Survivin基因在胃癌癌前病變不同中醫(yī)證型中的表達(dá)

付兆媛 汪龍德 毛蘭芳

通過檢測(cè)胃癌癌前病變患者三種不同中醫(yī)證型（脾虛氣滯證、陰虛內(nèi)熱證、胃絡(luò)瘀阻證）胃黏膜組織中抑癌基因Survivin的表達(dá)。探討中醫(yī)證型與Survivin表達(dá)之間的相關(guān)性。方法：實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組。對(duì)照組為24位健康體檢者的正常胃組織標(biāo)本，試驗(yàn)組為不同中醫(yī)證型組（脾胃虛弱證、陰虛內(nèi)熱證、胃絡(luò)瘀阻證）。故共有4組（健康對(duì)照組、脾胃虛弱證組、陰虛內(nèi)熱證組、胃絡(luò)瘀阻證組）；每位患者取新鮮胃黏膜6塊進(jìn)行HE染色、免疫組化及RT-PCR。結(jié)果：Survivin基因陽性表達(dá)在脾虛氣滯證中有30.0%，陰虛內(nèi)熱證中有38.3%，胃絡(luò)瘀阻證中有31.7%，健康對(duì)照組無表達(dá)；Ⅰ型腸化生無表達(dá)，Ⅱ型腸化生表達(dá)2.63%，Ⅲ型腸化生表達(dá)39.47%。異型增生表達(dá)10.53%。結(jié)論：胃黏膜組織凋亡相關(guān)基因Survivin基因的表達(dá)與胃癌癌前病變病理類型有關(guān)，而且在胃癌癌前病變不同中醫(yī)證型的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？蔀槲赴┌┣安∽兊闹嗅t(yī)證型客觀化提供依據(jù)。

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在各種惡性腫瘤中發(fā)病率排在第二位，在我國每年新增癌癥中位居第四位，是一個(gè)嚴(yán)重影響國人健康的公共衛(wèi)生問題。而在甘肅省特別是武威地區(qū)胃癌的發(fā)生率又明顯高于全國水平，因此胃癌診治一直是我院消化內(nèi)科研究的重點(diǎn)。國內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可的胃癌發(fā)病模式為：萎縮性胃炎一腸化生一異型增生一胃癌。眾所周知，目前醫(yī)學(xué)的發(fā)展對(duì)中晚期胃癌治療效果仍不理想，所以早診早治，是提高胃癌存活率的唯一有效措施。而對(duì)胃癌的早期診治主要依賴于對(duì)胃癌前期變化進(jìn)行早期干預(yù)治療。胃癌癌前變化包括癌前狀態(tài)和癌前病變。癌前狀態(tài)為臨床概念，指胃癌前期疾病，如慢性萎縮性胃炎等。癌前病變（PLGC，Preca-ncerous lesions of gastric carcinoma）為病理概念，包括腸化生（Intestinal metap-lasia，IM）、不典型增生或稱異型增生（Dysplasia，Dys）?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)PLGC的逆轉(zhuǎn)或阻斷效果不佳，中醫(yī)藥強(qiáng)調(diào)治未病、未病先防，針對(duì)其病因病機(jī)，運(yùn)用辨證論治的特點(diǎn)，采用藥物、針灸、穴位貼敷等綜合治療，在改善臨床癥狀，改善和逆轉(zhuǎn)胃黏膜病變有顯著優(yōu)勢(shì)。本研究旨在探討胃癌癌前病變患者中醫(yī)分型與Survivin表達(dá)的相關(guān)性，為臨床的辨證治療提供一定的幫助，并有可能為中醫(yī)規(guī)范化辨證治療提供具體的量化指標(biāo)。

一、資料與方法

（一）一般情況

收集2015年1月至2016年12月甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診及住院PLGC患者120例，其中男性76例，女性44例，年齡36～76歲，平均年齡為56.48歲。其中年齡/>60歲33例，<60歲87例；門診健康體檢者24例作為對(duì)照組，其中男性15例，女性9例，平均年齡53.24歲，男女比例在性別年齡上無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。

（二）診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：

（1）臨床表現(xiàn)：主要癥狀主要表現(xiàn)為非特異性消化不良，上腹部脹滿不適、疼痛；可伴有食欲不振、嘈雜、惡心、反酸、曖氣、口苦等癥狀，少數(shù)患者還可有乏力、消瘦、健忘、抑郁、焦慮等全身甚或精神癥狀。

（2）病理診斷標(biāo)準(zhǔn)：

腸腺化生：胃黏膜表層上皮細(xì)胞中出現(xiàn)分泌酸性黏液的杯狀細(xì)胞，有紋狀緣的吸收上皮細(xì)胞和潘氏（Paneth）細(xì)胞等。腸化生上皮有杯狀細(xì)胞和吸收上皮細(xì)胞者稱為完全化生，只有杯狀細(xì)胞者為不完全化生。不完全化生中又可根據(jù)其黏液組化反應(yīng)，氧乙?；僖核彡栃哉邽榇竽c型不完全化生，陰性者則為小腸型不完全化生。不完全性大腸型化生與腸型胃癌的發(fā)生關(guān)系密切。

異型增生：指胃黏膜上皮和腺體的一類偏離正常分化，形態(tài)和機(jī)能上呈異型性表現(xiàn)的增生性病變?？砂l(fā)生在胃小凹上皮和腸化生處，具有較高的癌變傾向，但無間質(zhì)侵犯。國際上通行的做法是分為低、高兩級(jí)別，高級(jí)別異性增生癌變率高。

2.中醫(yī)證型標(biāo)準(zhǔn)：

依據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》，（1）脾胃虛弱證：胃痛隱隱，綿綿不休，時(shí)輕時(shí)重，喜溫喜按，空腹痛甚，得食則緩，乏力納差，舌淡苔白，脈細(xì)弱。兼有氣滯證：胃脘痞滿，嘔吐，惡心，暖氣等癥。（2）陰虛內(nèi)熱證：胃脘隱隱灼痛，嘈雜，饑不欲食，煩渴思飲，口燥咽干，食少，大便秘結(jié)，舌紅少苔，脈細(xì)數(shù)或細(xì)弦。（3）胃絡(luò)瘀阻證：胃脘痛如針刺或刀割，痛處固定，拒按，舌質(zhì)紫暗或瘀斑，脈澀。

（三）病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

1納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）符合西醫(yī)臨床診斷和病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)胃鏡檢查病理診斷為腸化生和不典型增生；（2）符合中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn)。中醫(yī)證型屬于脾胃虛弱證、陰虛內(nèi)熱證、胃絡(luò)瘀阻證其中一種者；（3）受試者年齡在30～80歲之間；（4）無合并嚴(yán)重心腦血管疾病及全身器質(zhì)性疾??；（5）向患者交代研究過程，取得同意簽署知情同意書。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）心、肝、腎功能明顯異常；（2）急性胃炎、慢性胃炎（淺表性或者萎縮性無腸型化生及無異型增生的胃炎）、胃癌及轉(zhuǎn)移癌的患者；（3）中醫(yī)證型兩型并見無主次之分或三型并見證型復(fù)雜者；（4）資料不全或不完整者。

（四）實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，對(duì)照組為24位健康體檢者的正常胃組織標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)組為不同中醫(yī)證型組（脾胃虛弱證、陰虛內(nèi)熱證、胃絡(luò)瘀阻證）。

（五）實(shí)驗(yàn)方法

與納入標(biāo)準(zhǔn)相符的患者簽署胃鏡檢查（取活檢）知情同意書，每位患者取胃體、胃竇和胃角的胃黏膜各2塊，組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋及切片，進(jìn)行HE染色及免疫組化。

免疫組化法步驟：①取用4%多聚甲醛固定的胃黏膜組織進(jìn)行石蠟包埋；②玻片撈取切片，恒溫箱60℃烤片過夜；③二甲苯及梯度酒精常規(guī)脫蠟至水；④0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（PH6.0）熱修復(fù)抗原；⑤3%H2O2滅活；⑥滴加5%BSA封閉液孵育，滴加稀釋的一抗4℃過夜；⑦滴加二抗及SABC，37℃孵育15分鐘；⑧DAB顯色10分鐘，蘇木素復(fù)染5分鐘，鹽酸酒精脫分化；⑨脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。病理醫(yī)師進(jìn)行染色結(jié)果判斷，陽性反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)：Survivin基因表達(dá)為胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顆粒，少部分也可見于細(xì)胞核，陽性細(xì)胞占10%以上為陽性表達(dá)，<10%為陰性。

RT-PCR技術(shù)步驟：①于一周內(nèi)取-80℃儲(chǔ)存的胃黏膜組織提取RNA；②將RNA反轉(zhuǎn)錄DNA；③將酶、水、DNA中的目的基因、引物，依次加入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增；④跑膠：電泳儀中跑膠，檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

引物序列及擴(kuò)增條件

根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)人Survivin引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

CCK引物序列：F：5′ATGGCC-GAGGCTGGCTTCATCCAC3′，R：5′TTGTAGTTTGTGCTATTCT-GTGAATTA3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度304bp，擴(kuò)增條件：94℃ 5min，94℃ 30s，60℃30s，72℃60s，35個(gè)循環(huán)，72℃7min。

β-actin引物序列：F：5′AA-CACCCAGCCATGTACGTTG′，R：5′ CGGATGTCCACGTCA-CACTTCAT′，產(chǎn)物長(zhǎng)度509bp。GAPDH退火溫度60℃，30個(gè)循環(huán)。

（六）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均在SPSS19.0軟件包下進(jìn)行分析，多組資料陽性率（%）的比較采用卡方檢驗(yàn)（x2檢驗(yàn)），并采用Bonferroni法進(jìn)行組間多重比較分析，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，p<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

（一）PLGC病理類型與中醫(yī)證型的關(guān)系

120例PLGC患者中醫(yī)分型脾胃虛弱證、陰虛內(nèi)熱證、胃絡(luò)瘀阻證分別為36例，46例，38例，IM在脾虛氣滯證、陰虛有熱證、胃絡(luò)瘀阻證中分別有7例、9例、6例，Dys在脾虛氣滯證、陰虛有熱證、胃絡(luò)瘀阻證中分別有5例、10例、11例，而同時(shí)有IM和Dys分別有24例、27例、21例。IM、Dys、IM&Dys在各組間的比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

（二）survivin在不同病理組織中的表達(dá)

Survivin基因在120例PLGC病例中陽性表達(dá)38例（31.67%），其中在腸腺化生中表達(dá)16例（42.11%），異型增生22例（57.89%），在Ⅰ型腸化生中無表達(dá)，Ⅱ型腸化生中表達(dá)1例（2.63%），Ⅲ型腸化生中15例（39.47%），異型增生輕度表達(dá)4例（10.53%），異型增生重度18例（47.37%）。Ⅲ型腸化生和重度不典型增生與其他組比較有顯著性差異（P<0.01），但兩組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），健康對(duì)照組、Ⅰ型腸化生、Ⅱ型腸化生、輕度不典型增生組間比較（p>0.05），無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表2）。

（三）Survivin在PLGC不同中醫(yī)證型胃黏膜的表達(dá)

1.免疫組化法SP法檢測(cè)Sur-vivin的表達(dá)

從表2可以看出，脾虛氣滯證、陰虛有熱證、胃絡(luò)瘀阻證胃黏膜survivin基因蛋白表達(dá)陽性者分別為4例（11.11%）、14例（30.43%）和20例（52.63%），脾虛氣滯證與對(duì)照組比較無明顯差異（p>0.05），陰虛有熱證較脾虛氣滯證和對(duì)照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。而胃絡(luò)瘀阻證較脾虛氣滯證和對(duì)照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。胃絡(luò)瘀阻證與陰虛內(nèi)熱證比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）（見表3）（附圖）。

2.RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Survivin-的水平

由圖1、2示對(duì)照組、各證型組β-actin mRNA均有表達(dá)，而Sur-vivin mRNA在a、b道無表達(dá)，c、d道有表達(dá)，c、d與對(duì)照組Survivin mR-NA的表達(dá)有顯著性差異（p<0.01）。

三、討論

祖國醫(yī)學(xué)中并沒有“胃癌前期變化”這一病名，根據(jù)其胃脘痞滿、疼痛、食欲減退、曖氣、泛酸等臨床癥狀特征，可將其歸于中醫(yī)“胃痛”“痞證”等范疇。本病病位在胃脘，病變臟腑主要在脾胃，早在《內(nèi)經(jīng)》中對(duì)上述疾病的病因病機(jī)就有論述，其病因主要與飲食不節(jié)、嗜好煙酒、情志不節(jié)、郁思惱怒、素體虛弱、勞倦內(nèi)傷、或用藥不當(dāng)、久病體虛等有關(guān)。對(duì)于該病的辨證分型，各個(gè)醫(yī)家認(rèn)識(shí)雖有不同，但基本同意濕熱內(nèi)蘊(yùn)是其常見證型，如楊維佳等選擇了近5年來50篇辨證治療慢性萎縮性胃炎的臨床研究文獻(xiàn)，共計(jì)5107例，辨證分型共29型，其中肝胃不和型939例；胃陰不足型902例；中虛氣滯型844例；脾胃虛寒型418例；脾胃虛弱型411例；脾胃濕熱型268例；其余分型所占比例都在5%以下。李衛(wèi)強(qiáng)[8-9]從絡(luò)病論治胃癌前病變，認(rèn)為陰血不足，絡(luò)脈瘀滯在胃癌前病變的形成中起到關(guān)鍵作用。他指出Hp感染是癌前病變的發(fā)病關(guān)鍵。中國中西醫(yī)結(jié)合研究會(huì)消化系統(tǒng)疾病專業(yè)委員會(huì)于2011年10月在天津最后討論審定了《慢性胃炎中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)意見》將本病分為六型：肝郁氣滯、肝胃郁熱、脾胃濕熱、胃絡(luò)瘀阻、脾胃虛寒及胃陰不足證?？傊蠖嘀嗅t(yī)專家均認(rèn)為慢性萎縮性胃炎的病因病機(jī)復(fù)雜，其產(chǎn)生主要為“毒邪”所致，致病因素中的物理、化學(xué)等因素均屬于“毒邪”范疇且人體內(nèi)的濕熱、瘀血等病理產(chǎn)物日久可生毒。我院在古方“平胃散”的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研發(fā)的院內(nèi)制劑中成藥“平胃膠囊”，療效頗豐。經(jīng)過大量臨床、實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，其可以清除Hp，改善PLGC黏膜炎癥，促進(jìn)萎縮腺體的恢復(fù)，并在一定程度上可以治療、改善胃黏膜的腸化生或不典型增生，一定程度上達(dá)到預(yù)防胃癌發(fā)生的目的。因此中醫(yī)證型及中醫(yī)藥對(duì)PLGC的研究具有必要性。

胃癌的演變是一個(gè)多基因、多步驟、多途徑參與的復(fù)雜生物學(xué)過程。在此過程中有多種基因發(fā)生結(jié)構(gòu)和表達(dá)的異常，涉及多種癌基因、抑癌基因、生長(zhǎng)因子及其受體、細(xì)胞黏附分子及DNA修復(fù)基因等的異常積累。Survivin基因是1997年由耶魯大學(xué)Altieri等發(fā)現(xiàn)的一種抗凋亡因子，是凋亡抑制因子家族（inhibitor of apoptosis protein，IAP）的新成員。Kania等報(bào)道，在正常的胃黏膜中survivin mRNA有極低度表達(dá)，但無survivin蛋白表達(dá)。在癌組織和癌前組織中，survivin mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著升高；survivin由于其特殊的作用及特異性的組織分布，以及其抑制細(xì)胞凋亡的功能活性，使其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用。已被視為早期胃癌診斷和治療的重要靶點(diǎn)。PTEN是一種腫瘤抑制基因，可以抑制腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，加速細(xì)胞凋亡，阻止細(xì)胞增殖；當(dāng)PTEN表達(dá)減弱或缺乏時(shí)，可使胃黏膜上皮易于發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，在胃癌發(fā)展中起一定作用。PTEN通過刺激CDX-2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)CDX-2的表達(dá)，提示在腸上皮化生至腸型胃癌的轉(zhuǎn)變中PTEN對(duì)CDX-2的表達(dá)可能起到一定的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)研究證明survivin是STAT3信號(hào)通路的一個(gè)下游基因，STAT3-Survivin信號(hào)通路等各種信號(hào)傳導(dǎo)通路與腫瘤關(guān)系的密切。同時(shí)Survivin與PTEN均參與細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡，在胃癌的發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，兩者作用環(huán)節(jié)一致，但生物學(xué)效應(yīng)相反。隨著癌前病變向胃癌的發(fā)展，Survivin基因表達(dá)增高，而PTEN蛋白表達(dá)減低，Survivin與PTEN在異型增生和胃癌組織中的表達(dá)存在負(fù)性相關(guān)。

本研究從Survivin在胃癌癌前病變不同中醫(yī)證型中的表達(dá)及在不同病理類型中的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示它們之間存在相關(guān)性，在陰虛內(nèi)熱證、胃絡(luò)瘀阻證、Ⅲ型腸化生、異型增生中Survivin基因的陽性表達(dá)率明顯升高，說明癌變的概率較高，臨床治療中應(yīng)對(duì)此類疾病更加重視。PLGC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，課題組從Survivin基因作了初步的研究，希望能夠?yàn)榕R床提供更準(zhǔn)確的立法方藥，為提高臨床療效提供科學(xué)的依據(jù)。因此，從中醫(yī)藥入手防治胃癌癌前病變，阻止其向胃Ca發(fā)展，是減少胃Ca發(fā)生率的有效措施。