較,#P<0.05,##P<0.01圖3 RT-PCR檢測姜黃素對EAM大鼠心肌細胞抗炎因子表達的影響Figure 3 Effect of curcumin on expression of anti-inflammatory factors in myocardium of EAM rats by RT-PCR

A. Con組 B. EAM組 C. Cur組圖4 姜黃素對EAM大鼠心肌炎癥細胞浸潤程度的影響 (×200)Figure 4 Effect of curcumin on infiltration of inflammatory cells in EAM rats (×200)

3 討論

本實驗采用經(jīng)典的心肌炎造模方法,使用純化的豬心肌免疫球蛋白,利用其高度的種屬特異性,觸發(fā)機體免疫反應(yīng),誘導(dǎo)自身免疫的發(fā)生,最終導(dǎo)致心肌損害。對心肌炎造模后大鼠行心動超聲檢查,可見大鼠HR加快,EF值下降,LVEDs明顯升高,大鼠心功能惡化,提示造模成功。

姜黃素能夠抑制心肌纖維化,改善左室重構(gòu)的作用已在多項研究中證實,涉及的機制也是多方面的。Morimoto等[9]分別以鹽敏感高血壓大鼠心衰模型和大鼠心肌梗死后心衰模型為研究對象,給予姜黃素干預(yù)后,結(jié)果提示姜黃素能夠降低大鼠B型尿鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)表達、顯著改善大鼠心室壁厚度、延緩左室收縮功能障礙;體外研究證實,姜黃素發(fā)揮上述作用主要是通過破壞p300/GATA4復(fù)合物的形成而實現(xiàn)的,而后者正是心肌肥厚及左心室重塑過程中的關(guān)鍵復(fù)合物。另外一組研究者[10]在姜黃素作用于小鼠的心衰模型中觀察到類似的機制。Guo等[11]通過實驗證實姜黃素通過抑制TGF-β1產(chǎn)生和經(jīng)典Smad信號傳導(dǎo),并通過阻斷AMPK/p38MAPK途徑,抑制糖尿病大鼠心肌組織中Ⅰ型與Ⅲ型膠原合成,從而改善大鼠心功能。

IL-1β及iNOS是經(jīng)典的炎癥因子,二者在心肌炎大鼠心肌組織內(nèi)表達顯著升高,提示大鼠體內(nèi)的高炎性狀態(tài)。給予姜黃素灌胃處理后,IL-1β和iNOS的表達顯著下降,Sharma等[12]在帕金森大鼠模型中也觀察到姜黃素抑制炎癥因子IL-1β和iNOS表達的作用。MMR、Arg-1、KLF-4是具有抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫、促進組織重塑與修復(fù)作用的細胞因子,能夠拮抗促炎因子的作用[13]。本研究觀察到姜黃素能夠顯著促進上述抗炎因子的表達,提示組織細胞內(nèi)炎癥狀態(tài)的改善。HE染色同樣證實:心肌炎大鼠心肌組織中炎性細胞浸潤較對照組明顯增加,姜黃素能夠顯著減少心肌組織內(nèi)浸潤的炎性細胞數(shù)量。

iNOS和Arg-1功能完全相反的精氨酸代謝酶類。iNOS作用L-精氨酸產(chǎn)生NO;Arg-1與iNOS競爭性作用底物L(fēng)-精氨酸,催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化為脯氨酸和多胺,并抑制iNOS介導(dǎo)的細胞毒性作用及氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的細胞損傷。心動超聲結(jié)果顯示姜黃素干預(yù)后EAM大鼠左室收縮末內(nèi)徑明顯減小,而舒張末內(nèi)徑并無明顯變化,提示姜黃素主要改善心肌炎大鼠的心臟收縮功能,對其舒張功能的改善并不明顯。這有可能是因為Arg-1促進L-精氨酸轉(zhuǎn)化為脯氨酸,后者能夠參與到膠原形成過程中并導(dǎo)致纖維化[14]。該結(jié)果提示長期及高劑量姜黃素的臨床應(yīng)用應(yīng)該尤其注意其因為促進心肌纖維化帶來的副作用。

綜上所述,本研究以自身免疫性心肌炎大鼠為研究對象,給予姜黃素灌胃處理,研究結(jié)果提示姜黃素能夠通過減少EAM大鼠心肌炎癥因子表達、促進抗炎因子表達、減少EAM心肌炎癥細胞的浸潤從而減慢EAM大鼠心率、增加心臟射血分數(shù)、改善其心臟收縮功能。目前心肌炎尚無特效治療方法,本實驗觀察到姜黃素對心肌炎的改善作用,為心肌炎的臨床治療提供了新的思路。