四川南充地區(qū)1 056例地中海貧血初篩陽性樣本的基因診斷結(jié)果分析

杜利君，邢晏，蔣興亮，張兵，李欣， 楊杉，趙佳，何玉霞

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院·南充市中心醫(yī)院檢驗科；2.西華師范大學(xué)數(shù)學(xué)與信息學(xué)院；3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，四川 南充 637000)

地中海貧血(thalassemia，地貧)，是由于基因缺陷引起珠蛋白合成缺乏或不足而導(dǎo)致的一種慢性溶血性貧血，屬于常染色體不完全顯性遺傳性疾病，以α、β-地貧最多見。不同地區(qū)、不同種族人群地貧基因的發(fā)生頻率、基因類型和分布特征具有明顯的差異，主要在地中海的中部、東部、東南亞地區(qū)流行，中國大陸主要分布在廣東、廣西、海南以及周邊省份，如湖南、福建、四川、云南、貴州等地區(qū)[1]。地貧輕型可無臨床表現(xiàn)，但重型可致殘、致死，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。因此，了解本地區(qū)人群的地貧基因突變類型和分布特征是預(yù)防及避免重型地貧患兒出生的工作重點(diǎn)。目前，各地關(guān)于地貧的基因類型和分布情況均有研究和分析，但四川南充地區(qū)地貧相關(guān)報道較少，故現(xiàn)對2015年7月至2017年7月在南充市中心醫(yī)院檢測的1 056例地中海貧血基因診斷結(jié)果進(jìn)行分析，以了解南充地區(qū)人群中α、β-地中海貧血的基因類型和分布情況，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2015年7月至2017年7月在本院進(jìn)行地中海貧血基因檢測的人員，患者的住址為南充地區(qū)覆蓋的三區(qū)、六縣，排除其它市區(qū)就診人員；且受檢者紅細(xì)胞平均體積(MCV)<80 fl和(或)紅細(xì)胞平均血紅蛋白(MCH)<27 pg，且已排除缺鐵性貧血的高度可疑地貧人群。其中，男性369例，女性687例；年齡1 d～81歲，平均年齡(22±16)歲；按年齡分為兒童組(0～17歲)324例，青中年組(18～50歲)648例，老年組(>50歲)84例。

1.2 主要儀器和試劑

Life Express Thermal Cycler PCR儀由杭州生物科技有限責(zé)任公司提供，HB-2012A核酸分子雜交儀，α、β地中海貧血基因檢測試劑盒(PCR+導(dǎo)流雜交法)由廣東凱普生物科技股份有限公司提供，檢測人抗凝靜脈血樣本中3種缺失型α-地貧(--SEA、-α3.7和-α4.2)、3種突變型α-地貧(CS、QS、WS)及β-地貧的17種突變位點(diǎn)CD17(A→T)、CD41-42(-TCTT)、IVS-II-654(C→T)、-28(A→G)、-29(A→G)、CD43(G→T)、CD14-15(+G)、CD71-72(+A)、CD27-28(+C)、CD31(-C)、IVSI-1(G→A/T)、IVSI-5(G→C)、βE3(G→A)、CAP(A→C或-AAAC)、Int(T→G)、-30(T→C)、-32(C→A)。

1.3 檢測方法

1.3.1 DNA分離提取 采用凱普血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，嚴(yán)格按照說明書提取樣本DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 將α、β PCR mix與Taq酶按要求混勻后，取45 μL分裝到0.2 mL PCR管中；向已分裝反應(yīng)液的PCR管中加入5 μL DNA模板，瞬時離心后，上機(jī)擴(kuò)增。

1.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的導(dǎo)流雜交 嚴(yán)格按照凱普的雜交試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.3.4 結(jié)果判斷 根據(jù)試劑盒提供的地貧基因檢測結(jié)果分析圖比較分析判斷結(jié)果。

1.3.5 質(zhì)量控制方案 地貧基因反向斑點(diǎn)雜交膜條可同時檢測3種α地貧缺失型基因(SEA、3.7、4.2)、3種突變型基因(CS、QS、WS)及17種常見β地貧突變型基因。(1)室內(nèi)質(zhì)控：雜交膜上有3個α和6個β正常對照點(diǎn)，每次實驗所有正常對照點(diǎn)均應(yīng)顯色，突變純合子及缺失純合子除外，否則需重新提取DNA、PCR擴(kuò)增、雜交。同時，為排除實驗過程出現(xiàn)污染，防止假陽性結(jié)果出現(xiàn)，使用蒸餾水作陰性質(zhì)控，全程參與提取、擴(kuò)增、雜交，陰性質(zhì)控結(jié)果無任何雜交點(diǎn)，視為實驗過程無污染。此外，將已知地貧型別的陽性標(biāo)本按照檢測樣本量分裝保存于-70 ℃，實驗時與檢測標(biāo)本同步處理，全程參與提取、擴(kuò)增、雜交，得到已知的地貧型別，視為該批地貧結(jié)果在控、可靠。(2)室間質(zhì)評：本實驗室每年參加了衛(wèi)生部組織的地中海貧血基因分型檢測的室間質(zhì)評，成績均為100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，檢出率比較用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四川南充地區(qū)人群的地貧基因診斷結(jié)果

經(jīng)多聚酶鏈擴(kuò)增(GAP-PCR)技術(shù)和DNA芯片反向斑點(diǎn)雜交檢測技術(shù)，在1 056例地中海貧血基因檢測樣本中，共檢出α、β-地貧330例，檢出率為31.3%。其中，α-地貧168例(15.9%)，β-地貧161例(15.3%)，αβ復(fù)合突變1例(0.1%)。

2.1.1 α地貧基因類型及構(gòu)成比 在330例確診地貧樣本中α-地貧168例，構(gòu)成比為50.9%，包含6種亞型：--SEA/αα、-α4.2/αα、-α3.7/αα、-ααCS/αα、-ααQS/αα、--SEA/-a3.7。其中以--SEA/αα(72.6%)、-α3.7/αα(17.9%)為主，占α-地貧的90.5%。α-地貧的基因診斷結(jié)果及臨床分型的詳細(xì)情況(表1)。

2.1.2 β地貧基因類型及構(gòu)成比 在330例地貧確診樣本中檢出β-地貧161例，構(gòu)成比為48.8%，有以下6種類型：CD17、CD41-42、-28、-29、IVS-II 654、CD41-42/-29，其中最常見的3種突變類型為：CD17(50.3%)、CD41-42(31.1%)及IVS-II 654(14.3%)，占β-地貧的95.7%。β-地貧基因型及構(gòu)成比詳細(xì)情況(表2)。

2.1.3 α復(fù)合β地貧基因類型 330例地貧患者中有1例α復(fù)合β-地貧，所占比例為0.3%，基因型為-α3.7/αα復(fù)合βIVS-II-654M，臨床表現(xiàn)為輕型。

表1 168例患者α-地貧基因型及構(gòu)成比

表2 161例患者β-地貧基因型及構(gòu)成比

2.2 患者地貧基因診斷結(jié)果比較

1 056例受檢者中，男性369例，檢出地貧90例(24.4%)，女性687例，檢出地貧240例(34.9%)，女性地貧基因檢出率明顯高于男性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.423，P=0.001)；男性檢出α-地貧48例(13.0%)，女性檢出α-地貧120例(17.5%)，男女α-地貧檢出率無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=3.568，P=0.059)；男性β-地貧檢出42例(11.4%)，明顯低于女性119例(17.3%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.554，P=0.010)。男女α、β-地貧基因診斷情況(表3)。

2.3 各年齡組地貧基因診斷結(jié)果比較

1 056例樣本中，兒童組(0～17歲)324例，檢出地貧93例(28.7%)；青中年組(18～50歲)648例，檢出地貧213例(32.8%)；老年組(>50歲)84例，檢出地貧24例(28.6%)。各年齡組地貧基因檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.050，P=0.359)(表4)。

表3 患者α、β-地貧基因診斷結(jié)果

表4 各年齡組α、β-地貧基因診斷結(jié)果

3 討論

地中海貧血是我國南方地區(qū)最常見的遺傳性疾病之一，臨床以α和β地中海貧血較為常見。根據(jù)其基因型及臨床癥狀分為輕型、中間型和重型[1]。目前，中重癥地中海貧血的治療較困難，主要有輸血、造血干細(xì)胞移植和基因治療等方式，給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。地貧雖然難治但可以預(yù)防，因此，了解本地區(qū)人群的地貧基因突變類型和分布特征率是預(yù)防及避免中重型地貧患兒出生的工作重點(diǎn)，對地貧的防治具有重要意義。

在本研究納入的1 056例地貧基因受檢者中，攜帶者330例，檢出率為31.3%，明顯高于成都[2]、遂寧[3]、瀘州[4]等四川其它地區(qū)，可能與研究納入的對象和數(shù)量有一定的關(guān)系。本研究納入的1 056例受檢者，其紅細(xì)胞平均體積(MCV)<80 fl和(或)紅細(xì)胞平均血紅蛋白(MCH)<27 pg，且已排除缺鐵性貧血的高度可疑地貧人群，因此可能增加了本地區(qū)的地貧檢出率，提示南充地區(qū)可能屬于地貧高發(fā)地區(qū)之一，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)地中海貧血的篩查和基因診斷。在330例地貧患者中，α地貧患者168例(15.9%)，以--SEA/αα(72.6%)、-α3.7/αα(17.9%)為主，占α-地貧的90.5%。其α地貧基因型分布與廣東、廣西、湖南、四川、重慶等地區(qū)人群基本一致[5-7]。另外β地貧檢出161例(15.3%)，以CD17(50.3%)、CD41-42(31.1%)及IVS-II 654(14.3%)，為主，占β地貧的95.7% ，與重慶、四川地區(qū)的β地貧主要基因突變類型一致[7-8]。但廣東、廣西地區(qū)的β地貧以CD41-42(-TCTT)為主[5,9]，提示不同地域、不同人群的β地貧基因突變類型存在差異。此外，本研究還檢出αβ復(fù)合地中海貧血1例(0.1%)。研究表明，αβ復(fù)合突變的患者臨床癥狀有所減輕，但若其與α地貧或β地貧婚配，均有可能生育中型和重型地貧患兒[10]。因此，若夫妻中任意一方為αβ復(fù)合突變時，另一方需檢測α和β地貧基因，以減少或避免生育中型和重型地貧患兒。此外，該檢測方法尚存在一定的局限性，實驗中檢測的3個a缺失、3個a突變以及17個b突變位點(diǎn)，為臨床最常見地貧類型，覆蓋95%以上地貧類型，但地貧基因的突變類型較多，無法完全覆蓋，可能存在少見地貧類型的漏檢。

在受檢人群中，女性的地貧檢出率為34.9%，明顯高于男性地貧檢出率為24.4%，與自貢[11]、黔東南州[12]等地區(qū)研究基本一致，但與重慶[13]地區(qū)男、女地貧檢出率存在差異。地貧以預(yù)防為主，尤其是對育齡夫婦的預(yù)防顯得尤為重要。本研究納入的育齡女性占有較大比例，若育齡夫妻中的女方是地貧攜帶者，部分男性若血液學(xué)指標(biāo)MCV>80 fl和MCH>27 pg，則未進(jìn)行地貧基因的檢測，有可能存在漏檢的情況；亦有部分夫妻，即便女方為地貧攜帶者，而男方由于各種原因未接受地貧的相關(guān)檢查，此外，隨著二胎政策的出臺以及臨床醫(yī)護(hù)人員不斷加大地貧知識地宣傳力度，孕婦增加了安全意識及對地貧的重視程度，進(jìn)行地貧基因檢測的孕婦也相應(yīng)增多。以上均是造成女性檢出率高于男性檢出率的重要因素。同時，亦不能排除因為樣本含量較小造成的性別差異。雖然各年齡組的地貧基因檢出率未發(fā)現(xiàn)差異，但由于二胎政策的開放，青中年為生育年齡的集中段，所以加大對青中年人群，尤其是育齡夫婦的地貧篩查和基因診斷力度，對提高人口素質(zhì)具有重要作用。

綜上，南充地區(qū)是地中海貧血高發(fā)地區(qū)之一，α地貧以--SEA/αα缺失最常見，β地貧以CD17最常見，CD41-42次之，具有明顯的地域差異。通過對南充地區(qū)地貧基因突變類型和分布特征的研究，為南充地區(qū)制定地貧防治計劃、開展臨床咨詢、干預(yù)出生缺陷以及臨床診療提供參考依據(jù)。