基于整合藥理學(xué)平臺的六味地黃丸治療糖尿病的分子機(jī)制研究

張佳琪，唐仕歡，李德鳳，張 毅，蘇 瑾，劉 楊，張艾嘉，王 萍,，王喜軍

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心，哈爾濱 150040；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

六味地黃方最早出自宋代錢乙所著的《小兒藥證直訣》一書，由熟地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、茯苓、澤瀉6味藥組成[1]，是滋陰補(bǔ)腎的中醫(yī)經(jīng)典名方。六味地黃丸具有“三補(bǔ)三瀉”的特點(diǎn)：熟地黃滋陰補(bǔ)腎，澤瀉利水滲濕，瀉腎水；山茱萸溫澀肝經(jīng)，牡丹皮涼肝瀉火；山藥健脾固腎，茯苓滲濕健脾。六味合用，為“三補(bǔ)三瀉”之良劑，滋陰補(bǔ)腎之名方[2]。主要用于腎陰虛引起頭暈耳鳴，腰膝酸軟，骨蒸潮熱，盜汗遺精，消渴等癥狀。近年來，除了其傳統(tǒng)的滋陰補(bǔ)腎應(yīng)用外，還對糖尿病、高血壓、抗腫瘤、更年期綜合征等有大量的臨床應(yīng)用報道[3-5]。

糖尿病屬中醫(yī)“消渴”范疇，而消渴多以陰虛為本，六味地黃丸具有較好的滋陰補(bǔ)腎和降低血糖的作用，在治療糖尿病方面應(yīng)用最為廣泛且取得了較大的進(jìn)展，方中各藥均有降糖的功效，療效確切[6-8]。但由于中藥復(fù)方的復(fù)雜性，其治療糖尿病的分子機(jī)制尚未得到完全闡釋。

中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床治療的主要方法和手段，以多成分作用于多靶點(diǎn)產(chǎn)生藥效，探索中藥復(fù)方的化學(xué)物質(zhì)實體和與機(jī)體生命活動的交互規(guī)律，科學(xué)地闡釋復(fù)方藥效的科學(xué)內(nèi)涵，是中醫(yī)藥理論研究的難點(diǎn)，也是中醫(yī)藥理論研究的關(guān)鍵科學(xué)問題。中藥整合藥理學(xué)以多學(xué)科交叉融合為基礎(chǔ)，廣泛應(yīng)用到中藥有效成分辨識、配伍理論、分子機(jī)制等方面[9]。整合藥理學(xué)強(qiáng)調(diào)宏觀與微觀、整體與局部、體內(nèi)ADME過程與活性評價、虛擬計算與實驗驗證的整合，擬解決的關(guān)鍵問題之一就是探索中藥復(fù)方的化學(xué)物質(zhì)實體與機(jī)體相互作用規(guī)律，系統(tǒng)闡釋中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)[10]。

為進(jìn)一步發(fā)展整合藥理學(xué)研究新方法和技術(shù)，完善研究體系，拓展其在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所聯(lián)合北京大學(xué)藥學(xué)院、中國科學(xué)院相關(guān)機(jī)構(gòu)構(gòu)建中藥整合藥理學(xué)平臺(http://www.tcmip.cn/)。中藥整合藥理學(xué)平臺是以中醫(yī)藥大數(shù)據(jù)(中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫、中藥材數(shù)據(jù)庫、中藥方劑數(shù)據(jù)庫、疾病癥狀靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫)為基礎(chǔ)，以人工智能、數(shù)據(jù)模建和挖掘、網(wǎng)絡(luò)科學(xué)等為技術(shù)手段，在中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、分子機(jī)制探討、質(zhì)量控制、中藥新藥研發(fā)以及中藥臨床精準(zhǔn)用藥等方面有較好的應(yīng)用，通過建立“中藥方劑-化學(xué)成分-作用靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)”多維度關(guān)聯(lián)的有效工具，揭示中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其分子機(jī)制，為揭示中醫(yī)原創(chuàng)思維的科學(xué)價值和名醫(yī)經(jīng)驗傳承提供技術(shù)支撐[11]。

本研究借助整合藥理學(xué)平臺(http://www.tcmip.cn/)，探討六味地黃丸治療糖尿病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其分子機(jī)制，為六味地黃丸有效成分辨識及其質(zhì)量控制、分子機(jī)制與臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分來源

在整合藥理學(xué)平臺(http://www.tcmip.cn/)，收集中藥材“地黃”“山藥”“山茱萸”“茯苓”“澤瀉”“牡丹皮”的所有化學(xué)成分，建立六味地黃丸的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

1.2 候選靶標(biāo)來源

在整合藥理學(xué)平臺疾病/證候靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫，以“diabetes mellitus” “diabetes”“diabetic”作為疾病或癥狀關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，勾選檢索出來的所有靶標(biāo)，作為候選的疾病靶標(biāo)。

1.3 靶標(biāo)預(yù)測

對中藥靶標(biāo)預(yù)測界面建立的化學(xué)成分庫中的成分進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)相似性對比，選取相似性分?jǐn)?shù)大于等于0.8的成分預(yù)測靶標(biāo)作為六味地黃丸作用的潛在靶標(biāo)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息(PPI)

六味地黃丸作用的潛在靶標(biāo)與糖尿病疾病靶標(biāo)之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息(PPI)，通過整合藥理學(xué)平臺的PPI數(shù)據(jù)庫獲得，該平臺鑲嵌了HAPPI、Reactome、OPHID、InAct、HPRD、MINT、DIP、PDZBase等數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過整合藥理學(xué)平臺網(wǎng)絡(luò)分析模塊，針對六味地黃丸作用的潛在靶標(biāo)與糖尿病疾病靶標(biāo)之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息計算網(wǎng)絡(luò)特征值，以“節(jié)點(diǎn)連接度(degree)”的2倍中位數(shù)為卡值，選取中藥靶標(biāo)-疾病基因互作網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)(hubs)；在此基礎(chǔ)上，以“degree”“節(jié)點(diǎn)緊密度(closeness)”和“節(jié)點(diǎn)介度(betweenness)”的中位數(shù)為卡值，選取同時滿足3個卡值的節(jié)點(diǎn)為中藥方劑矯正疾病失衡網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。然后，對關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行通路富集分析，選取P-Value前30的通路，構(gòu)建“中藥方劑-中藥材-化學(xué)成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”的多層次關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，并對關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)和多層次關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。

1.6 基因功能和通路富集分析

基因功能和通路富集分析在整合藥理學(xué)評價進(jìn)行，相關(guān)信息來自于GO數(shù)據(jù)庫(http://www. geneontology.org)和KEGG通路數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, http://www.genome.jp/kegg/)。

2 結(jié)果與分析

2.1 六味地黃丸化學(xué)成分靶標(biāo)預(yù)測

地黃收集化學(xué)成分38個共預(yù)測出690個靶標(biāo)，山茱萸收集化學(xué)成分72個預(yù)測出774個靶標(biāo)，山藥收集化學(xué)成分61個預(yù)測出1 091個靶標(biāo)，牡丹皮收集化學(xué)成分15個預(yù)測出11個靶標(biāo)，茯苓收集化學(xué)成分33個預(yù)測出747個靶標(biāo)，澤瀉收集化學(xué)成分31個預(yù)測出117個靶標(biāo)，各味中藥共有靶標(biāo)情況見表2。

表1 “中藥-成分-靶標(biāo)”基本信息Tab.1 The information of traditional Chinese medicine-compound-taget

地黃主要化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜及其他糖苷類、氨基酸、微量元素等，已有研究表明，地黃寡糖可以降低糖尿病大鼠的血糖血脂水平[12]，而且對高胰島素誘發(fā)的HepG 2細(xì)胞胰島素抵抗具有明顯改善作用[13]。

山茱萸主要化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜類、鞣質(zhì)類、黃酮類等，有文獻(xiàn)報道山茱萸總萜可通過抑制α-葡萄糖苷酶減少糖類吸收，通過非胰島素依賴途徑發(fā)揮其降糖作用[14-15]，山茱萸環(huán)烯醚萜總苷可顯著抑制AGEs誘導(dǎo)的大鼠腎系膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)，對糖尿病腎病也具有一定保護(hù)作用[16]。

山藥主要化學(xué)成分有皂苷、糖、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、多種氨基酸等，山藥最主要的藥用成分是山藥多糖，目前已有研究表明山藥多糖具有修復(fù)和保護(hù)胰島細(xì)胞的作用，并且能夠降低顯著血清中胰高血糖素水平[17]。

牡丹皮主要化學(xué)成分有丹皮酚、丹皮酚苷類、黃酮類、多糖、鞣質(zhì)等，有文獻(xiàn)報道牡丹皮多糖可顯著降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖，改善糖耐量降低[18]，牡丹皮苷/酚可通過抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Smad2/3，P38MARK通路活化從而達(dá)到對糖尿病腎病大鼠腎損傷的保護(hù)作用[19]。

茯苓主要化學(xué)成分有茯苓多糖、三萜類化合物甾醇、脂肪、腺嘌呤等，其中茯苓多糖能有效降低Ⅱ型糖尿病小鼠血糖、血清胰島素和胰高血糖素水平，并且對糖尿病引起的脂質(zhì)代謝紊亂有一定改善作用[20]。

澤瀉主要化學(xué)成分5種三萜類化合物，另有揮發(fā)油、小量生物堿、天門冬素、甾醇、脂肪酸、蛋白質(zhì)等，已有文獻(xiàn)報道澤瀉具有能夠降低大鼠空腹血糖，調(diào)節(jié)糖、脂代謝，從而達(dá)到治療糖尿病的功效[21-22]。

2.2 六味地黃丸治療糖尿病的核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)、基因功能和通路富集分析

2.2.1 核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析

通過整合藥理學(xué)分析的網(wǎng)絡(luò)分析模塊，基于PPI相互作用數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建六味地黃丸藥物組合潛在靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)條件篩選出關(guān)鍵靶標(biāo)232個，根據(jù)Degree值圖1僅顯示前100個靶點(diǎn)，圖中節(jié)點(diǎn)的大小與Degree值成正比關(guān)系，其中核心組合化學(xué)成分直接作用節(jié)點(diǎn)55個，疾病靶點(diǎn)14個。

圖1 六味地黃丸調(diào)節(jié)糖尿病候選靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 The network of LiuweiDihuang candidate targets for diabetes mellitus Red.Putative Drug Target; Yellow. Known Disease Target; Gray. Others

從圖1中可以看出，疾病和藥物雖然無共同靶點(diǎn)，但14個疾病靶點(diǎn)與多個藥物靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)。有研究表明PRKCB基因編碼的蛋白激酶C-β通過PKC信號通路在糖尿病及其并發(fā)癥中起著重要的作用[23]，動物實驗發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C-β缺陷小鼠可以避免高血糖引起的腎功能障礙、氧化應(yīng)激及微量白蛋白尿的損害[24]，使用蛋白激酶C-β抑制劑，可以改變糖尿病患者的血流動力學(xué)，減少細(xì)胞外基質(zhì)積聚、降低腎小球濾過率及微量白蛋白尿，預(yù)防高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，改善糖尿病大鼠高血糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，LVH和舒張功能障礙[25]，推測六味地黃丸可通過抑制蛋白激酶C活性治療糖尿病。α-葡萄糖苷酶(GAA)等酶通過參與調(diào)控糖代謝環(huán)節(jié)引發(fā)糖代謝異常，是引發(fā)糖尿病的主要病理因素之一，臨床常使用α-葡萄糖苷酶抑制劑抑制α-葡萄糖苷酶活性，降低糖尿病患者體內(nèi)血糖水平，治療糖尿病[26]。血小板源生長因子受體(PDGFR)在糖尿病足創(chuàng)面愈合方面起著重要作用，國內(nèi)有學(xué)者對糖尿病患者和正?；颊咂つw進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者皮膚潰瘍組織PDGFR-α和PDGFR-β與正?；颊呦啾缺磉_(dá)顯著下降[27]。藥物靶標(biāo)中有葡萄糖激酶(GCK)，葡萄糖激酶參與糖代謝的各個途徑，是糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，能夠通過增加胰島素的釋放和促進(jìn)肝臟葡萄糖的利用來降低血糖，對維持血糖穩(wěn)態(tài)起重要作用[28-29]，推測六味地黃丸可能通過促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌葡萄糖激酶達(dá)到治療糖尿病的效果。六味地黃丸還作用于PLCD1、PLD1、PLD2、PLA2G2D等藥物靶標(biāo)，與糖尿病腎病相關(guān)的一個很重要的機(jī)理是蛋白激酶的活化，蛋白激酶活化會導(dǎo)致磷脂代謝紊亂，蛋白激酶通路的活化將引起磷脂酶A2活性升高，磷脂酶A2是體內(nèi)重要的磷脂酶，催化磷脂裂解產(chǎn)生游離得花生四烯酸。所以糖尿病腎病體內(nèi)的磷脂水平和病理直接相關(guān)[30]，磷脂酶D也可通過激活蛋白激酶C在糖尿病及其并發(fā)癥起作用[31]，推測六味地黃丸對糖尿病及其并發(fā)癥引起的磷脂代謝紊亂具有一定的調(diào)節(jié)改善作用。

2.2.2 基因功能分析

通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫的基因和功能分析，六味地黃丸藥物靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)基因功能分析結(jié)果顯示有ATP結(jié)合、線粒體等與能量代謝有關(guān)的條目，推測糖尿病可能與能量代謝有關(guān)聯(lián)。查閱文獻(xiàn)得知糖尿病常常伴隨著能量代謝紊亂，糖尿病大鼠與正常大鼠相比ATP合成顯著下降，Na+-K-ATP酶活性顯著降低[32]。黃連素通過抑制線粒體的功能，激活A(yù)MPK信號通路來改善胰島素抵抗[33]。此外，六味地黃丸還與蛋白激酶活性有關(guān)，進(jìn)一步證明六味地黃丸可通過抑制蛋白激酶C活性治療糖尿病。基因功能分析結(jié)果顯示還具有谷氨酸受體信號通路、谷氨酸結(jié)合等氨基酸相關(guān)的多個條目(見表3)。

表3 六味地黃丸治療糖尿病關(guān)鍵靶標(biāo)基因功能信息Tab.3 The target functional information of LiuweiDihuang Pills on the diabetes mellitus

2.2.3 通路富集分析

通過整合藥理學(xué)平臺進(jìn)行靶標(biāo)通路富集分析，關(guān)鍵通路根據(jù)P-Value值僅顯示前30條通路，靶標(biāo)通路富集分析結(jié)果顯示主要集中丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、VEGF信號通路、Ras信號通路、鈣信號通路、TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)等信號通路以及乙型肝炎等疾病相關(guān)通路(表4)。

2.3 中藥方劑治療疾病“核心成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-主要通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

圖2可看出相關(guān)通路主要有丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝等多個氨基酸代謝通路以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)，Ras信號通路(Ras signaling pathway)，鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(Calcium signaling pathway)等多種信號通路。氨基酸可通過三羧酸循環(huán)參與糖脂代謝，影響著Ⅱ型糖尿病的發(fā)生發(fā)展，有研究證明Ⅱ型糖尿病大鼠會發(fā)生嚴(yán)重的氨基酸代謝紊亂，丙氨酸、谷氨酰胺和精氨酸水平下降，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，降低胰島素敏感性[34]。有研究表明通過調(diào)節(jié)Ras信號通路阻斷VEGF介導(dǎo)的糖尿病腎病可以顯著降低動物模型的腎小球超濾和白蛋白尿[35]。這些通路相關(guān)的核心靶標(biāo)60個，與71個六味地黃丸化學(xué)成分相關(guān)聯(lián)，方中各藥在治療糖尿病中均發(fā)揮了重要作用。

表4 六味地黃丸治療糖尿病關(guān)鍵靶標(biāo)通路信息Tab.4 The target pathway information of LiuweiDihuang Pills on the diabetes mellitus

圖2 中藥方劑治療疾病”核心成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-主要通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.2 The “compound-target-pathway” network of LiuweiDihuang Pills. Green.Triditional Chinese medicine; Purple.Compound; Blue. Target;Red.Pathway

3 結(jié)論

由于中藥復(fù)方具有成分復(fù)雜，配伍靈活，作用于多靶點(diǎn)，能夠干預(yù)多條信號通路的特性，因此難以全面描述其與人體的作用規(guī)律，這也成為制約當(dāng)前中藥發(fā)展的瓶頸問題。中藥整合藥理學(xué)計算平臺以中醫(yī)藥大數(shù)據(jù)(中藥方劑數(shù)據(jù)庫、中藥材數(shù)據(jù)庫、中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫、疾病癥狀靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫)為支撐，以人工智能、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)科學(xué)等為手段，構(gòu)建滿足個體需求的自助式服務(wù)平臺。通過建立“中藥方劑-化學(xué)成分-作用靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)”多維度關(guān)聯(lián)的有效工具，有效揭示了中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其分子機(jī)制，為中藥及中藥復(fù)方的研究提供更多的參考。本研究借助中藥整合藥理學(xué)計算平臺，分析六味地黃丸治療糖尿病的作用物質(zhì)基礎(chǔ)及其分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)多種成分的靶點(diǎn)如PRKCB、GAA、GCK等與糖尿病相關(guān)聯(lián)，推測其可能通過調(diào)節(jié)丙氨酸、谷氨酸代謝等氨基酸代謝、能量代謝及糖脂代謝等多種代謝紊亂治療糖尿病。

六味地黃丸治療糖尿病已經(jīng)取得了很好的療效，對其分子機(jī)制及發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究可以為六味地黃丸及其所含中藥成分的進(jìn)一步研究提供依據(jù)，也可以為糖尿病的臨床治療提供借鑒與參考。本研究是基于整合藥理學(xué)平臺的預(yù)測，具體機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)還需通過實驗加以驗證，相信本研究能夠為六味地黃丸的進(jìn)一步研究及糖尿病的治療工作的開展提供一些有益的參考。