補氣藥人參、黃芪防治心腦疾病的網(wǎng)絡藥理學研究

周榮榮，李志勇，郭非非，許海玉，唐仕歡

(1.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700；2.山西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院,山西 晉中 030600；3.中央民族大學藥學院，北京 100081)

人參(Ginseng)為五加科植物人參的干燥根和根莖，性甘、微溫；味微苦；歸脾、肺、心、腎經(jīng)；黃芪(Astragalus)為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根,古稱“黃耆”，性甘、微溫；歸肺、脾經(jīng)。人參、黃芪均是《神農(nóng)本草經(jīng)》的上品藥材，《神農(nóng)本草經(jīng)》言人參:“味甘微寒。主補五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智”；言黃芪：“味甘，微溫。主治癰疽，久敗瘡排膿止痛，大風癩疾，五痔，鼠瘺，補虛，小兒百病”。對比《神農(nóng)本草經(jīng)》中人參和黃芪的性味功效，發(fā)現(xiàn)兩者在功效主治上明顯不同，人參主補五臟、安神止驚等內(nèi)科疾?。稽S芪主治癰疽瘡癰等外科疾病。漢末張仲景著作《傷寒雜病論》中沒有人參和黃芪同時使用的描述，統(tǒng)計《傷寒論雜病論》含人參的方劑共42首，涉及的疾病20余種；而關于含黃芪的方劑有7首，主要涉及“痙濕暍病”、“血痹虛勞病”、“水氣病”3種內(nèi)傷雜病，結(jié)果顯示兩者的主治疾病差異明顯。后世醫(yī)家則認為人參、黃芪均味甘，具有均有補中益氣，自東晉·葛洪的《肘后備急方》以后，便開始有人參、黃芪共用的記載[1]，常將兩者作藥對相須為用，以補氣助陽，隨之出現(xiàn)了保元湯、補中益氣湯、歸脾湯等經(jīng)典方劑。從人參、黃芪的功效特點進行分析，兩者同為補益藥，卻同中有異，人參的功效偏補五臟，安神志；黃芪的功效偏固表升提。

人參、黃芪補氣作用顯著，中醫(yī)認為，人是由氣血組成，氣能生血、行血、攝血，《靈樞·邪客篇》：“營氣者，泌其津液、注之于脈、化以為血”。氣虛無力助心行血，而導致血虛，日久發(fā)生血瘀、出血，元氣大虧甚至會氣血匱竭[2]。心主血脈，主藏神，氣血運行不暢、心氣不足導致心脈無力鼓動氣血，最終導致氣虛血瘀、心神失養(yǎng)。中醫(yī)認為心腦疾病與中風、胸痹、心痛、眩暈等多種疾病有關，“氣虛血瘀”是心腦疾病的基本病因病機，高血壓、動脈粥樣硬化、高血脂等是心腦疾病的主要發(fā)病因素[3]。研究表明人參、黃芪均在高血壓、冠心病、缺血性腦卒中等多種心腦疾病方面療效顯著[4-5]。

中藥整合藥理學平臺[6]整合中醫(yī)藥、系統(tǒng)生物學、藥物化學等數(shù)據(jù)資源，結(jié)合數(shù)據(jù)挖掘、等方法，建立的“中藥-成分-靶標-疾病”多維分析平臺，可有效的從分子水平揭示中藥藥效物質(zhì)與疾病作用關系。為了從分子層面解析補氣代表中藥人參、黃芪功效的異同點，同時分析兩者應用于心腦疾病的作用機制，本研究采用中藥整合藥理學平臺V1.0(http：//www.tcmip.cn)，探究補氣藥人參、黃芪在治療以中風、冠心病為主的心腦疾病的活性成分及其可能的分子作用機制。

1 數(shù)據(jù)和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

整合藥理學平臺V1.0包括中藥方劑數(shù)據(jù)庫、中藥材數(shù)據(jù)庫、中藥成分數(shù)據(jù)庫及疾病/癥狀靶標數(shù)據(jù)庫。整合藥理學平臺詳細收錄了400多中藥材的基本信息(中文名稱、拉丁名、性味歸經(jīng)等)及其化學成分信息(成分名稱、中英文名稱、分子式等)，并從Drugbank、OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)、HPO(human phenotype ontology)、TTD(Therapeutic Target Database)、KEGG(Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes)等數(shù)據(jù)庫中整合疾病基因、藥物靶標基因及相關生物信息等資源。

1.2 研究步驟

1.2.1 信息設定

登陸中藥整合藥理學平臺，新建“人參”、“黃芪”、“人參與黃芪”3項任務，按照“人參”、“黃芪”、“人參、黃芪”分別添加保存；由于平臺檢索詞限制，以“中風”、“冠心病”、“心血管疾病”相關的英文名稱“Stroke”、“Coronary”、“Cardiovascular”、“Cerebrovascular”作為關鍵詞進行檢索，將目標檢索結(jié)果篩選后保存。

1.2.2 設定相似性

分數(shù)設定相似性分數(shù)為0.8，用以篩選藥物潛在靶標。結(jié)構類似的生物分子化合物具有類似的物化性質(zhì)和生物活性[7]，相似性分數(shù)(卡值)越高,候選化合物相似的藥物相對越少。整合藥理學平臺采用化合物二維結(jié)構相似性搜索，通過與FDA(Food and Drug Administration，美國食品和藥物管理局)上市藥物進行Tanimoto系數(shù)計算相似性分值。

1.2.3 一站式計算

信息設定與相似性分數(shù)設置完成后，點擊“確認”，進行“靶標預測、共性靶標分析、網(wǎng)絡構建、核心靶標(Core targets)的篩選、可視化等”一站式分析。

1.2.4 拓撲特征值

中藥整合藥理學平臺基于蛋白-蛋白相互作用建立藥物靶標和疾病靶標關系，選取滿足3種拓撲結(jié)構特征值“連接度(degree)”、“介度(betweenness)”、“緊密度(closeness)”的節(jié)點，作為中藥方劑矯正疾病失衡網(wǎng)絡的候選靶標。

2 結(jié)果和分析

2.1 人參和黃芪所含化學成分和藥物間共同靶標分析

通過整合藥理學平臺收集到關于心腦疾病的相關靶標信息有212條；收集人參、黃芪化學成分187個，顯示人參共158個化學成分，主要為人參皂苷類、人參多糖類、氨基酸、生物堿、黃酮、甾醇等多種化學成分；黃芪29個化學成分，主要是黃芪皂苷類、黃芪多糖類、氨基酸類等；人參和黃芪的共性靶標顯示160個。對人參、黃芪的化學成分進行結(jié)構靶標預測，相似性分數(shù)為0.8時，黃芪的預測靶標數(shù)是230個，人參的預測靶標數(shù)是2 000個。

2.2 人參-黃芪預測靶標分析及核心靶標(Core targets)分析

2.2.1 人參-黃芪藥物預測靶標GO(Gene Ontology)富集分析、KEGG通路富集分析

對人參-黃芪的預測靶標進行GO(Gene Ontology)富集分析、KEGG通路富集分析，本機自動保留具有統(tǒng)計學意義(P-value<0.01)的條目，得到208條GO(Gene Ontology)富集分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)人參-黃芪的預測靶標與mitochondrial electron transport(線粒體電子傳遞)、NADH to ubiquinone(NADH泛醌)、NAD binding(NAD結(jié)合)、cytosol(細胞質(zhì))、mitochondrion(線粒體)、mitochondrial matrix(線粒體基質(zhì))、oxidation-reduction process(氧化還原過程)、GTPase activity(GTP酶活性)、extracellular exosome(胞外體)、biotin metabolic process(生物素代謝過程)、pyruvate metabolic process(丙酮酸的代謝過程)、tricarboxylic acid cycle(檸檬酸循環(huán))、cardiac muscle cell apoptotic process(心肌細胞凋亡過程)等生物功能信息有關；74條KEGG通路富集分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)人參、黃芪的預測靶標與Carbohydrate metabolism(碳水化合物代謝)、Parkinson's disease(帕金森氏病)、Citrate cycle(TCA cycle)(檸檬酸循環(huán))、Propanoate metabolism(丙酸代謝)、Purine metabolism(嘌呤代謝)、Alzheimer's disease(阿爾茨海默病)、Huntington's disease(亨廷頓病)、Oxidative phosphorylation(氧化磷酸化)等生物通路有關。

2.2.2 人參-黃芪“藥物-靶標-疾病”網(wǎng)絡的核心節(jié)點(Hub)分析

平臺以“節(jié)點連接度(degree)”的2倍中位數(shù)為卡值選取Hub節(jié)點，并對核心節(jié)點(靶標)進行GO(Gene Ontology)富集分析、KEGG通路富集分析。結(jié)果得到1 598個核心節(jié)點，2 523條GO(Gene Ontology)富集分析結(jié)果和206條KEGG通路富集分析結(jié)果。

2.2.3 核心靶標分析

表1 人參、黃芪抗心腦疾病核心靶標表(Degree值排名前10位)Tab.1 The Core target of Ginseng and Astragalusagainst cardio-cerebral diseases

平臺設定同時滿足大于節(jié)點“連接度(degree)”、“介度(betweenness)”、“緊密度(closeness)”的中位數(shù)為卡值，選取關鍵核心靶標，并進行核心靶標的GO(Gene Ontology)富集分析、KEGG通路富集分析，建立核心靶標網(wǎng)絡圖和“中藥-成分-關鍵藥靶-通路”網(wǎng)絡圖。結(jié)果得到463條核心靶標信息，其中Common Target(共同靶標)62條、Putative Drug Target(潛在藥物靶標)131條、Known Disease Target(已知疾病靶標)25條。如表1；

2.2.4 可視化分析

核心靶標可視化圖是按照degree值由大到小排列取其前100位進行繪制的。核心靶標網(wǎng)絡圖(圖1)顯示HADHA,HADH,NSDHL等33個共同靶標(綠色)；CROT,GCK,HSD17B10等46個潛在藥物靶標(橘紅色)；MAPK3,POMC,DLG4,GCGR,P2RY12,GLP1R等6個已知靶標(黃色)，若干其它靶標(灰色)。人參-黃芪“中藥-成分-關鍵藥靶-通路”網(wǎng)絡可視化圖(見圖2)是按照核心靶標KEGG通路中P-Value值由小到大排列，取其前30位進行繪制的。

2.2.5 關鍵靶標GO(Gene Ontology)富集分析和KEGG通路富集分析

平臺對人參-黃芪干預心腦血管疾病的關鍵靶標分析，得到1759條GO(Gene Ontology)富集分析結(jié)果和188條KEGG通路富集分析結(jié)果。GO富集分析顯示人參和黃芪通過參與cytosol(細胞質(zhì))、mitochondrion(線粒體)、ATP binding(ATP結(jié)合)mitochondrial matrix(線粒體基質(zhì))、mitochondrial inner membrane(線粒體內(nèi)膜)等基因本體表達生物功能，如表2所示；KEGG通路分析預測人參和黃芪在關于Purine metabolism(嘌呤代謝)、Carbon metabolism(碳代謝)、Endocrine system(內(nèi)分泌系統(tǒng))Carbohydrate metabolism(碳水化合物代謝)、Nucleotide metabolism(核苷酸代謝)、Pyruvate metabolism(丙酮酸代謝)、Neurodegenerative diseases(神經(jīng)退化性疾病)、Huntington's disease(亨廷頓病)、Parkinson's disease(帕金森氏病)等主要疾病靶標通路，如表3所示。

圖1 核心靶點網(wǎng)絡Fig.1 The key target network

綠色-中藥；紫色-成分；藍色-關鍵靶標；紅色-通路圖2 人參、黃芪“中藥-成分-關鍵藥靶-通路”網(wǎng)絡Fig.2 The "Traditional Chinese Medicine-ingredient-key drug target-pathway" network of Ginseng and Astragalus

IDTerm(條目)條目(中文)數(shù)目(counts)P-ValueGO:0005829cytosol細胞質(zhì)2368.44e-63GO:0005739mitochondrion線粒體1255.2e-45GO:0005524ATP bindingATP結(jié)合1232.28e-35GO:0005759mitochondrial matrix線粒體基質(zhì)541.23e-29GO:0005743mitochondrial inner membrane線粒體內(nèi)膜593.63e-28GO:0043209myelin sheath髓鞘372.62e-27GO:0004672protein kinase activity蛋白激酶活性372.46e-22GO:0070062extracellular exosome胞外體1483.16e-22GO:0051287NAD bindingNAD結(jié)合193.14e-21GO:0019899enzyme binding酶結(jié)合421.57e-19

表3 人參、黃芪抗心腦疾病主要通路表(P-Value排名前十位)Tab.3 The main pathways of Ginseng and Astragalus membranaceus against cardio-cerebral diseases

3 討論

人參、黃芪的主要成分多是小分子活性物質(zhì)，人參皂苷類、多糖類、黃芪甲苷類等主要是能源物質(zhì)和碳源物質(zhì)，參與供能、供氧以及蛋白質(zhì)、糖類、脂肪代謝等生物過程。人參皂苷、黃芪甲苷類均與ATP1A1有密切關系，人參皂苷類[8]、黃芪甲苷類[9]均具有保護心肌損傷、調(diào)節(jié)免疫、保護腦細胞、抗炎等作用，ATP1A1[10]是Na+/K+ATP酶的亞單位，研究表明通過調(diào)節(jié)Na+/K+ATP酶可以延長缺血性腦卒中的治療窗口[11]，減少心肌纖維化[12]。人參與黃芪治療心腦疾病存在百余種共同靶標，其中HADHA、HADH、NSDHL、CROT、GCK、ADH1C、ENPP1、HSD17B10等具有較高的拓撲特征值，這些靶標都是參與線粒體活動、脂質(zhì)代謝、氧化反應等過程的重要基因，線粒體[13]是負責能量產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化、傳遞以及氧化代謝過程重要的細胞器，心臟具有高容量的線粒體系統(tǒng)，線粒體會產(chǎn)生和消耗大量的能量(ATP)支持心肌功能，參與心臟肥大、心臟衰竭等病理過程。HADHA(hydroxyacyl-CoA dehydrogenas)是拓撲特征值最高的靶標(Degree值為135，Closeness值為0.55，Betweenness值為7.71)，它是線粒體三功能蛋白(mitochondrial trifunctional protein，MTP)的一個亞基，研究表明HADHA參與腦星形膠質(zhì)細胞的線粒體脂肪酸βCPT1氧化過程[14]。HADH(hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)存在于肝、心、腎、腦等大部分組織中，參與線粒體脂肪酸氧化與能量轉(zhuǎn)化，與低血糖腦病、高胰島素低血糖、周圍神經(jīng)病變等有密切關系[15]。NSDHL基因則是參與神經(jīng)元膽固醇、類固醇激素和脂類的合成過程，與心血管系統(tǒng)形態(tài)異常、腦畸形等疾病、再生障礙性貧血等疾病有關[16]。CROT(Carnitine O-Octanoyl transferase)是參與在脂質(zhì)代謝和脂肪酸β-氧化的重要基因，心肌脂肪酸β氧化也是維持心臟能量平衡和收縮功能的關鍵[17]。GCK(Glucokinase，葡萄糖激酶)廣泛存在于腦、心臟、腎臟、脂肪等組織，是胰島β細胞或肝細胞糖代謝(葡萄糖磷酸化)的一個重要因素，參與促胰島素分泌、降低血糖等過程[18]；ADH1C(Alcohol dehydrogenase 1C，乙醇脫氫酶1C)是主要存在消化道和肝臟中的酒精代謝酶,參與氧化還原酶、乙醇脫氫酶(NAD)、視黃酸等的生物過程，研究表明其與酗酒、神經(jīng)退行性疾病帕金森病、房顫等疾病有關[19]。

人參與黃芪屬于不同科屬，藥性、成分、功效、藥理作用等各有不同，在同一疾病、同一靶標等作用程度也不同。《金匱要略·中風歷節(jié)病脈證并治第五》言：“緩則為虛，營緩則為亡血，衛(wèi)緩則為中風……”，人參善補五臟之氣，補氣兼能養(yǎng)陰生津(營分)，溫養(yǎng)心氣且補氣作用迅速；黃芪善走衛(wèi)分，補氣兼能扶陽利水[20]，人參、黃芪從《傷寒雜病論》中各司其職，到后世醫(yī)家將其相須為用，體現(xiàn)了中醫(yī)對藥物“認識—實踐—再認識”的發(fā)展過程。利用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)分析工具(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)預測人參和黃芪的不同生物過程，人參參與糖酵解、檸檬酸循環(huán)、脂肪酸降解、組氨酸降解、賴氨酸合成、PPAR信號途徑等生物過程，主要治療疼痛、高血壓、冠心病、心力衰竭、神經(jīng)性疾病等疾?。稽S芪參與苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等生物合成、代謝過程，除了治療心腦疾病外，黃芪也具有治療呼吸系統(tǒng)疾病、性功能障礙等疾病的作用?！秱摗诽?、少陰、厥陰病描述皆有身痛癥，分析發(fā)現(xiàn)人參的疾病靶標富集結(jié)果中多次出現(xiàn)“疼痛”的信息，研究表明[21]人參皂苷類具有誘導鎮(zhèn)痛的作用。

通過網(wǎng)絡藥理學分析表明，人參、黃芪補氣作用與線粒體代謝、氧化代謝、抗炎免疫有關，人參與黃芪在參與心腦疾病過程中，主要通過線粒體相關代謝通路，調(diào)節(jié)HADHA、HADH、NSDHL、ADH1A、ADH1C、ALDH3A2等關鍵靶標發(fā)揮氧化、產(chǎn)能等發(fā)揮共同作用，CROT、GCK、ENPP1等潛在藥物靶標雖然不是心腦疾病的上游基因，卻是心腦疾病主要致病因素及其并發(fā)癥的重要活動因子，推測人參、黃芪補氣作用與調(diào)控線粒體氧化供能有關，這些靶標可能為明確心腦疾病的直接致病原因提供佐證,也為闡釋心腦疾病及其并發(fā)癥發(fā)病機制提供重要的參考價值。